Účinky statinů na angiogenezi a vaskulogenezi | Revista Española de Cardiología

ÚVOD

Statiny inhibují aktivitu 3-hydroxy-3-methylglutaryl koenzym A (HMG-CoA) reduktázy, enzymu, který katalyzuje syntézu mevalonátu, limitující krok biosyntézy cholesterolu.1 Výsledné snížení intracelulárního cholesterolu vede ke kompenzačnímu zvýšení vychytávání cholesterolu receptory lipoproteinů o nízké hustotě (LDL) a ke snížení cholesterolu v plazmě. Objev statinů a jejich aplikace u osob s vysokou koncentrací cholesterolu umožnily výrazně zlepšit primární a sekundární prevenci ischemické choroby srdeční.2,3 V poslední době byla účinnost statinů v primární a sekundární prevenci ischemické choroby srdeční pozorována i u osob s nižší hladinou cholesterolu.4-6 Kromě snížení LDL cholesterolu (C-LDL) mají statiny řadu pleiotropních účinků na několik složek aterosklerózy, včetně endoteliální funkce, migrace buněk, zánětu a trombotické tendence plaku.7-12 U normocholesterolemických zvířat bylo prokázáno, že statiny mají ochranný účinek proti ischemicko-reperfuzním lézím srdečního svalu, pravděpodobně prostřednictvím mechanismů souvisejících s produkcí oxidu dusnatého (NO) endotelem.13

Serin/threoninová proteinkináza Akt neboli proteinkináza B (PKB) je multifunkční intracelulární regulátor buněčného přežívání, růstu a metabolismu14 (obr. 1). V souvislosti s kardiovaskulárními funkcemi Akt/PKB působí na intracelulární dráhu stimulovanou vaskulárním endoteliálním růstovým faktorem (VEGF)14,15 a angiopoetinem,16-18 podporuje přežívání buněk a zajišťuje adekvátní vývoj cév.19 Konstitutivní aktivace signalizace Akt chrání kardiomyocyty před apoptózou při ischemicko-reperfuzních lézích.20 Kromě cytoprotektivního účinku působí Akt jako aktivátor produkce NO endotelem v reakci na VEGF a smykový stres díky své schopnosti fosforylovat endoteliální syntázu oxidu dusnatého (eNOS) na serinech 1179 nebo 1177,21,22 čímž řídí vazomotorický tonus.23 Na druhé straně je Akt nezbytný při migraci endoteliálních buněk do ložiska produkujícího VEGF.24 Schopnost Akt zprostředkovat přežití buněk, produkci NO a migraci indukovanou VEGF tedy naznačuje, že proteinkináza Akt může zprostředkovávat odpověď endotelu na angiogenní podněty.

Obr. 1. Vlivem proteinkinázy Akt dochází ke snížení hladiny NO v endotelu. Statiny, signalizace Akt a angiogeneze/vaskulogeneze. Angiopoetin 1 (Ang-1), VEGF a fibroblastový růstový faktor (FGF) po navázání na své membránové receptory vyvolávají přeměnu fosfatidylinositol 4,5-bifosfátu (PIP2) na fosfatidylinositol 3,4,5-trifosfát (PIP3) prostřednictvím fosfatidylinositol 3-kinázy (PI3K). Tvorba PIP3 je nezbytná pro fosforylaci proteinkinázy Akt kinázou PDK-1. Léčba statiny zvyšuje fosforylaci Akt, zatímco wortmanin (inhibitor PI3K) jí zabraňuje. Mevalonát, produkt HMG-CoA reduktázy, rovněž inhibuje PI3K a následnou fosforylaci Akt. Statiny tedy inhibicí HMG-CoA reduktázy a produkce mevalonátu zvyšují fosforylaci Akt a současně fosforylaci a aktivaci endoteliální syntázy oxidu dusnatého (eNOS), syntézu oxidu dusnatého (NO) a řadu fyziologických účinků vyvolaných v angiogenezi a vaskulogenezi. Akt také zabraňuje apoptóze endoteliálních buněk.

