Agonisté alfa-2 adrenergních receptorů blokují stresem vyvolané obnovení vyhledávání kokainu

Experiment 1: Vliv klonidinu, lofexidinu a guanabenzu na uvolňování NE vyvolané otřesem nohou

Subjekty

Subjekty byli samci potkanů Long-Evans (Charles River, Quebec) o hmotnosti 300-350 g na začátku experimentu. Po celou dobu experimentu byla zvířata umístěna v místnosti s řízenou vlhkostí a teplotou v kolonii s obráceným rozvrhem světla a tmy (světlo 1730-0530 hodin) a měla volný přístup ke standardnímu krmivu a vodě pro laboratorní potkany. Experimentální postupy se řídily pokyny CCAC a byly schváleny výborem pro péči o zvířata Concordia University.

Operace

Před operací byli potkani anestetizováni pentobarbitalem sodným (65 mg/kg, i.p.) a byl jim aplikován atropin sulfát (0,6 mg/ml; 0,2 ml/potkan, SC) a antibiotikum (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/potkan, i.m.). Pro následné zavedení dialyzačních sond byly implantovány vodicí kanyly (20 gauge; Plastics One); jedna byla umístěna do PFC a jedna do AMG v opačných hemisférách. Zvířata použitá ke studiu účinků guanabenzu dostala jednu vodicí kanylu namířenou do PFC. Hemisféra, do které byly příslušné vodicí kanyly implantovány, byla u všech ošetření vyvážená. Použité stereotaxické souřadnice (vzhledem k bregmě a povrchu lebky) byly následující: AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos a Watson 1997). Po zavedení se dřík dialyzační sondy vysunul 1 mm od vodicích kanyl. Implantované vodicí kanyly byly k lebce připevněny šrouby z nerezové oceli a dentálním cementem. Vodicí kanyly byly uzavřeny šroubovacími obdurátory. Všechna zvířata byla před testováním vrácena do koloniální místnosti na dobu zotavení ne kratší než 1 týden.

Mikrodialýza

Mikrodialýza byla prováděna ve čtyřech šestihranných testovacích komorách (42 × 39 × 33,5 cm) postavených z plexiskla s dřevěnými stropy a podlahou z nerezových tyčí. Kolem každé komory byly zataženy tmavé závěsy a osvětlení zajišťovaly v obráceném cyklu stropní žárovky (15 W). Dialyzační sonda se skládala z 1,8 mm (AMG) nebo 3,5 mm (PFC) dlouhé polopropustné dialyzační membrány (Spectra/Por; 240 μm o.d., 13000 M.W. cutff), uzavřené na jednom konci a připojené na druhém konci k 19 mm dlouhé trubce z nerezové oceli o průměru 26 mm. Druhý konec hřídele z nerezové oceli byl spojen 40 až 50 cm dlouhou hadičkou PE-20 s infuzním otočným zařízením umístěným nad testovací komorou, které bylo následně připojeno hadičkou PE-20 k infuzní pumpě s proměnlivou rychlostí. Vnitřní částí sondy procházela trubička z taveného křemíku o malém průměru, jejíž jeden konec se nacházel 0,5 mm od špičky sondy a druhý konec vycházel z PE trubičky 35 cm pod infuzním otočným kloubem. Vnější délka hadičky PE-20 byla chráněna před poškozením ocelovými kryty pružin. Sondy byly navrženy tak, aby celá délka polopropustné membrány zasahovala pod hrot vodicí kanyly.

K vyšetření účinků jednotlivých testovaných léčiv byly použity samostatné čety zvířat. V rámci každého družstva byla každému zvířeti náhodně přiřazena podmínka léčby. Zvířata, která dostala injekce s vehikulem, byla vedena v každém družstvu, ale pro statistickou analýzu byla sloučena do jedné skupiny. Konečné velikosti skupin (PFC/ AMG) byly následující: vehikulum (n = 15/17), klonidin 20 μg/kg (n = 7/6), klonidin 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidin 75 μg/kg (n = 6/6), lofexidin 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640 μg/kg (n = 4, PFC). S výjimkou zvířat, která dostávala guanabenz, byly všechny subjekty dialyzovány dvakrát, jednou v PFC a jednou v AMG s odstupem 3-4 týdnů mezi testy.

