Adaptorový komplex AP-3 zprostředkovává třídění kvasinkových a savčích přenašečů základních aminokyselin rodiny PQ na vakuolární/lysozomální membránurodiny přenašečů základních aminokyselin na vakuolární/lysozomální membránu

Bílkovina Ypq1 může dosáhnout vakuolární membrány cestou ALP nebo endozomální cestou

Nedávno bylo oznámeno, že fúzní protein Ypq1-GFP se lokalizuje na vakuolární membráně6, snažili jsme se určit, jakou cestou se Ypq1 do tohoto kompartmentu dostává. Proteiny vakuolární membrány se mohou do vakuoly dostat dvěma různými cestami: cestou ALP (alkalické fosfatázy) a cestou CPY (karboxypeptidázy Y), přičemž druhá z nich zahrnuje průchod proteinů přes endozomy (obr. 2A). Abychom otestovali, zda Ypq1 postupuje cestou CPY, zkoumali jsme jeho intracelulární distribuci u mutanta pep12Δ, který postrádá t-SNARE podílející se na fúzi vezikul s pozdním endosomem13. U tohoto mutanta byl Ypq1-GFP nalezen výhradně na vakuolární membráně (obr. 2B). U mutanta vps27Δ, který postrádá složku endozomálního komplexu ESCRT-0, jsou membránové proteiny, které se přesouvají endozomy, obvykle uloženy v jasně viditelných kompartmentech třídy E odpovídajících abnormálně zvětšeným endozomům, ale protein Ypq1-GFP byl u tohoto mutanta normálně zaměřen na vakuolární membránu (údaje nejsou uvedeny). Tyto výsledky ukazují, že Ypq1 nevyžaduje funkční dráhu CPY, aby dosáhl vakuoly. Poté jsme testovali, zda Ypq1 dosahuje vakuolární membrány cestou ALP. Je dobře zdokumentováno, že tato cesta vyžaduje adaptorový komplex AP-3, o němž se předpokládá, že působí v trans-Golgi a třídí nákladové proteiny do vezikul, které se následně spojují s endosomy. Tento komplex je heterotetramer skládající se ze dvou velkých podjednotek (β3a a δ), střední podjednotky (μ3a) a malé podjednotky (σ3) a absence některé z těchto podjednotek vede k deficienci komplexu AP-314 . Proto jsme izolovali dva kmeny s nedostatkem AP-3, apm3Δ (chybí podjednotka μ3a) a apl5Δ (chybí podjednotka δ). U těchto mutantů byl Ypq1-GFP nalezen na vakuolární membráně a také v malých bodových strukturách snadno značených pomocí FM4-64, které nebyly pozorovány u buněk divokého typu (obr. 2B). V mutantních buňkách amp3Δ a apl5Δ, které rovněž exprimují funkční Sec7-mCherry pro značení Golgiho, bylo vysoké procento těchto bodových struktur zdobeno Sec7-mCherry (obr. 2C) (kvantifikace sublokalizačních vzorců viz doplňkový obr. S1 online). Tyto výsledky naznačují, že při deficitu dráhy ALP má Ypq1 tendenci hromadit se v Golgi, zatímco významná část proteinu se dostává do vakuolární membrány jinou cestou. Abychom otestovali, zda se jedná o CPY dráhu, určili jsme umístění Ypq1-GFP u dvojitých mutantů apm3Δ pep12Δ a apl5Δ pep12Δ (obr. 2B). Je zajímavé, že doručení Ypq1-GFP do vakuoly bylo u těchto kmenů značně narušeno a protein byl nalezen většinou rozptýlený v cytosolu a také v bodových strukturách označených Sec7-mCherry (obr. 2B,C) (kvantifikace sublokalizačních vzorců viz doplňkový obr. S1 online). Vakuolu u těchto dvojitých mutantů bylo možné normálně označit pomocí FM4-64. Tyto výsledky ukazují, že Ypq1 může být řazen k vakuolární membráně jak cestou ALP, tak cestou CPY. V buňkách divokého typu využívá hlavně dráhu ALP, ale pokud je tato dráha deficientní, protein se zdržuje déle v Golgiho, ale stále může účinně dosáhnout vakuolární membrány prostřednictvím dráhy CPY. Při nedostatku ALP i CPY dráhy je malá část Ypq1-GFP detekovatelná na vakuolární membráně, což naznačuje, že protein může používat ještě další dráhu, která je však mnohem méně účinná při správném zacílení Ypq1 do vakuoly.

