Adventivní kořeny
Metody zakořeňování mikroodrostků
Pokud mikroodrostky nevytvářejí kořeny ve fázi množení, musí být speciálně ošetřeny, aby iniciovaly a vypěstovaly adventivní kořenový systém. Mikropřírůstky mohou být zakořeněny in vitro a poté aklimatizovány v okolním prostředí, nebo mohou být zakořeněny ex vitro, čímž se kombinuje zakořenění a aklimatizace.
Snadnost a úspěšnost zakořenění určuje, která metoda se použije u konkrétního kultivaru. Nákladově efektivnější metodou je zakořeňování mikrořízků ex vitro. Zakořeňování ex vitro ušetří dodatečný přenos in vitro do zakořeňovacího média a urychlí aklimatizaci, takže mikropropagace je efektivnější. Zakořeňování in vitro se používá, pokud chybí zařízení pro zakořeňování ex vitro a aklimatizaci, pokud je úspěšnost zakořeňování ex vitro nízká a podle uvážení vedoucího laboratoře.
Zakořeňování in vitro. Při použití in vitro podmínek pro podporu iniciace kořenů a raného vývoje lze snadno měnit složky média a inkubační podmínky. Složení živných solí může zůstat stejné, může být změněno nebo sníženo, často na poloviční sílu makrosolí, a relativní vlhkost může být snížena použitím ventilovaných víček (obr. 5). Pro zakořenění lze změnit podmínky inkubace světelné a teplotní kultury. Mnoho mikrořízků se pro iniciaci kořenů inkubuje po určitou dobu ve tmě a poté se přenesou do osvětlených podmínek.
Obrázek 5. Způsob inkubace a inkubace mikrořízků. Chirurgická mikroporézní páska zajišťuje větrání této nádoby se zakořeňovanými výhonky; to pomáhá snižovat relativní vlhkost a připravuje nové rostliny na skleníkové prostředí.
Zakořeňovací živná půda, na kterou se umístí čerstvě nařezané mikro výhonky, obvykle obsahuje auxin. Obvykle se do média před autoklávováním přidávají mikromolární koncentrace IBA a/nebo NAA. Koncentrace auxinu závisí na druhu a kultivaru. Tyto informace jsou obvykle dostupné online pomocí vědeckého vyhledávače, například Google Scholar http://scholar.google.com/. Obvykle název rostliny, slova „vitro“ a „root“ (nebo adventivní kořen) ve vyhledávacím řetězci poskytnou konkrétní informace. Pokud literatura pro určitou rostlinu chybí, použijte při vyhledávání blízké příbuzné rostliny, abyste zjistili, jak reagovaly.
Protože je známo, že stejné koncentrace auxinu, které stimulují iniciaci adventivních kořenů, mohou inhibovat vývoj kořenů, někteří používají přístup založený na dvou médiích. Když byly mikroodrostky Cotinus coggygria na médiu obsahujícím 10 µM IBA po dobu 5 dnů před přesunem na médium bez auxinu, zakořenilo 100 %; zatímco při kontinuální kultuře na médiu s 10 µM IBA zakořenilo pouze 40 % (Metivier et al., 2007). Padilla a Burgos (2010) kultivovali olivové mikroodrostky na médiu obsahujícím až 4 µM IBA po dobu 2 týdnů s následným přenesením na bazické médium bez auxinu, které vedlo k zakořenění 65-93 % v závislosti na kultivaru.
V některých případech byly roztoky IBA aplikovány na mikroodrostky jako bazický dip po dobu jedné minuty nebo déle. Tsvetkov et al. (2007) dosáhli nejlepšího zakořenění mikroodrostků Sorbus domestica, když je před umístěním na bazální médium ponořili na 80 s do roztoku IBA o koncentraci 14,8 µM.
Temno během zakořeňování nebo před ním může zvýšit úspěšnost zakořeňování a synchronicitu zakořeňování mezi mikroodrostky. Etiolizace, vývoj výhonů bez světla, zvýší buněčnou kompetenci pro adventivní zakořenění (Murray et al., 1994). Při etiolizaci ořechových mikrořízků bylo zakořenění lepší s rychlejším vznikem kořenů než ze zelených výhonků (Leslie et al., 2010); etiolizované výhonky však byly křehké a vyžadovaly opatrnější zacházení.
Kultivace zelených mikrořízků na zakořeňovacím médiu ve tmě po relativně krátkou dobu může zakořenění výrazně zlepšit. Období ve tmě po dobu 4-7 dní na poloviční síle média Murashige a Skoog obsahujícího 1 µM floroglucinolu a 1,4 µM IBA s následnou inkubací za světla vedlo k lepšímu zakořenění mikrořízků jabloně ‚Delicious‘, než pokud byly kultivovány pouze na světle nebo ve tmě po delší dobu (Zimmerman, 1984). Při kultivaci mikroodrostků jabloně ‚MM106‘ na médiu se 4 µM IBA ve tmě po dobu 0-10 dnů bylo histologickým vyšetřením zjištěno, že k indukci kořenů dochází během prvních 3 dnů nebo méně ve tmě a že kuželovitá kořenová primordia jsou viditelná do 7. dne (Naija et al., 2008). Načasování ošetření ve tmě je kritické a může být nutné ho určit pro každou plodinu nebo genotyp, nicméně může výrazně zvýšit úspěšnost zakořenění.