Sondy byly zavedeny den před zahájením mikrodialyzačního testování. Aby se zabránilo okluzi, byl přes noc perfundován umělý CSF (145 mM Na+, 2,7 mM K+, 1,22 mM Ca2+, 1,0 mM Mg2+, 150 mM Cl-, 0,2 mM askorbát, 2 mM Na2HPO4, pH 7,4 ± 0,1) rychlostí 0,06 μl/min. Odběr vzorků dialyzátu a sledování aktivity začalo následující ráno. Průtok dialyzátu byl zvýšen na 0,6 μl/min a každých 20 min byly odebírány základní vzorky dialyzátu (∼12 μl/vzorek). Vzorky byly odebírány, dokud nebylo dosaženo stabilní základní linie, definované jako minimálně tři po sobě jdoucí vzorky, ve kterých se hladiny NE v dialyzátu lišily o ±10 %. Po stanovení stabilních výchozích hladin NE dostala všechna zvířata i.p. injekci (1 ml/kg) příslušného léčiva nebo vehikula, která byla podána 40 minut před 10minutovým šokem nohou. Rázy byly podávány podle variabilního časového plánu v průměrném intervalu 40 sekund (rozmezí 10-70 sekund); každý šok (0,6 mA) trval 0,5 sekundy. Vzorky byly odebírány po dobu dalších 120 minut (6 vzorků). Vzorky byly okamžitě analyzovány pomocí jednoho ze dvou podobných systémů vysokoúčinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí (HPLC-EC). Vzorky (10 μl) byly vloženy na kolony s reverzní fází (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) přes manuální vstřikovací porty (Reodyne 7125; 20 μl smyčka); redukční a oxidační proudy pro NE, dihydroxyfenyloctovou kyselinu (DOPAC), 5-hydoxyindoloctovou kyselinu (5-HIAA) a homovanilovou kyselinu (HVA) byly měřeny pomocí dvoukanálových coulometrických detektorů ESA (Coulochem 5100, s kondicionační kyvetou model 5021 a analytickou kyvetou model 5011, Sci. Products & Equipment). Proudy pro NE byly měřeny nezávisle na proudech pro DOPAC a HVA pomocí samostatných kanálů detektorů Coulochem. Mobilní fáze (octan sodný 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, 5% acetonitril, upravený na pH 3,7 pomocí ledové kyseliny octové) cirkulovaly v každém uzavřeném systému průtokem 1,4 ml/min pomocí čerpadel Waters 510 HPLC. Získané píky pro NE, DOPAC a HVA byly integrovány a kvantifikovány pomocí systému EZChrom Chromatography Data System (Sci. Products & Equipment). Vzorky dialyzátu od jednotlivých potkanů byly analyzovány vždy stejným systémem HPLC-EC a přiřazení zvířat k jednotlivým systémům bylo ve všech léčebných skupinách vyvážené. Před odběrem vzorků byla z komor odstraněna potrava, ale byla k dispozici hadička na pití vody. Po ukončení testování bylo potvrzení správného umístění sondy určeno vyšetřením 30 μm řezů prořezaných místy umístění sondy obarvených krezilovou violetí.

Experiment 2: Účinky klonidinu na znovunastolení vyvolané nohou a kokainem

Subjekty

Subjekty bylo 25 samců potkanů Long-Evans (Charles River, Quebec) o hmotnosti 350-425 g na začátku experimentu. Zvířata byla chována tak, jak je popsáno v experimentu 1.

Chirurgický zákrok

Zvířata byla připravena k chirurgickému zákroku tak, jak je popsáno v experimentu 1. Do pravé jugulární žíly byl zaveden intravenózní katétr (Dow Corning). Do žíly byla zavedena 3 cm dlouhá silastická hadička (vnitřní průměr 0,30 mm, vnější průměr 0,64 mm), která byla pomocí teplem smrštitelné hadičky spojena s 9 cm dlouhou silastickou hadičkou (vnitřní průměr 0,51 mm, vnější průměr 0,94 mm), která byla zavedena podkožně do horní části lebky. Katétr byl připevněn k žíle hedvábnými stehy a ústil do konektoru (upravená kanyla 22 gauge; Plastics One, Roanoke, VA), který byl připevněn k lebce pomocí klenotnických šroubů a dentálního cementu; na otvor kanyly byla umístěna plastová čepička. Zvířata se po operaci zotavovala 1-2 týdny.