Obrázek 2

Ypq1 může dosáhnout vakuolární membrány cestou ALP nebo CPY.

(A) Dvě hlavní cesty přenosu z trans-Golgiho do vakuoly u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. MVB: multivesikulární tělísko (B) Kmeny 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) a LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3) transformované plazmidem pLL063 (YPQ1-GFP URA3) byly pěstovány na glukózo-amonném médiu. Před zobrazením se buňky nechaly 15 min internalizovat FM4-64 pro označení vakuoly. (C) Kmeny GC004 (ura3 leu2), BOA003 (apm3∆ ura3 leu2), BOA005 (apl5∆ ura3 leu2), BOA007 (apm3∆ pep12∆ ura3 leu2), BOA008 (apl5∆ pep12∆ ura3) transformované plazmidy pLL063 (YPQ1-GFP URA3) nebo pBOA010 (SEC7-mCherry LEU2) byly pěstovány na glukózo-amonném médiu. Před zobrazením se buňky nechaly 30 minut internalizovat CMAC, aby se označilo vakuolární lumen. Měřítko: 10 μm. Kvantifikaci sublokalizačních vzorců Ypq1-GFP (B) a Ypq1-GFP-Sec7-mCherry (C) naleznete jako doplňkový obrázek S1 online.

Kyselý dileucinový motiv podporuje třídění Ypq1 do dráhy ALP

Třídění transmembránových proteinů závislé na AP-3 je často zprostředkováno signály na bázi tyrozinu (YXXØ) nebo dileucinu (XXXL) (kde Ø je objemný hydrofobní zbytek a X libovolná aminokyselina)15. Ypq1 obsahuje sekvenci EQQPLL ve své druhé velké smyčce směřující do cytosolu. Dileucinu tohoto motivu předchází prolin, což je rys pozorovaný u několika nákladních látek využívajících dráhu ALP16. Bylo zjištěno, že mutant Ypq1 se záměnou dileucinu za dialanin (Ypq1LL>AA) je zaměřen na vakuolární membránu, ale také zdobí bodové struktury (obr. 3A). Tento fenotyp se podobá fenotypu pozorovanému u divokého typu Ypq1 v buňkách s deficitem AP-3, což naznačuje, že Ypq1LL>AA se do vakuoly dostává alternativní cestou CPY. Na podporu tohoto názoru se Ypq1LL>AA produkovaný v mutantě pep12Δ nepodařilo nasměrovat do vakuoly a byl roztříděn do cytosolických bodových struktur, jak bylo pozorováno u Ypq1 v mutantech apm3Δ pep12Δ a apl5Δ pep12Δ (obr. 3A). Tyto výsledky ukazují, že kyselý dileucinový motiv Ypq1 je nutný pro jeho třídění do vakuoly v závislosti na AP-3, ale ne pro jeho doručení do vakuoly v závislosti na Pep12. Tyto závěry jsou v souladu s výsledky nedávné studie publikované S. Emrem a spolupracovníky během přípravy tohoto rukopisu17. Dále jsme podrobněji zkoumali, jak se varianta Ypq1LL>AA dopravuje do vakuoly. Nejprve jsme uvažovali o možnosti, že by tento mutantní protein mohl být vzhledem k tomu, že nevyužívá dráhu ALP, nejprve přenesen do plazmatické membrány, než projde rychlou endocytózou a následným doručením do vakuolární membrány v závislosti na Pep12. Tento model naše pozorování nepodpořila: Ypq1LL>AA se u mutanta end3Δ defektního v endocytóze nehromadil na povrchu buňky, což naznačuje, že se do vakuoly dostává cestou CPY (obr. 3B). Předpokládali jsme tedy, že doručení Ypq1LL>AA do vakuoly může zahrnovat jeho třídění z Golgiho do endosomů díky alternativním adaptorům, jako je komplex AP-1 nebo monomerní proteiny GGA. Mutantní protein Ypq1LL>AA jsme exprimovali v buňkách gga1Δ gga2Δ, které postrádají nadbytečné adaptory Gga1 a Gga2, a v buňkách amp1Δ, amp2Δ a apl4Δ, které postrádají podjednotky komplexu AP-1. U všech těchto mutantů bylo zjištěno, že se protein stále dostává do vakuoly (obr. 3B). Tato pozorování naznačují, že buď tyto adaptory působí redundantně a podporují třídění Ypq1LL>AA do vakuoly cestou CPY, nebo se na něm podílejí jiné adaptory.