Nedávno bylo prokázáno, že statiny také stimulují intracelulární signální dráhu proteinkinázy Akt/PKB25-27 v endoteliálních buňkách25 a endoteliálních progenitorových buňkách (EPC) kostní dřeně,26,27 čímž indukují angiogenezi25 i vaskulogenezi.26 Účinky statinů na kinetiku EPC prokázali u lidí také Vasa a spol.28 . Tento článek podává přehled o vlivu statinů na indukci angiogeneze25 a vaskulogeneze26 prostřednictvím mechanismů souvisejících s aktivací Akt.25-27

ANGIOGENEZE A VASKULOGENEZE

Angiogeneze a vaskulogeneze jsou zodpovědné za vývoj cévního systému v embryu.29-32 Vaskulogeneze je proces tvorby cév z endoteliálních progenitorových buněk (angioblastů), které migrují a fúzují s jinými endoteliálními progenitorovými buňkami a diferencují se v endoteliální buňky při tvorbě nových cév. Naproti tomu angiogeneze je proces rozšiřování cév, které vznikly pučením nových kapilár prostřednictvím migrace a proliferace dříve diferencovaných endoteliálních buněk (obr. 2).

Obr. 2. Angiogeneze je proces rozšiřování cév, které vznikly pučením nových kapilár prostřednictvím migrace a proliferace dříve diferencovaných endoteliálních buněk. Schematické znázornění angiogeneze a vaskulogeneze. (A) Vaskulogeneze je shlukování angioblastů nebo endoteliálních progenitorových buněk za účelem tvorby cév. Angioblasty se sdružují in situ nebo migrují a vytvářejí cévy na vzdálených místech. (B) Angiogeneze je tvorba nových cév z již existujících cév proliferací a migrací diferencovaných endoteliálních buněk. (C) Angiogeneze a vaskulogeneze mohou probíhat také současně. (Převzato z Cleaver et al.29)

Původně se mělo za to, že vaskulogenní proces je omezen na embryonální vývoj, zatímco angiogeneze (která probíhá i v embryu) je jediným procesem podílejícím se na neovaskularizaci u dospělých. Paradigma postnatální neovaskularizace však bylo nedávno přehodnoceno a bylo zjištěno, že endoteliální progenitorové buňky cirkulující v periferní krvi,33 jsou inkorporovány neovaskularizačními ložisky u dospělých zvířat,34 zvyšují svůj počet v reakci na tkáňovou ischemii,35 a po své expanzi in vitro a pozdější transplantaci podporují vývoj kolaterálních cév.36 Tyto studie prokázaly, že za neovaskularizaci u dospělých jedinců je zodpovědná jak angiogeneze, tak vaskulogeneze.

Třetím mechanismem, který pravděpodobně přispívá k rozvoji kolaterálních cév, je zvětšení velikosti a kalibru již existujících arteriálních kolaterálních spojení, což je proces nazývaný arteriogeneze.37 Přítomnost a počet těchto nativních kolaterálních cév se u jednotlivých jedinců a druhů velmi liší. Při uzávěru cévy dochází ke zvýšení rychlosti průtoku krve již existujícími kolaterálními cévami a ke zvýšení luminálního smykového napětí, což jsou faktory, které přispívají ke zrání kolaterálních cév, zejména těch středně velkých.

Metody studia in vitro

Vývoj technik kultivace endoteliálních buněk umožnil pochopit procesy, které se podílejí na angiogenezi.38 Endotelové buňky v kultuře si zachovávají schopnost reagovat na faktory, které stimulují nebo inhibují angiogenezi, a také schopnost tvořit endotelové trubice in vitro. Testy buněčné proliferace umožňují analyzovat účinek určité látky na proliferaci endoteliálních buněk. V Boydenově komůrce lze zkoumat migraci endoteliálních buněk směrem k roztoku obsahujícímu určitou látku, oddělenou propustnou membránou. Mechanismy tvorby endotelových tubulů a účinek určité látky na tubuly lze studovat pomocí dvourozměrných nebo trojrozměrných testů. Pomocí těchto technik se analyzují procesy tvorby endoteliálního lumen a vliv extracelulární matrix na vývoj kapilár.38 V neposlední řadě umožňují kultury endoteliálních buněk studovat molekulární dráhy zapojené do procesů angiogeneze.

