Adenylylcykláza

• 1 Funkce
• 2 Úvod
  • 2.1 Cyklický adenosinmonofosfát
  • 2.2 Pyrofosfát
• 3 Adenylylcykláza savců
  • 3.1 Typ II
    • 3.1.1 Struktura
    • 3.1.2 Poruchy nadměrné exprese
• 4 Adenylylcykláza Rv1264
  • 4.1 Struktura
    • 4.1.1 C-terminální katalytická doména
      • 4.1.1.1 α1-přepínač
    • 4.1.2 N-terminální regulační doména
      • 4.1.2.1 αN10-přepínač
  • 4.2 Regulace podle pH
  • 4.3 Biologická role
• 5 3D struktury adenylylcyklázy

Funkce

Adenylylcykláza (ADCY, číslo EC 4.6.1.1), známá také jako adenylátcykláza, je enzym, který katalyzuje cyklizaci do . K tomu dochází v jediném koordinovaném kroku, kdy kyslík na 3′ hydroxylové skupině ATP nukleofilně atakuje alfa-fosfát za vzniku fosfodiesterové vazby a odštěpení pyrofosfátové skupiny. Ve většině aktivních míst se v blízkosti 3’OH nachází kyselý zbytek, který funguje při její deprotonaci, a základní zbytky u β-fosforu, které snižují energii skupiny pro štěpení. Reaktantem v reakci katalyzované adenylylcyklázou je ATP; ATP je nejrozšířenější nukleotidtrifosfát ve většině buněk s typickou koncentrací od 1 do 10 mM. Tato vysoká intracelulární koncentrace umožňuje rychlé zvýšení koncentrace cAMP v reakci na určitý signál, což je důležité v mnoha signálních transdukcích a metabolických drahách. Hlavním produktem této reakce je cAMP s vedlejším produktem PPi. Cytoplazmatické oblasti ADCY se skládají z jeho N-konce, C1a, C1b, C2a a C2b. C1a a C2a tvoří katalytickou doménu. Tato stránka klade důraz na mikrobiální adenylylcyklázu Rv1264, ale méně podrobně se zabývá i savčími adenylylcyklázami.

Adenylcyklázový protein (CAP) reguluje aktinový cytyoskelet a buněčnou adhezi u všech eukaryot.

Pro adenylátcyklázu citlivou na kalmodulin viz faktor antraxového edému.

Úvod

U savců existuje deset izozymů adenylátcyklázy, adenylátcyklázy typu I-X, (ADCY I-X), a mnoho dalších u jiných organismů. Všechny savčí a většina ostatních adenylylcykláz patří do třídy III; většina z nich jsou integrální membránové proteiny a všechny produkují cAMP, jehož schopnost může být aktivována nebo inaktivována v reakci na určité podmínky nebo ligandy. Všechny savčí membránové adenylylcyklázy jsou aktivovány alfa podjednotkami G-proteinů, ale reagují odlišně na ligandy, jako jsou hořečnaté ionty, vápenaté ionty a beta-gama podjednotky G-proteinů. Jeden ze savčích izozymů a některé prokaryotické formy adenylylcyklázy reagují na podmínky prostředí, především na pH.

Cyklický adenosinmonofosfát

U savců působí cAMP jako sekundární posel, jednou z jeho funkcí je řízení aktivity proteinkinázy A (PKA). PKA má zase v buňkách poměrně rozmanité úlohy, zatímco většina z nich je spojena s metabolismem, PKA hraje také důležitou roli v transkripci, buněčném cyklu a apoptóze. Konečným osudem cAMP je jeho přeměna na AMP štěpením fosfodiesterové vazby fosfodiesterázou 3′, 5′-cyklického adenosinmonofosfátu.

Pyrofosfát

Štěpením vedlejšího produktu této reakce, PPi, pyrofosfatázou vznikají dvě molekuly anorganického fosfátu (Pi). ATP syntáza může tento anorganický fosfát znovu začlenit do adenindifosfátu (ADP) a vytvořit ATP s využitím energie v protonové hybné síle.

Adenylylcykláza savců

U savců existuje deset izozymů adenylylcyklázy, adenylylcyklázy typu I-X, (ADCY I-X); U savců hraje adenylylcykláza důležitou roli v signálních transdukčních drahách, v nichž je cAMP sekundárním poslem.