Obrázek 3

Kyselý dileucinový motiv podporuje třídění Ypq1 do dráhy ALP.

(A) Kmeny 23344c (ura3) a EN046 (pep12∆ ura3) transformované plazmidem pLL034 (YPQ1LL>AA-GFP URA3) byly pěstovány na glukózo-amonném médiu. Před zobrazením se buňky nechaly 15 min internalizovat FM4-64 pro označení vakuoly. (B) Kmeny 23344c (ura3), LL115 (end3∆ ura3), JA445 (gga1∆ gga2∆ ura3), LL078 (apm1∆ ura3) a LL066 (apl4∆ ura3) transformované plazmidy pLL063 (YPQ1-GFP URA3) nebo pLL034 (YPQ1LL>AA-GFP URA3) byly pěstovány na glukózo-amonném médiu. Před zobrazením se buňky nechaly 15 min internalizovat FM4-64 pro označení vakuoly. Měřítko: 10 μm.

Ypq2 a Ypq3 se také přesouvají do vakuoly cestou ALP, ale procházejí různými osudy, když je cesta ALP nefunkční

Bílkoviny Ypq2 a Ypq3, sekvenčně velmi podobné Ypq1, se také lokalizují na vakuolární membráně6 a obě také obsahují kyselý dileucin ve druhé cytosolové smyčce. Výsledky na obr. 4A ukazují, že Ypq2 se u mutanta pep12Δ normálně přesouvá do vakuoly. To se potvrdilo také u mutantů apm3Δ a apl5Δ defektních v dráze ALP, kde bylo navíc zjištěno, že zdobí bodové struktury, což je fenotyp, který nebyl pozorován u buněk divokého typu. Vysoký podíl těchto tečkovaných struktur byl také označen Sec7-mCherry (obr. 4B), což naznačuje, že Ypq2 má podobně jako Ypq1 tendenci hromadit se v Golgi, když je ALP dráha defektní. Jak u apm3Δ pep12Δ, tak u apl5Δ pep12Δ dvojitých mutantů se Ypq2 z velké části chybně lokalizoval do malých bodových cytosolických struktur, z nichž mnohé byly zdobeny Sec7-mCherry, ačkoli část proteinu se zřejmě správně dostala do vakuoly (obr. 4A,B) (kvantifikace sublokalizačních vzorců viz doplňkový obr. S2 online). Tyto výsledky naznačují, že Ypq2 se chová podobně jako Ypq1 v tom smyslu, že k dosažení vakuoly využívá především dráhu ALP. Ukazují také, že pokud je tato dráha defektní, Ypq2 se zdržuje déle v Golgiho, ale stále může být dopraven k vakuolární membráně, hlavně prostřednictvím dráhy CPY.

Obr. 4

Ypq2 může dosáhnout vakuolární membrány prostřednictvím dráhy ALP nebo CPY.

(A) Kmeny 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) a LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3) transformované plazmidem pLL161 (YPQ2-GFP URA3) byly pěstovány na glukózo-amonném médiu. Před zobrazením se buňky nechaly 15 min internalizovat FM4-64 pro označení vakuoly. (B) Kmeny GC004 (ura3 leu2), BOA003 (apm3∆ ura3 leu2), BOA005 (apl5∆ ura3 leu2), BOA007 (apm3∆ pep12∆ ura3 leu2), BOA008 (apl5∆ pep12∆ ura3) transformované plazmidy pLL161 (YPQ2-GFP URA3) nebo pBOA010 (SEC7-mCherry LEU2) byly pěstovány na glukózo-amonném médiu. Před zobrazením se buňky nechaly 30 minut internalizovat CMAC, aby se označilo vakuolární lumen. Měřítko: 10 μm. Kvantifikaci sublokalizačních vzorců Ypq2-GFP (A) a Ypq1-GFP-Sec7-mCherry (B) naleznete jako doplňkový obrázek S2 online.

