ADAR

C Enzyme-Substrate Recognition

Málo se ví o tom, jak ADAR interagují se svými specifickými substráty a jak vazebné domény RNA a katalytická doména spolupracují během editační reakce. Na rozdíl od C-to-U RNA editačního aparátu, který využívá primární sekvenční motiv v blízkosti editačního místa jako kritický determinant pro rozpoznání substrátu (Niswender, 1998), postrádají enzymy ADAR jakoukoli zjevnou vnitřní sekvenční specifitu. Ve skutečnosti, pokud jsou jim předloženy zcela dvouřetězcové molekuly RNA, ADAR1 i ADAR2 deaminují téměř promiskuitně až 50-60 % všech adenosinů v sekvenci (Nishikura, 2010). Přítomnost smyček, neshod a výčnělků ve struktuře substrátu RNA však zvyšuje selektivitu místa a, jak je vidět u některých fyziologických cílů ADAR, složité složení RNA takového substrátu zřejmě omezuje přístup pro vazbu na RNA a produktivní katalýzu často na jediný adenosin (Nishikura, 2010). Většina cílové specifity editace A-to-I tedy může spočívat v trojrozměrném složení substrátu. Nedávné strukturní studie vazebných domén RNA proteinu ADAR v komplexu s minimálními substráty RNA založené na NMR však naznačují, že jednotlivé vazebné domény dsRNA se mohou podílet také na sekvenčně specifických kontaktech, které by mohly přispívat k selektivitě pro určité cíle RNA oproti jiným (Stefl et al., 2006, 2011).

Další vlastností ADAR, která může mít vliv na rozpoznávání a interakci se substrátem, je zjištění, že pro produktivní a vysoce aktivní deaminaci tvoří proteiny ADAR na substrátu dimer (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potenciálně mohou vznikat homo- i heterodimery mezi proteiny ADAR (Chilibeck et al., 2006) a představují tak další vrstvu regulace ovlivňující specifické rozpoznávání substrátu i editační aktivitu RNA. Jelikož doposud není znám žádný editační cíl pro ADAR3 a tento protein nevykazuje žádnou enzymatickou aktivitu ve standardních deaminázových testech (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), předpokládá se, že jeho role je regulační povahy prostřednictvím heterodimerizace s ostatními ADAR.

S tvorbou dimerů ADAR pro obecnou editační aktivitu souvisí pozorování, že některé editační události RNA probíhající v rámci stejného substrátu vykazují pozitivní nebo negativní vazbu. Například adenosiny, které spolu přímo sousedí, nebo ty, které se nacházejí na stejné straně duplexní struktury RNA (vzdálenost přibližně 11 nt v rámci RNA ve formě A), často vykazují spřažení při editaci pomocí ADAR pravděpodobně v důsledku jejich blízkosti ke katalytickému místu enzymu v prostoru (Koeris a kol., 2005; Enstero a kol., 2009).

Přes tyto poznatky není v současné době stále možné předpovědět místo editace RNA na základě primární sekvence RNA. Důvodem je především složitá povaha terciárních struktur RNA a jejich dynamické chování. I když vezmeme v úvahu, že vazebné domény dsRNA mohou být schopny rozlišovat určité motivy primární sekvence oproti jiným, malé změny v okolní primární sekvenci nebo sekundární a terciární struktuře mohou modulovat nebo dokonce přehlušit kontakty specifické pro danou sekvenci. V důsledku toho pokusy o vytvoření vyhledávacích algoritmů kombinujících několik molekulárních vlastností (včetně pravděpodobnosti párování bází, sekvenčního prostředí, sekvenční konzervace), o nichž je známo, že ovlivňují pravděpodobnost editace nebo aktivitu, s cílem předpovědět potenciální místa pro editaci vedly k dlouhým seznamům kandidátních pozic v mRNA, ale jen málo nových, selektivních míst a míst s vysokou úrovní modifikace bylo ověřeno jako skutečné cíle in vivo (Clutterbuck a kol., 2005; Levanon a kol., 2005; Gommans a kol., 2008; Sie a Maas, 2009). Dichotomie mezi detekcí tisíců pravděpodobných editačních míst na základě molekulárních znaků v pre-mRNA a malým počtem míst s vysokou úrovní rekódování naznačuje, že buď predikční algoritmy trpí vysokou mírou falešné pozitivity a většina těchto kandidátních pozic není editována ADAR, nebo je problém v experimentální detekci editace RNA a pro mnoho skutečných editačních míst jsou testovány nesprávné tkáně (editace specifická pro buněčný typ) nebo jsou testovány v nesprávném časovém okamžiku (regulovaná editace). Případně jsou úrovně editace in vivo u většiny míst tak malé, že současné metody detekce nejsou dostatečně citlivé, aby editaci prokázaly nebo vyvrátily

.