AmpR zvyšuje virulenci karbapenem-rezistentní Klebsiella pneumoniae regulací počátečního kroku syntézy kapsuly

Úvod

Klasická K. pneumoniae (cKp) a hypervirulentní K. pneumoniae (hvKp) jsou dva globální patotypy K. pneumoniae, které v současnosti cirkulují.1,2 V Severní Americe a Evropě je většina infekcí vyvolaných K. pneumoniae způsobena izoláty cKp, které jsou nejčastěji oportunními patogeny způsobujícími infekce především ve zdravotnictví u imunokompromitovaných hostitelů. Nejproblematičtější vlastností tohoto patotypu je schopnost získávat stále větší počet prvoků, které propůjčují antimikrobiální rezistenci. Karbapenem rezistentní K. pneumoniae (CRKP) spojená s karbapenemázami kódovanými plazmidy představuje výraznou klinickou výzvu a způsobuje invazivní infekce s vysokou mortalitou.3,4

Zprávy z Tchaj-wanu popisují jedinečný klinický syndrom komunitní, tkáňově invazivní infekce K. pneumoniae u zdravých jedinců, která se často projevuje na více místech nebo se následně šíří, včetně pyogenních jaterních abscesů.5,6 Pro odlišení tohoto patotypu od cKp byl označen jako hvKp a výskyt infekcí způsobených hvKp se v posledních třech desetiletích v asijských tichomořských zemích neustále zvyšuje.7-11 hvKp je obvykle citlivý na antimikrobiální látky, ale byla zjištěna jeho rezistence, a dokonce byl hlášen izolát cKp s extenzivní lékovou rezistencí (XDR), který získal část plazmidu virulence hvKp a způsobil fatální nozokomiální epidemii.12-15

Charakteristikou, která byla původně považována za citlivou a specifickou pro izoláty hvKp, byl hypermukoviskózní fenotyp, který byl definován pozitivním řetězovým testem.16 To však způsobilo určité zmatky, protože ne všechny izoláty hvKp byly určeny jako hypermukoviskózní a některé izoláty cKp tuto charakteristiku měly.17 Nedávno bylo prokázáno, že několik biomarkerů, včetně peg-344, iroB, iucA, plazmidově kódovaných rmpA a rmpA2 a kvantitativní produkce sideroforů, přesně předpovídá izoláty hvKp; tyto biomarkery by mohly být použity k vývoji diagnostického testu pro použití v klinických laboratořích pro optimální péči o pacienty a pro použití v epidemiologickém sledování a výzkumu.18 V této studii jsme však identifikovali novou skupinu nehypermucoviskózních izolátů CRKP, které postrádají většinu genů specifických pro hvKp. Celogenomová asociační studie (Pan-GWAS), analýza proteomu a test virulence na zvířecím modelu odhalily, že AmpR zvyšuje virulenci těchto izolátů regulací iniciace syntézy kapsuly. Navíc jsme také zjistili, že AmpR nesený kmeny K-locus 47 (KL47) v této studii nebyl schopen zvýšit virulenci hypermukózní K. pneumoniae KL1.

Materiál a metody

Klinické izoláty a sběr dat

Nerekonzistující klinické izoláty K. pneumoniae byly získány z rutinně detekovaných a skladovaných vzorků oddělení laboratorní medicíny 5 nemocnic v provinciích Guangdong a Anhui v letech 2018 až 2019. Všechny izoláty byly před použitím skladovány při teplotě -80 °C. Byly získány klinické informace o pacientech. Druhová identifikace a testování antimikrobiální citlivosti byly provedeny pomocí kompaktního systému VITEK-2 (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Francie). Výsledky byly interpretovány v souladu s pokyny zveřejněnými Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; dokument M100-S26).19 Identifikované druhy všech izolátů byly potvrzeny pomocí hmotnostní spektrometrie s asistovanou laserovou desorpcí/ionizací matrice (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Francie). CRKP byla definována jako rezistentní k imipenemu nebo meropenemu.

Hypermukoviskózní fenotypová charakteristika

K identifikaci hypermukoviskózního fenotypu pomocí strunového testu byly izoláty naočkovány na agarové plotny obsahující 5 % ovčí krve a inkubovány při 37 °C přes noc. Provázkový test byl považován za pozitivní, pokud bylo možné vytvořit viskózní provázek delší než 5 mm dotykem jedné kolonie standardní inokulační smyčkou a tahem kolonie vzhůru2.