Přístroje

Kamery pro samopodání použité v experimentech byly vybaveny zatahovací pákou (Med Associates, St Albans, VT) a nezatahovací „atrapou“ páky. Obě páky byly umístěny 9 cm nad podlahou. Infuzní pumpa (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) byla aktivována reakcemi na zatahovací neboli „aktivní“ páku. Reakce na atrapu páky byly zaznamenány, ale nevedly k aktivaci pumpy. Roztok léčiva byl podáván po dobu 10 s v objemu 65 μl. Po celou dobu infuze svítilo bílé stimulační světlo těsně nad aktivní páčkou a během této doby byly zaznamenány další reakce, které však nevedly k reaktivaci pumpy. Každá komora pro samopodání byla vybavena zařízením pro dodávání konstantního proudu, přerušovaného, nevyhnutelného, elektrického rázu nohou prostřednictvím skrambleru na podlahu mřížky (generátor Grason-Stadler #E1064GS nebo Med Associates). Nožní šok byl dodáván po dobu 15 minut podle variabilního časového plánu v průměrném intervalu 40 sekund (rozmezí 10-70 sekund). Každý šok (0,6 mA) trval 0,5 sekundy. Tato intenzita nožních šoků byla pomocí našeho přístroje shledána jako minimální potřebná k vyvolání spolehlivé reinstalace.

Drogy

Kokain HCl byl získán od společnosti BDH Chemicals (Toronto, Kanada) a byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku. Klonidin HCl byl zakoupen od společnosti Sigma (St. Louis, MO) a byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku a aplikován i.p. (0, 20 a 40 μg/kg).

Postup

Fáze 1: Trénink. Potkani byli vycvičeni k samopodávání kokainu HCl (0,5 mg/kg/infuze, i.v.) podle plánu posilování s pevným poměrem 1 během jednoho tříhodinového sezení samopodávání denně. Každý den byla polovina zvířat přivedena do operantních komor na sezení samopodávání ráno, přibližně tři hodiny po zhasnutí světel, a polovina zvířat byla přivedena do komor odpoledne, přibližně sedm hodin po zhasnutí světel. Skupina zvířat zařazených do ranních a odpoledních sezení se denně střídala tak, aby na konci výcviku všechna zvířata absolvovala stejný počet sezení samosprávy v obou časech. Bylo důležité, aby všechna zvířata měla podobné zkušenosti se samopodáním brzy a pozdě během dne, protože během fáze 2 všechna zvířata absolvovala dopolední sezení s vyhasínáním, po nichž následovalo testovací sezení, které obvykle probíhalo odpoledne. Na začátku každého sezení se před zavedením výsuvné páky do klece rozsvítilo na 10 sekund červené světlo domečku. Světlo těsně nad aktivní pákou svítilo po dobu prvních 30 sekund po zavedení páky. Světlo v domečku zůstalo rozsvícené po celou dobu sezení. Jak již bylo uvedeno, reakce na aktivní páku vedly k aktivaci infuzní pumpy a rozsvícení světla nad pákou po dobu 10 sekund podávání léku. Další stisknutí páky během doby podávání léku bylo zaznamenáno, ale nevedlo k opětovné aktivaci pumpy. Tréninkové podmínky trvaly 10 až 12 dní. Na konci tréninku byla zvířata ponechána nerušeně v koloniálu po dobu 7 až 13 dní. Následně proběhlo vyhasínání a testování. V tomto experimentu a v experimentu 3B byly skupinám zvířat přiřazeny různé dávky testovaných léčiv. Všechna zvířata v každé skupině pak byla podrobena třem testovacím podmínkám: fyziologickému roztoku, kokainu a šoku nohou.

Fáze 2: Extinkce a testování. Během extinkce a testování, které probíhaly čtyři po sobě jdoucí dny, byla zvířata umístěna 24 hodin denně v komorách pro samopodávání. Potrava a voda byly zvířatům volně k dispozici, s výjimkou denních relací extinkce a testování. Zvířata byla přivedena do komor večer před prvním dnem extinkce a testování. Vzhledem k tomu, že během tréninkové fáze byly každý den provozovány dvě samostatné skupiny potkanů, byla jedna skupina zvířat testována v prvních čtyřech dnech fáze 2 a druhá skupina zvířat byla testována v následujících čtyřech dnech. Během extinkce a testování byly zachovány všechny podmínky, které byly přítomny během tréninku, s výjimkou toho, že stisknutí páky nevedlo k infuzi kokainu.