Jelikož exprese genu YPQ3-GFP pod kontrolou přirozeného promotoru YPQ3 poskytla sotva detekovatelnou hladinu Ypq3-GFP, exprimovali jsme fúzní gen pod kontrolou promotoru indukovaného galaktózou. Aby se snížilo riziko chybné lokalizace v důsledku nadprodukce Ypq3-GFP, byly buňky nejprve pěstovány na rafinose, poté byla na 3 hodiny přidána galaktóza a nakonec byla na 2 hodiny přidána glukóza, aby se potlačila transkripce genu YPQ3-GFP. Bylo zjištěno, že tento přechodně indukovaný Ypq3-GFP, který se v buňce hromadil na úrovni blízké endogenní hladině Ypq1-GFP (viz doplňkový obr. S3, online), se lokalizuje na vakuolární membráně (obr. 5A), což je v souladu s našimi předchozími výsledky6. Tato vakuolární lokalizace byla pozorována také u mutanta pep12Δ. U apm3Δ a apl5Δ mutantů byl však Ypq3 přesunut převážně do lumen vakuoly. Toto přesunutí bylo závislé na Pep12, protože Ypq3 se nepodařilo nasměrovat do vakuoly u apm3Δ pep12Δ a apl5Δ pep12Δ dvojitých mutantů (obr. 5A) (kvantifikace sublokalizačních vzorců viz Supplementary Fig. S4 online). Tyto výsledky naznačují, že stejně jako Ypq1 a Ypq2 využívá Ypq3 k dosažení vakuolární membrány především cestu ALP. Při nedostatku složek komplexu AP-3 je Ypq3 přesměrován způsobem závislým na Pep12 do endozomů, kde je řazen do dráhy multivesikulárních tělísek (MVB), což vede k jeho doručení do vakuolárního lumen. Tato interpretace byla dále posouzena izolací mutantu Ypq3LL>AA, který by neměl být rozpoznán adaptorovým komplexem AP-3. V buňkách divokého typu byla varianta Ypq3LL>AA jasně přesměrována do vakuolárního lumen, ale v mutantě pep12Δ byla přesměrována do malých cytosolických bodových struktur (obr. 5B).

Obrázek 5

Ypq3 je dodáván do vakuolární membrány cestou ALP a je zaměřen do vakuolárního lumen, pokud je třídění cestou ALP defektní.

(A) Kmeny 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) a LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3) transformované plazmidem pLL106 (GAL1-YPQ3-GFP URA3) byly pěstovány na raffinose-amonium médiu, po dobu 3 hodin byla přidávána galaktóza (3 %) a po dobu 2 hodin byla buňkám dodávána glukóza (3 %). Před zobrazením se buňky nechaly 15 min internalizovat FM4-64 pro označení vakuoly. (B) Kmen 23344c (ura3) transformovaný plazmidy pLL106 (GAL1-YPQ3-GFP URA3) a pLL168 (GAL1-YPQ3LL>AA-GFP URA3) a kmen EN046 (pep12∆ ura3) transformovaný plazmidem pLL168 (GAL1p-YPQ3LL>AA-GFP URA3) byly pěstovány a analyzovány jako v bodě (A). Měřítko: 5 μm. Kvantifikaci sublokalizačních vzorců Ypq3-GFP naleznete jako doplňkový obrázek S4 online.

Uvažovali jsme, že odlišné chování Ypq3 ve srovnání s Ypq1 a Ypq2 u kmenů s deficitem AP-3 může být způsobeno tím, že Ypq3-GFP byl syntetizován v buňkách rostoucích v přítomnosti galaktózy, nebo tím, že transkripce genu YPQ3-GFP byla indukována pomocí silného promotoru GAL. To se však zdá nepravděpodobné, protože proteiny Ypq1-GFP a Ypq2-GFP přechodně indukované v divokém typu a mutantních kmenech pomocí stejného promotoru GAL se v buňkách lokalizovaly stejně, jako když byly exprimovány pod vlastními promotory genů (viz doplňkový obr. S5 online). Kromě toho, ačkoli byl fluorescenční signál sotva detekovatelný, jsme získali důkaz, že Ypq3-GFP exprimovaný pomocí promotoru přirozeného genu YPQ3 označil membránu vakuol u kmene divokého typu, ale ne u mutanta apl5Δ, což je fenotyp jasně odlišný od fenotypů získaných s Ypq1-GFP a Ypq2-GFP. U tohoto mutanta byl Ypq3-GFP přítomen v bodových strukturách, které pravděpodobně odpovídaly Golgi, a jeho přesun do vakuolárního lumen nebyl jasně viditelný, pravděpodobně proto, že fluorescence byla příliš slabá (viz doplňkový obr. S6 online).