Celogenomové sekvenování (WGS)

K extrakci genomové DNA (gDNA) byl použit objem 1 ml kultury (optická hustota při 600 nm 0,6) (Sangon, Šanghaj, Čína). gDNA byla sekvenována na sekvenátoru Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, Kalifornie, USA) s použitím párových 150-bp čtení. Sestavení genomu bylo provedeno pomocí de novo programu SPAdes Genome Assembler (verze 3.12.0).20 Na sestavených sekvencích jsme provedli typizaci kapsid pomocí programu Kaptive (verze 0.5.1).21 Geny antimikrobiální rezistence a faktory virulence byly u izolátů identifikovány skenováním kontigů genomu proti databázím ResFinder a VFDB pomocí programu ABRicate (verze 0.8.7). Analýza multilokusové sekvenční typizace (MLST) a genotypizace jádra genomu (cgMLST) byla provedena pomocí programu Ridom SeqSphere+ (verze 5.1.0).22 Komplexní typ (CT) byl definován podle schématu cgMLST K. pneumoniae (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). Konstrukce fylogenetického stromu na základě jednonukleotidových variant (SNV) jádra genomu byla provedena pomocí sady Harvest (verze 1.2) s testem 1000-bootstrap.23 K zobrazení, manipulaci a anotaci fylogenetického stromu byl použit online nástroj iTOL.24 Sekvence genomu jsme anotovali pomocí nástroje Prokka (verze 1.13.3).25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

Pomocí pipeline Roary (verze 3.12.0) jsme vložili anotované sestavy do formátu GFF3 (vytvořeného nástrojem Prokka) a vypočítali pan genom.26 Použili jsme Scoary (verze 1.6.16), abychom vzali soubor z „https://sanger-pathogens.github.io/Roary/“, vytvořili soubor znaků a vypočítali asociace mezi všemi geny v akcesorickém genomu a znaky. Uvedli jsme seznam genů seřazených podle síly asociace s P-hodnotou < 0,01 upravenou pomocí Benjaminiho-Hochbergovy metody pro korekci vícenásobných srovnání.27

Analýza proteomu

Pro extrakci proteinů byl použit objem kultury 1 ml (optická hustota při 600 nm 0,6). Vzorek byl třikrát sonikován na ledu pomocí vysoce intenzivního ultrazvukového procesoru (Scientz) v lyzačním pufru (8 M močovina, 1% koktejl inhibitorů proteáz). Zbývající zbytky byly odstraněny centrifugací při 12 000 g při 4 °C po dobu 10 minut. Nakonec byl odebrán supernatant a koncentrace bílkovin byla stanovena pomocí soupravy BCA podle pokynů výrobce. Pro rozklad byl roztok proteinu redukován 5 mM dithiothreitolem po dobu 30 min při 56 °C a alkylován 11 mM jodoacetamidem po dobu 15 min při pokojové teplotě ve tmě. Proteinový vzorek byl poté zředěn přidáním 100 mM TEAB s močovinou o koncentraci menší než 2M. Nakonec byl přidán trypsin v hmotnostním poměru 1:50 trypsinu k proteinu pro první trávení přes noc a 1:100 trypsinu k proteinu pro druhé čtyřhodinové trávení. Tryptické peptidy byly rozpuštěny v 0,1% kyselině mravenčí (rozpouštědlo A) a přímo naloženy na domácí analytickou kolonu s reverzní fází (délka 15 cm, i.d. 75 μm). Gradient byl proveden následovně: nárůst z 6 % na 23 % rozpouštědla B (0,1 % kyseliny mravenčí v 98 % acetonitrilu) během 26 min, nárůst z 23 % na 35 % rozpouštědla B během 8 min, nárůst na 80 % rozpouštědla B během 3 min a udržování na 80 % rozpouštědla B po dobu posledních 3 min při konstantním průtoku 400 nL/min na systému EASY-nLC 1000 UPLC. Peptidy byly podrobeny NSI zdroji s následnou tandemovou hmotnostní spektrometrií (MS/MS) v systému Q ExactiveTM Plus (Thermo), který byl online spojen s UPLC. Použité napětí elektrospreje bylo 2,0 kV. Rozsah skenování m/z byl 350 až 1800 pro plné skenování a intaktní peptidy byly detekovány v Orbitrapu s rozlišením 70 000. Peptidy byly poté vybrány pro MS/MS s použitím nastavení NCE 28 a fragmenty byly detekovány v Orbitrapu s rozlišením 17 500. V závislosti na datech se střídal jeden MS sken následovaný 20 MS/MS skeny s dynamickým vyloučením 15,0 s. Automatická kontrola zisku (AGC) byla nastavena na 5E4. Pevná první hmotnost byla nastavena na 100 m/z. Výsledná MS/MS data byla zpracována pomocí vyhledávače MaxQuant (v.1.5.2.8). K anotaci proteinových domén jsme použili InterProScan (verze 5.37-76.0). Za významnou byla považována korigovaná p-hodnota < 0,05 a násobná změna > 1,2.