Nejnověji se pomocí technik selekce buněk a speciálních kultivačních médií používají techniky vyvinuté ke studiu diferencovaných endoteliálních buněk ke studiu endoteliálních progenitorových buněk.33-36

Metody studia in vivo

Ačkoli techniky in vitro umožňují provést předběžnou analýzu angiogeneze a vaskulogeneze, existuje mnoho faktorů, které mohou tyto procesy ovlivňovat nebo modulovat in vivo.38 Pro studium mechanismů tvorby cév in vivo byly vyvinuty různé biologické systémy, které umožňují kvantifikovat nebo prokázat účinek určité látky: modely myší rohovky, chorioalantoidní membrána kuřecího embrya nebo houbové implantáty.38 Tyto systémy vyžadují obětování zvířete, takže zachycují účinek pouze v určitém okamžiku. Pro studium časového vývoje dějů v jedné tkáni byly vyvinuty techniky intravitální mikroskopie kůže na hřbetě nebo lebky myši.39 A konečně rozvoj technik genového inženýrství umožnil studovat vliv potlačení (knock-out) nebo přidání (knock-in) genu na procesy vaskulogeneze a angiogeneze.

Studium postnatální vaskulogeneze a vlivu určitých látek na procesy vaskulogeneze bylo možné díky použití technik průtokové cytometrie, fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS), speciálních technik kultivace endoteliálních progenitorových buněk (EPC) z periferní krve a modelů transplantace myší kostní dřeně.33-36 FACS se používá k detekci a kvantifikaci EPC v periferní krvi pomocí protilátek proti povrchovým antigenům těchto buněk. Tímto způsobem lze analyzovat vliv léků nebo růstových faktorů na počet těchto buněk v periferní krvi. Speciální techniky selekce a kultivace buněk vyvinuté naší skupinou rovněž umožnily detekovat a kvantifikovat EPC. V myším modelu transplantace kostní dřeně jsou buňky kostní dřeně od myšího dárce transplantovány do myšího receptoru s genem, který kóduje vypracování látky umožňující její pozdější detekci (obrázek 3). V našem případě gen kódoval elaboraci beta-galaktosidázy endoteliálními buňkami. Selektivní exprese je dosaženo díky tomu, že tento gen je u myšího dárce regulován specifickým promotorem endotelových buněk, Tie-2. Proto pouze endotelové buňky z kostní dřeně zvířecího dárce budou exprimovat beta-galaktosidázu, kterou lze detekovat ve zvířecím receptoru. Pokud výše popsané biologické experimenty provedeme po transplantaci kostní dřeně ve zvířecím receptoru, můžeme analyzovat vliv určité látky na vaskulogenezi kvantifikací počtu endoteliálních progenitorových buněk získaných z kostní dřeně.

Obr. 3. Vliv látky na vaskulogenezi. Myší model transplantace kostní dřeně pro studium vaskulogeneze. Použití dárci kostní dřeně jsou transgenní myši, které konstitutivně exprimují gen LacZ (který kóduje beta-galaktosidázu) regulovaný specifickým endoteliálním promotorem Tie-2. Kostní dřeň je odebrána a transplantována myším receptorům, jejichž kostní dřeň byla subletálně ozářena. Po období 4 týdnů, kdy se dosáhne rekonstituce transplantované kostní dřeně, se provede jeden nebo více zásahů do myšího receptoru (na obrázku je model rohovky), aby se stimulovala neovaskularizace. Po těchto zásazích jsou zvířata usmrcena a je provedena histologická studie ke zjištění exprese beta-galaktosidázy. Pomocí barvení X-GAL získají buňky, které exprimují beta-galaktosidázu, namodralou barvu. Použití specifického promotoru pro endoteliální buňky umožňuje identifikovat modré buňky, které byly začleněny do neovaskularizačních ložisek, jako buňky endoteliální linie.