Závěrem lze říci, že jak bylo ukázáno výše u Ypq1, proteiny Ypq2 a Ypq3 využívají k dosažení vakuolární membrány především dráhu ALP a při poruše této dráhy se odchylují do endozomů. Zatímco Ypq1 a Ypq2 procházející endosomy účinně dosahují vakuolární membrány, Ypq3 je náchylnější k třídění do dráhy MVB, což vede k jeho zacílení do vakuolárního lumen.

PQLC2 produkovaný v kvasinkách využívá dráhu ALP a svůj dileucinový motiv k dosažení vakuolární membrány

V předchozí studii bylo zjištěno, že krysí PQLC2 se v buňkách HeLa lokalizuje do lysozomů, ale jeho mutant PQLC2LL>AA, v němž je C-koncový dileucin nahrazen dialaninem, vykazoval rozptýlenější distribuci po buňce a byl částečně missortován do plazmatické membrány6. Dále bylo zjištěno, že PQLC2 produkovaný v kvasinkách se lokalizuje na vakuolární membráně, kde je funkční, protože bylo zjištěno, že doplňuje růstový fenotyp mutanta ypq2Δ6. Výsledky na obr. 6A ukazují, že PQLC2 byl správně zacílen do kvasinkové vakuoly u mutanta pep12Δ, ale u mutantů apm3Δ a apl5Δ se odchýlil do vakuolárního lumen. Toto zacílení do vakuolárního lumen bylo narušeno u apm3Δ pep12Δ a apl5Δ pep12Δ dvojitých mutantů, u nichž bylo zjištěno, že PQLC2 je rozptýlen v cytosolu (kvantifikace sublokalizačních vzorců viz doplňkový obr. S7 online). V divokém typu a mutantních kmenech kvasinek jsme také exprimovali mutant PQLC2LL>AA. U kvasinek divokého typu byla zjištěna lokalizace PQLC2LL>AA ve vakuolárním lumen, ale u mutanta pep12Δ byla zjištěna její distribuce v celém cytosolu (obr. 6B). Třídění nákladu na dráhu multivesikulárních tělísek je typicky narušeno u mutanta vps27Δ, kterému chybí klíčová složka komplexu ESCRT-018. U mutanta vps27Δ byl PQLC2LL>AA uložen ve velkém perivakuolárním kompartmentu: kompartmentu třídy E, který je typický pro tuto kategorii mutantů (obr. 6B). Tyto výsledky ukazují, že PQLC2 produkovaný v kvasinkách se chová stejně jako endogenní Ypq3: je tříděn do vakuoly cestou ALP způsobem závislým na správném rozpoznání jeho dileucinového motivu adaptorovým komplexem AP-3. Pokud je toto rozpoznávání narušeno, protože je dileucinový motiv mutován nebo chybí složka komplexu AP-3, PQLC2 se odchyluje do endozomů, kde je účinně tříděn do dráhy MVB a nakonec se dostane do vakuolárního lumen.

Obrázek 6

PQLC2 exprimovaný v kvasinkách je tříděn do vakuolární membrány cestou ALP.

(A) Kmeny 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) a LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3) transformované plazmidem pCJ502 (GAL1-rPQLC2-GFP URA3) byly pěstovány a ošetřeny podle obr. 5 před zobrazením. (B) Kmeny 23344c (ura3), JA770 (vps27∆ ura3) a EN046 (pep12∆ ura3) transformované plazmidem pBOA006 (GAL1-rPQLC2LL>AA-GFP URA3) byly před zobrazením pěstovány a ošetřeny jako na obr. 5. Měřítko: 5 μm. Kvantifikaci sublokalizačních vzorců PQLC2-GFP naleznete jako doplňkový obrázek S7 online.