Konstrukce komplementového mutanta ampR

K. pneumonia ampR (Doplňkové materiály) byl syntetizován a obklopen restrikčními místy 5ʹXbaI a 3ʹHindIII. Tento fragment byl restrikčně štěpen a klonován do pUC57. Rekombinantní DNA byla získána v Escherichia coli DH5α se selekcí na ampicilin. Po restrikčním štěpení byl fragment ampR ligován do expresního vektoru pBAD33 (Invitrogen) podle pokynů výrobce. pBAD33-ampR byl použit k transformaci pomocí elektroporace jako standard pro laboratorně izolované E. coli. Komplementární kmeny ampR byly potvrzeny polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) (tabulka S1). Exprese ampR byla indukována přidáním 100 μg/ml arabinózy.

Modely plicní infekce myší

Pro testování virulence izolátů byl použit model pneumonie K. pneumoniae u myší. Šest až osmitýdenní samice myší BALB/c pod specifickou bezpatogenní třídou byly zakoupeny od společnosti Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.. Myši byly intraperitoneálně anestetizovány pentobarbitalem sodným (75 mg/kg) a neinvazivní intratracheální instilací pod přímým dohledem jim bylo naočkováno 1,0 × 107 kolonie tvořících jednotek (CFU) K. pneumoniae. Přežívání myší bylo sledováno po dobu 7 dnů po infekci. Pro posouzení bakteriální zátěže v plicích byly orgány infikovaných myší homogenizovány a rozpuštěny v 1 ml roztoku fosfátového pufru (PBS); 50 μl bylo naočkováno na agarové plotny s tekutým bujónem (LB) a bylo provedeno počítání CFU. Pro histopatologickou analýzu byly segmenty plic fixovány 10% neutrálním formalínem, vloženy do parafínu a obarveny hematoxylinem a eozinem pro vizualizaci světelnou mikroskopií. Bakteriální zátěž a histopatologická analýza byly provedeny po 24 hodinách od infekce.

Extrakce a kvantifikace kapsulárního polysacharidu

Kapsulární polysacharidy byly extrahovány pomocí detergentu Zwittergent 3-14. Množství kyseliny uronové bylo poté změřeno podle dříve popsané metody.28 Souběžně byly provedeny sériové roztoky bakteriální kultury pro stanovení počtu CFU a koncentrace kapsulárního polysacharidu byla vyjádřena podle množství kyseliny glukuronové (μg) na 109 CFU/ml vzorku. Každý experiment byl proveden ve třech opakováních.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru GraphPad Prism verze 8 (La Jolla, Kalifornie).

Výsledky

Charakteristika izolátů

V této studii byly použity izoláty CRKP bez opakování (n = 135). Všechny izoláty byly sekvenčního typu 11 (ST11) a exprimovaly karbapenemázu K. pneumoniae (KPC-2) a 1 izolát nesl jak OXA-23, tak KPC-2 (obrázek S1). Izoláty byly přiřazeny k 16 KT pomocí schématu cgMLST. Nejčastějšími CT byly CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13) a CT2410 (n = 11), následované 11 dalšími CT identifikovanými vždy u méně než 10 izolátů (obrázek 1). Všechny izoláty byly přiřazeny ke dvěma typům KL, KL64 (n = 86) a KL47 (n = 49) (obrázek S2). Nebyl zjištěn žádný hypermukózní izolát. Analýza genů virulence ukázala, že žádný izolát nesoucí všechny biomarkery pro rozlišení izolátů hvKp a cKp nebyl dříve hlášen (Obrázek 1, Obrázek S2).18