VLIV STATINŮ NA INDUKCI ANGIOGENEZE A VASKULOGENEZE

Výzkumy provedené v naší laboratoři i jinde prokázaly, že statiny stimulují intracelulární signální dráhu proteinkinázy Akt/PKB,25-27 která podporuje angiogenezi25 i vaskulogenezi.26 Kromě toho se Vasovi a spol. podařilo také u lidí prokázat účinky statinů na kinetiku EPC.28

Účinky statinů in vitro

Statiny rychle aktivují proteinkinázu Akt/PKB v endoteliálních buňkách25 a EPC,26,27 čímž zvyšují fosforylaci eNOS a následnou produkci NO. Aktivace Akt statiny podporuje proliferaci, migraci a buněčné přežívání endoteliálních buněk a EPC, jakož i tvorbu cévní struktury. Inhibice Akt pomocí adenoviru, který kóduje dominantně negativní formu Akt, navíc způsobuje inhibici účinků vyvolaných statiny. Potenciál statinů v procesech regenerace tkání byl již dříve prokázán u osteoblastů. U těchto buněk statiny zvýšily proliferaci a úroveň aktivity, což následně zvýšilo tvorbu kosti.40

Ačkoli mechanismy aktivace Akt statiny nejsou přesně známy, je pravděpodobné, že se na nich podílí signalizace fosfatidylinositol 3-kinázy (PI3K), protože tento proces je blokován wortmaninem a LY294002, dvěma inhibitory tohoto enzymu (obr. 1). Kromě toho je nutná inhibice HMG-CoA reduktázy, protože aktivace Akt simvastatinem byla inhibována přidáním mevalonátu do inkubace (obr. 1). Mevalonát je nezbytný nejen pro biosyntézu cholesterolu, ale také při produkci ubichinonu, dolicholů a isoprenoidů, které jsou nezbytné v několika buněčných procesech. Ačkoli statiny stabilizují messengerovou RNA (mRNA) eNOS tím, že modifikují syntézu isoprenoidů,41 nepozorovali jsme změny hodnot proteosyntázy eNOS. V tomto smyslu je důležité zdůraznit, že ke zvýšení koncentrace mRNA došlo později (24 h) než k aktivaci fosforylace eNOS pomocí Akt (15 min). Tato kratší doba aktivace je v souladu se změnami vyvolanými statiny v produkci NO a ve vazodilataci pozorovanými v aortálních anulách ex vivo.42

Účinky statinů in vivo

Statiny a aktivace intracelulární signalizace Akt podporují angiogenezi v modelech periferní ischemie vyvinutých u normocholesterolemických králíků.25 U zvířat, která dostávala statiny, byly pozorovány vyšší perfuzní tlaky, větší počet kolaterálních cév a větší hustota kapilár (obr. 4). Na druhé straně statiny zvyšují počet endoteliálních progenitorových buněk v periferní krvi u myší26,27 i u lidí.28 Statiny navíc zvyšují neovaskularizaci rohovky u normocholesterolemických myší, částečně díky vaskulogenezi z EPC získaných z kostní dřeně (obr. 3 a 5).26 Pomocí myšího modelu transplantace kostní dřeně bylo možné prokázat větší počet EPC z kostní dřeně v rohovkách myší léčených statiny. Statiny tedy mají významný vliv na kinetiku EPC, jak bylo již dříve prokázáno u VEGF nebo faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a monocytů (GM-CSF),35 a statiny indukovaná mobilizace těchto buněk by mohla zvýšit postnatální neovaskularizaci.