V tomto a všech následujících reinstitučních experimentech bylo zvířatům poskytnuto několik denních 1hodinových extinkčních sezení oddělených mezidobími, ve kterých byla páka stažena. První den byla zvířatům poskytnuta čtyři extinkční sezení; ve dnech 2-4 byla zvířatům poskytnuta dvě až tři extinkční sezení, která postačovala k vytvoření základní úrovně reagování 15 nebo méně reakcí za jednu hodinu, po nichž následovalo 180minutové testovací sezení. Doba trvání mezidobí byla pro každý experiment konstantní a odpovídala prodlevě potřebné pro vstřebání léčiva mezi injekcemi před léčbou a začátkem testu. V tomto experimentu byla délka intervenčních období 40 min.

Při testu byly oddělené skupiny zvířat předem ošetřeny buď 0, 20, nebo 40 μg/kg i.m. klonidinu před každým ze tří testů na reinstalaci (fyziologický roztok, kokain a footshock), které byly podány v po sobě jdoucích dnech a ve vyváženém pořadí. Klonidin byl podán 40 minut před vložením páky. Při primingových testech s fyziologickým roztokem a kokainem dostala zvířata 5 minut před zavedením páky i.p. injekci fyziologického roztoku nebo kokainu (20 mg/kg), která nebyla kontingentní. Při testech nohou byla zvířata vystavena 15minutovému krátkému přerušovanému stresu nohou bezprostředně před zavedením páky. Testovací sezení trvala 3 hodiny. Dávka kokainu a parametry footshocku byly zvoleny na základě předchozích prací této laboratoře (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). Dávky klonidinu byly zvoleny na základě reinstitučních experimentů, které jsme prováděli s potkany trénovanými na heroin (Shaham et al. 2000).

Experiment 3A: Protože farmakologický profil lofexidinu není tak dobře charakterizován jako farmakologický profil klonidinu, byl proveden experiment s cílem zjistit, zda a v jakých dávkách lofexidin vyvolává výkonnostní deficity. Na základě výsledků získaných v tomto experimentu byly zvoleny dávky v testech pro obnovení činnosti.

Subjekty

Subjekty bylo 8 samců potkanů Long-Evans (Charles River, Quebec) o hmotnosti 400-550 g na začátku experimentu. Potkani byli dříve použiti v experimentu zaměřeném na studium obnovení vyhledávání sacharózy vyvolaného údery nohou (Buczek et al. 1999). Zvířata byla chována za podobných podmínek, jaké byly popsány v experimentu 1.

Přístroje

Každá komora pro samopodávání byla vybavena dvěma stacionárními pákami, symetricky umístěnými na jednom bočním panelu, 5 cm nad podlahou. Reakce na jednu páku, „aktivní“ páku, aktivovaly pumpu (Razel Sci. Stamford, CT). Reakce na druhou páku, „atrapu“, byly zaznamenány, ale byly bez následků. Aktivace pumpy vedla k 20sekundové dodávce 0,18 ml roztoku sacharózy do nádobky na kapky kapaliny umístěné mezi oběma pákami. Po celou dobu podávání sacharózy svítilo bílé stimulační světlo těsně nad aktivní páčkou a během této doby byly zaznamenány další reakce, které však nevedly k reaktivaci pumpy.

Drogy

Lofexidin HCl velkoryse poskytl Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., Velká Británie. Léčivo bylo rozpuštěno ve fyziologickém roztoku a aplikováno i.p. (0, 80, 120, 160 nebo 200 μg/kg).

Postup

Zvířata, která se již dříve naučila samopodávat sacharózu v jiné studii (Buczek et al. 1999), následně absolvovala pět sezení v průběhu pěti po sobě jdoucích dnů, při nichž si sama podávala 30% roztok sacharózy podle rozpisu FR-1. V průběhu pěti sezení se zvířata naučila podávat sacharózu. V následujících denních sezeních byl zvířatům 60 minut před začátkem sezení samopodávání podán buď vehikulum (0 μg/kg), nebo lofexidin (80, 120, 160 nebo 200 μg/kg, i.p.). Všechna zvířata dostala všechny dávky lofexidinu ve vyváženém pořadí; nejvyšší dávka lofexidinu byla testována dvakrát. Po každém sezení, při kterém byla zvířata léčena lofexidinem, následovalo sezení s fyziologickým roztokem, aby se minimalizovala možnost přenosu účinků léčiva.