Všechny ADCY I-IX mají společnou obecnou strukturu; Skládají se ze dvou transmembránových oblastí (M1, M2), které se skládají ze šesti membránových šroubovic a jejichž funkcí je udržet enzym ukotvený v membráně, a dvou cytoplazmatických oblastí (C1, C2), které se mohou dále dělit (C1a, C1b, C2a, C2b) a jsou zodpovědné za veškerou katalytickou aktivitu a regulaci G-proteiny a forskolinem. V roztoku mohou domény C1a a C2a tvořit vzájemně heterodimery, a to buď ve stejných, nebo různých enzymech, nebo mohou tvořit homodimery se svými identickými jednotkami na různých enzymech. Doména C1b je velmi velká (≈15 kDa) s mnoha regulačními místy a má variabilní strukturu napříč izozymy; zatímco doména C2b se v mnoha izozymech téměř nevyskytuje a dosud nebyla spojena s konkrétní funkcí.

Typ II

Struktura

Monomer domény C2 z má vnitřní, hydrofobní, antiparalelní obklopený několika, amfipatickými , s výjimkou oblasti, která potřebuje vytvořit homodimer s jinou doménou C2. Dva monomery C2 domény adenylylcyklázy typu II se v roztoku spojují za vzniku , který je nezbytný pro katalytickou přeměnu ATP na cAMP a PPi. Když se spojí, vytvoří hlubokou štěrbinu táhnoucí se středem jejich vazebného místa; tato štěrbina je vhodná pro vazbu dvou molekul na svých koncích. Mezi kyslíkovými atomy forskolinu a okolní peptidovou páteří se vytvářejí silné vodíkové vazby a ostatní interakce jsou vysoce hydrofobní, protože vazebné místo forskolinu obsahuje deset alifatických a aromatických zbytků. Tato vazba forskolinu vytváří hydrofobní vazbu mezi monomery, z nichž každý má dva různé hydrofobní povrchy vázající se na forskolin; a právě díky této interakci je homodimer stabilní. Forskolin také interaguje s Asn 1025, který je nezbytný pro katalytickou aktivitu, a správně ho polohuje, a může dokonce interagovat přímo s ATP. Tento komplex homodimeru a forskolinu může být dále aktivován v reakci na signál prostřednictvím vazby na podjednotku βγ G-proteinu . Tato βγ-podjednotka se váže na které tvoří část α-šroubovice na vnější vrstvě komplexu.

Tento homodimer se nachází uvnitř štěrbiny a je charakterizován dvěma vysoce konzervovanými sadami polárních zbytků (Arg 997 (zelená), Asn 1025 (červená), Ser1028(růžová), Arg 1029(oranžová), Asp 1031(žlutá) a Ser 1032(fialová)). Jedna z těchto sad se nachází na každé monomerní podjednotce, na homodimeru se uspořádávají antiparalelně, kde směřují k sobě.

Poruchy nadměrné exprese

V mozku savců vykonává funkce založené na paměti prefrontální kůra (PFC). Hyperpolarizací aktivované cyklické nukleotidem řízené (HCN) kanály na neuronech se uzavírají, aby umožnily tok elektrochemických signálů po axonu a do synapse; když jsou HCN kanály otevřené, nemůže být elektropotenciální signál přenášen buňkou. Vystavení těchto kanálů působení cAMP způsobí jejich otevření, zastavení přenosu signálů, a tím naruší vyšší kognitivní myšlení. U pacientů se schizofrenií je regulační molekula cAMP, Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1), zmutovaná a nedokáže regulovat hladinu cAMP; zvýšená hladina cAMP tak může způsobovat schizofrenii. Předpokládá se, že uzavření HCN kanálů hraje roli i u dalších poruch, jako je ADHD a bipolární porucha. Je tedy rozumné, že regulace produkce cAMP zacílením na adenylylcyklázu typu II, protože se nachází v mozku, může působit jako léčba těchto poruch.

Rv1264 Adenylylcykláza

Ačkoli se adenylylcykláza vyskytuje napříč organismy na univerzální úrovni, vzdáleně příbuzné organismy mají různé modifikace tohoto enzymu, z nichž každá je specializovaná na určitý úkol v určitém prostředí. Jak již bylo uvedeno dříve, člověk má 10 známých izozymů adenylylcyklázy; zatímco Escherichia coli má pouze jeden izozym a Mycobacterium tuberculosis jich má patnáct. Jedna obzvláště zajímavá adenylylcykláza, kterou disponuje M. tuberculosis, Rv1264, má N-konec, který v jistém smyslu funguje jako pH senzor, protože reguluje aktivitu enzymu na základě pH okolního roztoku. Tato adenylylcykláza, stejně jako většina ostatních, patří do třídy III, adenylylcyklázy v této třídě mají více domén, přinejmenším jednu pro katalýzu a druhou pro regulaci.