Některé druhy nejlépe zakořeňují, pokud jsou vrcholky mikrořízků osvětleny a bazální část v médiu je ve tmě, podobně jako se zakořeňují makrořízci ve skleníkovém médiu za mlhy. Ztmavení média lze dosáhnout natřením vnější strany kultivačních nádob na černo až mírně nad úroveň média a zakrytím média sterilním polykarbonátovým granulátem nebo jinou látkou vylučující světlo nebo ztmavením samotného média přidáním aktivního uhlí. Někdy se pro zakořeňování in vitro po navlhčení živného média používá skleníkové médium, například vermikulit, které rovněž vylučuje světlo.
Ukázalo se, že ztmavení pouze základů mikrořízků zvýšilo zakořeňování mandloní, broskvoní a oliv (Rugini, 1988) a jabloní (Mencuccini a Rugini, 1993) ve srovnání s kontrolami inkubovanými buď ve tmě, nebo pod světlem. V samostatné studii však Mencuccini a Rugini (1993) uvedli, že ztmavení báze mělo malý vliv na zakořeňování mikrořízků mandlí, meruněk, kaštanů, jojoby a oliv a bylo inhibiční pro ořech. Pokud je tedy úspěšnost zakořenění nižší, než je žádoucí, může být bazální ztmavení užitečné.
Zakořenění ex vitro. Pokud je procento zakořenění podobné, může být zakořenění ex vitro účinnější a nákladově efektivnější než zakořenění in vitro (Leva, 2011). Náklady jsou při zakořeňování in vitro vyšší kvůli přísadám, době přípravy, autoklávování médií, práci při přenášení a přemisťování kultur a inkubačnímu prostoru. Přesun do skleníku je mezi zakořeňováním in vitro a ex vitro podobný a doba přesazování může být podobná nebo pomalejší, pokud jsou na mikrořízcích kořeny (obr. 4 a 6). Efektivity se dosahuje zakořeňováním ex vitro. Bylo zjištěno, že kvalita kořenů mikroplodů ořešáku je lepší, když se kořeny tvoří ex vitro za mlhy než in vitro v gelovém médiu (Leslie et al., 2010).
Obrázek 6. V případě, že se kořeny tvoří ex vitro za mlhy, je kvalita kořenů lepší než in vitro v gelovém médiu (Leslie et al., 2010). (a) a (b) In vitro zakořeněné mikropropagované sazenice třešně připravené k přesazení do rašelinového skleníkového média sphagnum před umístěním do prostředí s vysokou relativní vlhkostí pro aklimatizaci. (c) Vysazení plantáží třešně jako první krok aklimatizace ve skleníku. (d) Plantážky ořešáku sázené do roviny před umístěním za vysoké relativní vlhkosti ve skleníku.
Zakořenění ex vitro může být vylepšením zakořenění in vitro. Ačkoli in vitro mikroodrostky Gardenia jasminoides zakořenily za 10 dní ve srovnání se 14 dny u ex vitro mikroodrostků, všechny ex vitro zakořeněné mikroodrostky přežily aklimatizaci ve srovnání s 80 % přežití u in vitro zakořeněných mikroodrostků (Hatzilazarou et al., 2006). Horší přežívání mikroodrostků zakořeněných in vitro ve srovnání s mikroodrostky zakořeněnými ex vit bylo zaznamenáno také u ořešáku vlašského (Leslie et al., 2010).
Možná je nutné ošetřit mikroodrostky auxinem před výsadbou do zakořeňovacího média pro zakořenění ex vitro. Mikrovýhonky pistácie ošetřené 2% IBA v mastku zakořenily ex vitro na 79 % ve srovnání se 48 % zakořeněním u kontrol (Benmahioul et al., 2012).
Zlepšení zakořenění ex vitro lze dosáhnout také pomocí auxinu aplikovaného ve formě tekutého dipu naneseného na bazální část mikrovýhonků. Patnáctiminutový puls v 250 µM IBA způsobil zakořenění 90 % mikrovýhonků dřeviny Melia azedarach ve srovnání s nezakořeněním kontrolních mikrovýhonků (Husain a Anis, 2009). Dvouhodinový ponor do vodného roztoku 588 µM IBA způsobil zakořenění 90 % mikroodrostků Malus zumi ve srovnání s 20 % zakořeněním kontrol (Xu et al., 2008).
Možná díky návratu k juvenilitě může prodloužení doby množení in vitro zvýšit zakořenění mikroodrostků. Leva a Petruccelli (2012) testovali zakořeňování až v sedmi subkulturách a zjistili, že zakořeňování je nejlepší po sedmé subkultuře.
Způsob zakořeňování mikrořízků určují prostory, druh, způsob přepravy, požadavky zákazníků a preference manažerů. Druhy, které zakořeňují velmi snadno nebo zakořeňují během fáze proliferace výhonů, mohou být rychle aklimatizovány na prostředí ex vitro. Právě náročným druhům je věnována zvláštní pozornost, pokud jde o osvětlení, ošetření auxiny, zakořeňování in vitro nebo ex vitro a další faktory. Klony, které se obtížně zakořeňují, vyžadují od zákazníků vyšší ceny, protože zakořeňování je překážkou efektivní produkce. Zakořeňování lze zlepšit, pokud se k němu přistupuje jako k vícestupňovému procesu získávání kompetence, iniciace kořenů a následného růstu kořenů. Všechny tyto kroky je třeba vzít v úvahu a zabývat se jimi, zejména u obtížněji zakořeňujících klonů.