Experiment 3B: Účinky lofexidinu na znovunastolení vyvolané nárazem nohou a kokainem

Subjekty

Subjekty bylo 49 samců potkanů Long-Evans (34 od Charles River, Quebec; 15 od Harlan Sprague Dawley, USA), kteří na začátku experimentu vážili 350-400 g. Potkani byli testováni na přítomnost kokainu. Zvířata byla chována tak, jak je popsáno v experimentu 1. Mezi zvířaty od obou dodavatelů nebyly v žádné fázi experimentu zjevné rozdíly v reakcích.

Postup

Fáze 1: Trénink. Zvířata byla vycvičena k samopodávání kokainu za podmínek popsaných v experimentu 2.

Fáze 2: Extinkce a testování. V tomto experimentu trvaly intervenční periody, jak je popsáno výše, 60 min. Při testování byly oddělené skupiny zvířat před každým ze tří testů reinstalace (fyziologický roztok, kokain a zátěžový šok nohou), podávaných v po sobě jdoucích dnech a ve vyváženém pořadí (viz experiment 2), předem ošetřeny buď 0, 50, 100, 150 nebo 200 μg/kg i.m. lofexidinu. Lofexidin byl podán 60 minut před zavedením páky. Testovací sezení trvala 3 hodiny. Dávky lofexidinu byly zvoleny na základě výsledků získaných v experimentu 3A.

Experiment 4: Účinky guanabenzu na znovunastolení vyvolané nohou a kokainem

Subjekty

Subjekty bylo 18 samců potkanů Long-Evans (Charles River, Quebec) o hmotnosti 350-400 g na začátku experimentu. Zvířata byla chována tak, jak je popsáno v experimentu 1.

Lék

Guanabenz byl zakoupen od firmy Sigma (St. Louis, MO) a byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku a aplikován i.p. (0, a 640 μg/kg).

Postup

Fáze 1: Trénink. Zvířata byla vycvičena k samopodávání kokainu za podmínek popsaných v experimentu 2.

Fáze 2: Extinkce a testování. V tomto experimentu trvaly intervenční periody, jak je popsáno výše, 60 min. Při testování byla zvířata předem ošetřena 0 nebo 640 μg/kg guanabenzu, i.p., před každým ze dvou testů reinstalace (bez šoku nohou, šok nohou nebo fyziologický roztok, kokain), podaných v po sobě následujících dnech (viz experiment 2). Guanabenz byl podán 60 minut před zavedením páky. Testovací sezení trvala 3 hodiny. Dávka guanabenzu byla zvolena na základě jeho nahraditelnosti 40 μg/kg klonidinu v postupu diskriminace drog (Bennett a Lal 1982).

Statistické analýzy

Mikrodialyzační data byla analyzována pomocí ANOVA se smíšenými faktory pro koncentraci extracelulárního NE ve 20minutových vzorcích dialyzátu; faktorem mezi subjekty byla dávka klonidinu (0, 20, 40 μg/kg), lofexidinu (0, 75 nebo 150 μg/kg) nebo guanabenzu (0 nebo 640 μg/kg) a opakovaným měřením byl čas. Významné interakce mezi časem a dávkou byly podrobeny jednosměrné ANOVA pro faktor dávky v konkrétních časových bodech. V případě potřeby byly provedeny post hoc testy (Fisherův LSD, p < .05) pro porovnání vehikula (0 μg/kg) s podmínkami léčiva.

Dvěma závislými mírami v testech na obnovení byly počet odpovědí na aktivní páce (infuze + odpovědi po uplynutí času) a počet odpovědí na neaktivní páce za tři hodiny. Všechny údaje o chování jsou prezentovány jako střední hodnoty ± SEM. Vzhledem ke značné variabilitě v počtu reakcí provedených v různých testech reinstituce byly v případě potřeby použity neparametrické statistiky pro příbuzné (Friedmanova a Wilcoxonova) a nepříbuzné (Kruskal-Wallisova a Mannova-Whineyho) vzorky.

V případě sacharózové studie (experiment 3A) byly závislými mírami počet reakcí na aktivní (posílené + timeout reakce) a neaktivní páce a počet získaných posílení. Byly provedeny opakované měření ANOVA s dávkou jako vnitrosubjektovým faktorem. V případě potřeby byly provedeny post hoc testy (Fisherovo LSD, p < .05) pro porovnání podmínek vehikula (0 μg/kg) a léčiva.

.