Obr. 1 Fylogenetická analýza 135 izolátů v této studii. Větve různých izolátů typu CT jsou znázorněny barevně. Odpovídající izoláty jednotlivých typů CT jsou CT1291 (P1291-1 až P1291-20), CT1313 (P1313-1 až P1313-33, AH1313-1 až AH1313-2), CT1689 (AH1689-1 až AH1689-8), CT1772 (AH1772-1 až AH1772-4), CT1814 (AH1814-1 až AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (P2405-1 až P2405-9), CT2410 (P2410-1 až P2410-11), CT2418 (P2418-1 až P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (P2445-1 až P2445-6), CT3175 (AH3175-1 až AH3175-2), CT3176 (AH3176-1 až AH3176-14), CT3178 (AH3178-1 až AH3178-4), CT3179 (AH3179-1 až AH3179-2) a CT3195 (AH3195). Pro odlišení hypervirulentní K. pneumoniae od klasické K. pneumoniae byly v předchozí studii identifikovány rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 a iucA18.

Analýza klinických dat

Mezi CT nebyly zjištěny žádné významné rozdíly, pokud jde o demografické údaje, typy infekcí, hlavní komorbidity, invazivní operace, Charlsonův index komorbidity a Pittovo skóre bakteriemie, s výjimkou centrálního žilního katétru, a všechny příčiny nemocniční mortality (P = 0,035 a P = 0,001, Fisherův exaktní test). Pacienti infikovaní CT3176 měli významně vyšší mortalitu (78,6 % vs 37,1 %, P = 0,012; 78,6 % vs 20,0 %, P = 0,001; 78,6 % vs 7,7 %, P = 0,0003; 78,6 % vs 31,0 %, P = 0,004; Fisherův přesný test) ve srovnání se skupinami CT1313, CT1291, CT1814 a ostatními CT. Využití centrálních žilních katétrů ve skupině CT1814 bylo významně vyšší než ve skupinách CT1313 a CT1291 (84,6 % vs 51,4 %, P = 0,049; 84,6 % vs 35,0 %, P = 0,011, Fisherův přesný test) (tabulka 1).

Tabulka 1 Demografické údaje, komorbidity, Invazivní postupy a mortalita pacientů s infekcemi Klebsiella pneumoniae rezistentními ke karbapenemům

Pan-GWAS analýza

Pro zjištění genetického základu CT3176 jsme provedli Pan-GWAS analýzu mezi skupinami s CT3176 a bez CT3176. Identifikovali jsme 39 genů se známými funkcemi spojenými s CT3176 (P < 0,01 upraveno metodou Benjamini-Hochberg) (Obrázek 2), včetně faktorů virulence, genů syntézy kapsulí, genů antimikrobiální rezistence a transportérů multidrug efflux. Z nich měl ampR největší asociaci s CT3176. Zaznamenali jsme však, že gen ampR nesly i další CT, například CT3178 a některé izoláty CT1689 (AH1689-2 a AH1689-6) (obrázek 1). Všechny izoláty nesoucí gen ampR patří do skupiny KL47.

Obr. 2 Pan-GWAS analýza mezi skupinami CT3176 a jinými než CT3176. Pangenom a asociace byly vypočteny pomocí Roary a Scoary. Grafická mapa byla vytvořena pomocí ggplot2.

Analýza proteomu

Tři izoláty ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 a AH1689-2) a tři ampR- (AH1689-3, AH1689-4 a AH1689-5) byly vybrány pro analýzu proteomu. V obou skupinách bylo identifikováno celkem 3093 proteinů na základě 36 727 unikátních peptidů. Nakonec jsme identifikovali 24 diferenciálně exprimovaných proteinů (DEP). U 15 z nich byla regulace zvýšena a u 9 byla snížena u izolátů s ampR+ ve srovnání s izoláty s ampR- (Obrázek 3A-C, Tabulka S2). WcaJ měl nejvyšší násobnou změnu, a proto byl zvýrazněn.

Obr. 3 Analýza proteomu a barvení kapslí. (A) Sopečný graf zobrazující srovnání kvantitativní exprese proteinů mezi izoláty Klebsiella pneumoniae s ampR+ (AH1689-2, AH3176-1 a AH3178-1) a ampR- (AH1689-3, AH1689-4 a AH1689-5). (B, C) Barevně jsou vyznačeny diferenciálně exprimované proteiny s násobnou změnou nad 1,2.