Obr. 4. Vliv statinů na kinetiku EPC. Statiny indukované zvýšení neovaskularizace v noze králíka v reakci na jednostrannou resekci femorální tepny. a) Femorální tepna a její větve jsou disekovány. Genetický přenos do endotelu je proveden infuzí adenoviru, který kóduje beta-galaktosidázu (Ad-βgal) nebo Akt (Ad-myrAkt), do distální femorální tepny a inkubací během 15 min při dočasném sevření femorální žíly. b) Třetí den se odebere sval gastrocnemius a provede se barvení X-GAL pro stanovení transgenní distribuce v histologických preparátech obarvených hematoxylinem-eozinem. c) Provede se angiografie přes vnitřní kyčelní tepnu pro analýzu tvorby kolaterálních cév u různých léčených skupin. Na angiografiích provedených po 40 dnech je patrný nárůst tvorby kolaterálních cév u zvířat, která dostávala 0,1 mg/kg simvastatinu intraperitoneální injekcí, ve srovnání se zvířaty, která byla intervenována, ale byl jim podáván pouze fyziologický roztok. Kvantitativní analýza kolaterálních cév byla provedena u kontrolní skupiny, skupiny léčené simvastatinem a skupiny zvířat, která dostala intramuskulární injekci Ad-VEGF. Angiografické skóre bylo analyzováno u experimentálních skupin, které dostaly infuzi fyziologického roztoku, Ad-βgal a Ad-myrAkt 31 dní po operaci. d) Barvení na alkalickou fosfatázu v adduktorovém svalu ischemické nohy odhalilo větší hustotu kapilár ve skupině zvířat léčených simvastatinem oproti kontrolní skupině 40 dní po operaci. Údaje z každého experimentu jsou prezentovány jako průměr±SD (n=6 králíků v každé z léčených skupin, *P25)

Obr. 5. Zvýšení neovaskularizace rohovky vlivem statiny indukované vaskulogeneze. a) Reprezentativní fotografie zobrazující neovaskularizaci rohovky (vlevo, vehikulum; vpravo, simvastatin). b) Barvení X-gal celých rohovek. Namodralé body jsou buňky, které exprimují beta-galaktosidázu (vlevo, vehikulum; vpravo, simvastatin). c) Reprezentativní mikrofotografie z histochemického studia fluorescence v parafinových rohovkách myší Tie2/LacZ/BMT (vlevo, vehikulum; vpravo, simvastatin). Přítomnost dvojnásobně pozitivních buněk svědčí o tom, že endoteliální progenitorové buňky (EPC) získané z kostní dřeně byly začleněny do neovaskularizačních ložisek (vaskulogeneze). Červená barva v tomto případě označuje beta-galaktosidázu a zelená barva specifický endoteliální marker isolektin B4. Dvojitě pozitivní buňky (žlutá barva) jsou EPC získané z kostní dřeně, které byly inkorporovány novými cévami. d) Reprezentativní mikrofotografie histochemické studie fluorescence v celých rohovkách myší Tie2/LacZ/BMT (vlevo vehikulum; vpravo simvastatin). Červená barva ukazuje beta-galaktosidázu a zelená barva specifický endoteliální marker lektin BS-1. e) Kvantifikace EPC získaných transplantací začleněných do neovaskulatury. Vyjádřeno jako poměr mezi počtem EPC a celkovým počtem endoteliálních buněk tvořících nové cévy. *P26)

ZÁVĚRY

Statiny podporují proliferaci, migraci a buněčné přežití endoteliálních buněk a EPC získaných z kostní dřeně prostřednictvím mechanismů souvisejících s aktivací serin/treoninové proteinkinázy Akt nebo PKB. Podobně jako VEGF podporují statiny angiogenezi a vaskulogenezi. Proto může být aktivace Akt zodpovědná za některé příznivé účinky statinů, včetně postnatální neovaskularizace

.