Struktura

Adenylylcykláza je 363 zbytků dlouhý protein složený z katalytické a regulační části, která obsahuje ohebnou, jež obě části spojuje. Aktivní struktura je homodimer podobný savčímu homodimeru typu II, kde je α-helix jednoho monomeru (řetězec A) umístěn přes centrální vinutou spirálu druhého (řetězec B). Díky této dimerizaci se regulační doména řetězce A nachází v těsné blízkosti katalytické domény řetězce B a naopak. V proteinu jsou přítomny dva přepínací prvky, jeden v C-terminální doméně (α1-přepínač) a druhý v linkerové oblasti (αN10-přepínač), ty umožňují, aby v enzymu probíhaly velké konformační změny v reakci na relativně malé změny prostředí.

C-terminální katalytická doména

Katalytickou aktivitu u Rv1264 vykonávají zbytky: Asp 222 (červená), Lys 261 (modrá), Asp 265 (oranžová), Arg 298 (růžová), Asp 312 (žlutá), Asn 319 (fialová), Arg 323 (zelená). Všechny tyto zbytky vytvářejí vysoce polární prostředí, které má komplementární náboj a polaritu k meziproduktu reakce. Zbytky, které vedou fosfáty ATP, arginin 298 a 323, se vážou a v aktivním místě. Tento sulfátový ion se nachází v poloze, kterou během katalýzy obsadí β-fosfát ATP. V procesu katalýzy se β-fosfát odštěpuje od α-fosfátu; tuto reakci lze učinit příznivější snížením energie pomocí komplementárních nábojových asociací mezi β-fosfátem a argininy 298 a 323. Další zbytek, , váže molekulu prostřednictvím elektrostatických interakcí. Specifická funkce této asociace není známa, ale vzhledem k její blízkosti k aktivnímu místu může hrát roli v katalýze.

Sekvenování aminokyselin ukázalo, že sekvence mezi katalytickou doménou adenylylcyklázy Rv1264 a katalytickou doménou adenylylcyklázy savců nejsou dobře konzervované, s pouze asi 25% shodou s výše diskutovanou adenylylcyklázou savců typu II. Tyto dva různé izozymy se však stále podobají v tom, že superpozice jednoho na druhý má značný přesah, přičemž střední kvadratická odchylka (rmsd) je menší než 1,76Å mezi 79 % všech . Pozoruhodným rozdílem katalytických domén Rv1264 a adenylylcyklázy typu II je jejich relativní velikost; Rv1264 nemá dimerizační rameno a několik jeho smyček bylo zkráceno. To má za následek, že katalytická doména adenylylcyklázy Rv1264 se sdružuje jako dimer s menší plochou rozhraní než adenylylcykláza savčího typu II s plochami rozhraní 1900Å2 a 3800Å2. Aktivní místa adenylylcyklázy Rv1264 a adenylylcyklázy savců typu II jsou ještě konzervativnější; v aktivním místě mají rmsd pouze 0,69Å a v aktivním místě mají rmsd 1,17Å.

Všechny výše uvedené strukturní informace pro C-terminální katalytickou doménu platí pouze tehdy, když je enzym v aktivním stavu. V neaktivním stavu má enzym rozložené aktivní místo, a proto nemá katalytickou aktivitu. Ve vztahu k fixním N-terminálním doménám se každá z C-terminálních monomerních domén může transponovat až o 6Å a rotovat o 55o. Tato masivní změna terciární struktury C-terminálních domén rozkládá aktivní místo a přesouvá katalytické zbytky až o 25Å od jejich katalyticky aktivní polohy. Nejenže je aktivní místo v C-terminální doméně narušeno, ale plocha rozhraní mezi oběma monomery se zmenší z 1900Å2 na 930Å2.

α1-přepínač

se nachází uvnitř C-terminální katalytické domény a existuje jako kompaktní α-helix, když je enzym v aktivním stavu,. Při inaktivaci se α-helikální konformace α1-přepínače stává nestabilní a mění se v náhodnou spirálu. Protože se tento přepínač nachází v těsné blízkosti aktivního místa, výrazná změna struktury značně naruší aktivní místo a způsobí, že je enzym neaktivní.

