Agregace amfolinu na heparinu a jiných kyselých polysacharidech při izoelektrické fokusaci

Mechanismus komplexace amfolinu s heparinem v rozmezí pI 3,5-5 při izoelektrické fokusaci byl zkoumán technikou vazby barviva při různých hodnotách pH v roztoku. Při pH 6,7 nedochází k žádné významné interakci mezi heparinem a amfolinem. Při pH 5,1 dochází ke slabé nebo selektivní vazbě a při pH 3,5 k velmi silné interakci. V posledně jmenovaném systému se složky Amfolinu zřejmě chovají jako polykationty díky uspořádanému sledu kladných nábojů, které jsou od sebe vzdáleny vždy dvě methylenové skupiny, což podporuje silnou vazbu na polyanionty. Kromě toho se zdá, že existují různé stechiometrie pro silnou vazbu mezi heparinem a amfolínem v závislosti na jejich relativním množství. Předpokládá se, že při nízkém poměru heparinu k amfolinu (přebytek amfolinu) je agregace kolmá na heparinový řetězec, přičemž koncový amonný náboj každé molekuly amfolinu neutralizuje jeden negativní náboj podél molekuly heparinu; při vyšších poměrech (přebytek heparinu) je vázaný segment amfolinu uspořádán rovnoběžně s molekulou heparinu, takže v průměru jedna složka amfolinu neutralizuje přibližně tři negativní náboje. Páskování heparinu při izoelektrické fokusaci v rozmezí pH 3,0-4,5 lze vysvětlit agregací různých složek na heparinu v množství závislém na čistém náboji amfolinu při daném pH a na měnících se stechiometriích v závislosti na změně poměru heparinu a amfolinu podél gradientu pH. Vazba Amfolinu na polygalakturonát byla rovněž prokázána v přebytku Amfolinu v rozmezí pH závislém na stupni protonizace karboxylových skupin tohoto kyselého polysacharidu a také na čistém kladném náboji Amfolinu. Agregace pozorovaná při pH 4,2-4,5 vedla k předpovědi a následnému prokázání, že polygalakturonát bude rovněž vykazovat vazbu při isoelektrické fokusaci. To podporuje hypotézu, že agregace amfolinu na polyanionech s dostatečnou hustotou náboje je obecný jev, který může vést k falešnému páskování určitých polymerů v příslušných rozmezích pH při izoelektrické fokusaci. Na základě jejich chování při isoelektrické fokusaci při pH 3,0-4,5 se zdá, že síla agregace studovaných polyaniontů je heparin A = heparin B větší než polyglutamát větší než karboxylem redukovaný heparin B větší než polygalakturonová kyselina.