Virulence na zvířecích modelech a kvantifikace kapsuly

S cílem určit roli ampR ve virulenci nehypermukovitých izolátů CRKP jsme vybrali tři izoláty (AH3176-1, AH1689-2 a AH1689-3) a testovali jsme jejich virulenci na myším modelu. AH3176-1 a AH1689-2 byly dva izoláty s ampR+, zatímco AH1689-3 byl izolát s ampR- (obrázek 1). Kromě toho jsme k testování virulence vybrali z naší sbírky také dva hypermukózní kmeny GM2 a GM6. Kmeny GM2 i GM6 patří do skupiny KL1, z nichž GM6 nese gen ampR, zatímco GM2 nikoli. Sekvence ampR nehypermucoviskózního kmene KL47 se však lišila od sekvence ampR hypermucoviskózního kmene KL1, proto byly v této studii pojmenovány ampRKL1 a ampRKL47.

Jak ukazuje obrázek 4A, AH3176-1 a AH1689-3:ampRKL47 plus arabinóza měly 0 % přežití s inokulem 1 × 107 jednotek tvořících kolonie (CFU) 4 dny po infekci, zatímco 20 % přežití u AH1689-2, 40 % přežití u AH1689-3:ampRKL47 bez arabinózy, 60 % přežití u AH1689-3:pBAD33 a ATCC70721 a 80 % přežití u AH1698-3 bylo pozorováno 7 dní po infekci. Míra přežití byla významně snížena po komplementaci s genem ampRKL47 u AH1689-3 (n = 10; P = 0,033, log-rank Mantel-Cox test), což naznačuje důležitou roli ampR ve virulenci. Infekce myší virem AH3176-1 vedla k přibližně 10-100krát vyššímu počtu CFU v plicích ve srovnání s ostatními izoláty (obrázek 4B). Patologie plic vykazovala různý stupeň ztluštění alveolární stěny, infiltraci lymfocyty a intravaskulární krvácení v infekční skupině. Mezi nimi byly nejzávažnější plicní patologické změny způsobené AH3176-1, které se projevovaly rozsáhlou plicní konsolidací a intraalveolárním krvácením (Obrázek 4D-F).

Obr. 4 Virulenční potenciál nehypermukovitých izolátů Klebsiella pneumoniae na modelu plicní infekce myší. (A) Byl hodnocen vliv 1 × 107 jednotek tvořících kolonie (CFU) komplementového mutanta AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 a AH1689-3 ampRKL47 na přežití. (B) Po 24 hodinách po infekci (hpi) byly odebrány plíce infikovaných myší a bakteriální zátěž byla stanovena počítáním CFU (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, jednocestná ANOVA). Údaje jsou reprezentativní pro 3 nezávislé experimenty. (C) Produkce kyseliny uhličité u různých kmenů. Byl proveden nepárový oboustranný Studentův t-test. Každý datový bod byl třikrát opakován (n = 3). Data jsou prezentována jako průměr ± s.e.m. *P < 0,05, ns = bez významnosti. Plíce myší bez infekce (D) nebo infikovaných ATCC700721 (E) a AH3176-1 (F) byly odebrány a obarveny hematoxylinem a eozinem. Všechny snímky jsou při zvětšení ×40. Měřítka: 250 μM.

Jak ukazuje obrázek 5A, míra přežití myší infikovaných GM6 byla výrazně nižší než u GM2 a ATCC700721. Snížení míry přežití bylo pozorováno po komplementaci ampRKL1 u GM2. Kromě toho byla bakteriální zátěž v plicích myší infikovaných GM6 výrazně vyšší než u GM2 a ATCC700721 (obrázek 5B); barvení HE ukázalo, že infekce GM6 způsobila rozsáhlou konsolidaci plic a intraalveolární krvácení (obrázek 5E-G). Přežití však nebylo ovlivněno, pokud byl ampRKL47 vnesen do GM2 (Obrázek 5C).

Obrázek 5 Virulenční potenciál hypermukózních izolátů Klebsiella pneumoniae na modelu plicní infekce myší. (A) Byl hodnocen vliv 1 × 106 jednotek tvořících kolonie (CFU) GM2, GM6 a komplementového mutanta GM2 ampRKL1 na přežití (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, log-rank Mantel-Cox test),). (B) Po 24 hodinách po infekci (hpi) byly plíce infikovaných myší odebrány a bakteriální zátěž byla stanovena pomocí počítání CFU (n = 10; **P < 0,01, jednocestná ANOVA). Údaje jsou reprezentativní pro 3 nezávislé experimenty. (C) Byl hodnocen vliv 1 × 106 CFU GM2 a komplementární mutanty GM2 ampRKL47 na přežití. (D) Produkce kyseliny uhličité u různých kmenů. Byl proveden nepárový oboustranný Studentův t-test. Každý datový bod byl třikrát opakován (n = 3). Údaje jsou uvedeny jako průměr ± s.e.m. *P < 0,05, ns = bez významnosti. Plíce myší bez infekce (E) nebo infikovaných GM2 (F) a GM6 (G) byly odebrány a obarveny hematoxylinem a eosinem. Všechny snímky jsou při zvětšení ×40. Měřítka: 250 μM.