Tato struktura je zachována u savčích adenylylcykláz, kde funguje jako přispěvatel pro vazebné místo βγ-fosfátů substrátu ATP. Funguje také v regulaci savčích adenylylcykláz, spolu s dalším α-helixem tvoří vazebné místo pro podjednotky Gsα a Giα G proteinu, které regulují aktivitu adenylylcykláz.

N-terminální regulační doména

N-terminální doména funguje v regulaci; má jedinečný mechanismus, který na základě pH okolního roztoku určuje, zda bude enzym aktivní, či nikoli. Každý monomer v katalyticky aktivním dimeru má deset , když jsou dimerizovány, tvoří strukturu podobnou disku. Jedna molekula se váže v hydrofobní kapse. Funkce tohoto polyethylenglykolu se zdá být strukturní, nicméně jeho specifické umístění a pohyb mezi aktivní a neaktivní formou enzymu naznačuje, že může fungovat také při detekci změn hydrofobicity prostředí.

Přepínač αN10

se nachází v oblasti linkeru a jeho konformační změna má drastičtější vliv na celkový enzym než přepínač α1. Když je enzym aktivní, tvoří αN10-přepínač náhodná spirála s krátkým α-helixem; tato konformace umožňuje pouze slabou interakci mezi N-koncovou regulační doménou a C-koncovou katalytickou doménou, což umožňuje enzymu vykazovat katalytickou aktivitu. Tato šroubovice se může prodloužit až o 24Å, což odděluje monomerní C-terminální katalytické domény dimeru. Toto oddělení domén snižuje plochu jejich rozhraní a transponuje zbytky; jak bylo uvedeno výše, tyto změny vedou k inaktivaci enzymu, a proto je hlavní charakteristikou neaktivního stavu enzymu prodloužený přepínač αN10. Jak se αN10-přepínač prodlužuje, pohybuje se směrem ven a pentaetylenglykol se přesouvá do nově vytvořené dutiny u šroubovice αN10. To dále podporuje myšlenku, že pentaetylenglykolový ligand funguje nejen pro strukturu, ale také pro regulaci.

Regulace podle pH

Na začátku linkerové oblasti se nachází zbytek , který má značný vliv na regulaci podle pH. Při bazickém pH nemá zbytek žádný náboj a má minimální interakce se dvěma katalyticky důležitými zbytky , které leží 14 Å a 21 Å od jejich katalyticky aktivních pozic. Enzym je v tomto stavu neaktivní nejen kvůli zbytkům Lys 261 a Asp 312, ale také kvůli rozpadu dalších hlavních strukturních složek katalytického místa. Při kyselém pH se Rv1264 stává aktivním (optimální pH ~ 5,8) a jeho aktivita se zvyšuje až 40krát. Při tomto kyselém pH se His 192 stává protonizovaným a kladně nabitým, což způsobuje významné strukturní změny v celém proteinu, včetně kompakce přepínače αN10 i přepínače α1, kontrakce šroubovice α4, což následně způsobuje translokaci paraethylenglykolového ligandu. Kladně nabitý His 192 elektrostaticky odpuzuje zbytky Lys 261 a Asp 312, což je spolu s dalšími strukturními změnami přesouvá o 14 Å, resp. 21 Å do jejich katalyticky aktivních poloh.

, zbytek, který prostřednictvím vodíkových vazeb organizuje mnoho zbytků důležitých v interakci C-konec – N-konec, je rovněž důležitý pro regulaci. Když je tento zbytek mutován, regulace založená na pH se ztratí a enzym je neustále aktivní.

Mnoho dalších zbytků také přispívá k regulaci podle pH; jsou to elektrostatické interakce a vodíkové vazby na rozhraní C-terminální – N-terminální domény, které umožňují adenylylcykláze Rv1264 být citlivá na pH.

Biologická úloha

M. tuberculosis je patogenní bakterie, a proto čelí celé řadě imunitních reakcí hostitele, které se jí snaží zbavit. Jedním z obranných mechanismů hostitele, kterým M. tuberculosis čelí, je okyselení, s nímž se setkává ve fagolyzozomech. Schopnost rozpoznat toto kyselé prostředí a mít na něj vhodnou odpověď může M. tuberculosis výrazně pomoci při infikování hostitele. Při zvýšené hladině cAMP dochází ke zpoždění acidifikace ostatních struktur a zvýšená hladina cAMP aktivuje proteiny receptoru cAMP, které zase regulují transkripci.

3D struktury adenylylcyklázy

3D 3D struktury adenylylcyklázy

.