Deplece podjednotky AP-3 zhoršuje doručení PQLC2 do lysozomů

PQLC2-GFP produkovaný v buňkách HeLa do značné míry kolokalizuje s lysozomálním markerem LAMP1. Lokalizace PQLC2 do lysozomální membrány byla dále podpořena semikvantitativní analýzou hmotnostní spektrometrie proteinů v preparátech vysoce obohacených o lysozomální membrány z jaterních buněk potkanů6. Abychom zjistili, zda adaptor AP-3 přispívá k třídění PQLC2 do lysozomů, použili jsme malou interferující RNA (siRNA) k inhibici syntézy podjednotky μ3A AP-3 v buňkách HeLa. Imunoblotová analýza potvrdila, že dva typické pásy odpovídající podjednotkám μ3A19 byly v buňkách ošetřených μ3A-siRNA na rozdíl od kontrolních buněk sotva detekovatelné (obr. 7A). Tato deplece μ3A silně narušila lokalizaci PQLC2-GFP (obr. 7B): protein se lokalizoval převážně do četných intracelulárních bodových struktur neznačených barvivem Lyso Tracker, které se hromadí v lysozomech, a byl nalezen také na povrchu buněk, včetně mikrovilů, což naznačuje, že část proteinu byla také nesprávně směrována do plazmatické membrány. To kontrastuje s lokalizací PQLC2 v buňkách ošetřených mockem, kde byl protein podle očekávání přítomen v bodových strukturách rovněž silně značených barvivem Lyso Tracker. Tyto výsledky naznačují, že komplex AP-3 přispívá ke správné lokalizaci PQLC2 do lysozomů. Zkoumali jsme také lokalizaci mutanta PQLC2LL>AA (obr. 7C). V kontrolních buňkách HeLa byla PQLC2LL>AA nalezena distribuovaná v intracelulárních bodových strukturách neznačených nebo velmi slabě značených barvivem Lyso Tracker a byla také zřetelně přítomna na povrchu buněk, což je v souladu s předchozími pozorováními6. Tato lokalizace nebyla v buňkách ošetřených μ3A-siRNA výrazně narušena, což podporuje názor, že úlohou dileucinového motivu PQLC2 je zprostředkovat intracelulární přenos prostřednictvím komplexu AP-3. Dále jsme zkoumali, zda je PQLC2LL>AA přesměrován do lumen endozomálních/lysozomálních kompartmentů, jako když je produkován v kvasinkách. HeLa buňky exprimující PQLC2-GFP byly po dobu dvou hodin ošetřeny vacuolinem-1, sloučeninou vyvolávající homotypickou fúzi kompartmentů endozomálního/lysozomálního systému, což vedlo k tvorbě velkých zduřelých struktur (obr. 8). Bylo zjištěno, že PQLC2-EGFP se podle očekávání lokalizuje na hraniční membráně těchto zvětšených endozomálních/lysozomálních oddílů. Totéž platilo v buňkách produkujících PQLC2LL>AA, což naznačuje, že mutantní protein není účinně tříděn do dráhy MVB. Závěrem lze říci, že adaptorový komplex AP-3 zřejmě hraje důležitou roli při cílení PQLC2 do lysozomu, nejspíše prostřednictvím rozpoznání jeho C-koncového dileucinu. Pokud je toto rozpoznávání narušeno, protein se odchyluje k buněčnému povrchu a k limitující membráně vnitřních kompartmentů.

Obrázek 7

Adaptorový komplex AP-3 je nutný pro lokalizaci PQLC2 do lysozomu v buňkách HeLa.

(A) Buňky HeLa byly třikrát transfekovány siRNA namířenou na podjednotku μ3A komplexu AP3. Po 48 hodinách od třetího kola transfekce bylo ekvivalentní množství homogenátů z mock buněk a buněk ošetřených siRNA podrobeno SDS-PAGE a imunoblotu s použitím protilátky proti podjednotce μ3A komplexu AP3. Čísla odpovídají relativním hladinám podjednotky μ3A odhadnutým pomocí aktinu jako reference (B) Ve třetím kole transfekce siRNA byly buňky kotransfekovány plasmidy rPQLC2-EGFP nebo rPQLC2LL>AA-EGFP. Po 48 hodinách byly buňky inkubovány po dobu 2 hodin s Lysotracker-Red DND-99 a před zobrazením fixovány. Měřítko: 10 μm.

.

Obrázek 8

PQLC2 není dodáván do lumen lysozomů, když je třídění prostřednictvím komplexu AP-3 narušeno.

Buňky HeLa transfekované plazmidy PQLC2-EGFP nebo PQLC2LL>AA-EGFP byly ošetřeny vacuolinem-1 po dobu 2 hodin. Buňky byly fixovány a vyšetřeny fluorescenčním mikroskopem. Měřítko: 10 μm.