Protože kapsida je hlavním faktorem virulence K. pneumonia a WcaJ, který byl zvýrazněn podle výsledku analýzy proteomu, reguluje počáteční krok syntézy kapsidy, zkoumali jsme množství produkce kapsulárního polysacharidu. Výsledek ukázal, že ampR-komplementární kmeny AH1689-3:ampRKL47 a GM2:ampRKL1 plus arabinóza produkovaly významně více kapsulárního polysacharidu (kyseliny uronové) než AH1689-3, respektive GM2 (Obrázek 4C, Obrázek 5D).

Diskuse

MLST byla nejčastěji používanou technikou pro definování populací K. pneumoniae. Díky rychlému a cenově dostupnému WGS je možné pro typizaci izolátů porovnávat celé genomy, a ne jen několik lokusů, jak je tomu u tradiční MLST. Genotypizace pomocí cgMLST využívá tisíce alel v celém genomu, což vede k vyšší úrovni rozlišení izolátů. V této studii jsme použili cgMLST ke klasifikaci 135 klinických izolátů CRKP a zjistili jsme rozdíly mezi typy CT na základě klinických informací. Vzhledem k omezenému počtu případů se nám nepodařilo získat souvislost mezi typy CT a klinickým výsledkem. Rozdíly v míře úmrtnosti nám však umožnily dále zkoumat izoláty patřící do skupiny CT3176. Analýza GWAS ukázala, že gen ampR byl významně asociován s izoláty CT3176.

Předchozí studie ukázaly, že regulátor β-laktamázy AmpC AmpR, člen rodiny transkripčních faktorů LysR, řídí také četné mechanismy virulence u Pseudomonas aeruginosa.29,30 Dosud pouze jeden článek uvádí roli AmpR v regulaci virulence K. pneumoniae. Klonální izolát K. pneumoniae ukázal, že jen málo známých genů virulence je zodpovědných za závažné infekce. AmpR se u těchto izolátů podílel na upregulaci syntézy kapsul, moduloval tvorbu biofilmu a expresi fimbriálních genů typu 3 a také na kolonizaci myšího gastrointestinálního traktu.31 Úroveň virulence těchto izolátů však zůstává nejasná kvůli nedostatku údajů o modelech letální infekce. V této studii jsme použili model pneumonie k potvrzení zvýšené virulence těchto izolátů nesoucích ampR. To by vysvětlovalo, proč pacienti infikovaní těmito izoláty měli vysokou mortalitu.

Předtím bylo běžné, že K. pneumoniae typu ST11 byla rezistentní ke karbapenemům, ale nebyla hypervirulentní. V roce 2017 však byla hlášena epidemie nemocničních infekcí způsobených hypervirulentními izoláty K. pneumoniae rezistentními ke karbapenemům ST11. Fenotyp hypervirulence těchto izolátů byl způsoben získáním přibližně 170 kbp virulenčního plazmidu podobného pLVPK u klasických izolátů CRKP patřících k ST11 a sérotypu K47.15 Na rozdíl od výše uvedené zprávy nebyly v této studii u izolátů ST11 CRKP se zvýšenou virulencí nalezeny žádné virulenční plazmidy, což naznačuje, že zvýšení virulence nebylo způsobeno klasickým mechanismem.32 Na rozdíl od virulenčního plazmidu, který obsahuje více faktorů virulence, může AmpR zvyšovat virulenci nezávisle. To bylo potvrzeno testováním virulence komplementárního kmene ampR.

WcaJ je enzym, který zahajuje syntézu kyseliny kolanové a nakládá první cukr (glukózu-1-P) na lipidový nosič undecafrenylfosfát. Potenciální role WcaJ ve virulenci K. pneumoniae byla definována nedávno.33 Výsledky analýzy proteomu naznačují, že AmpR zvyšuje virulenci K. pneumoniae regulací počátečního kroku syntézy kapsuly. Jako regulátor se AmpR musí vázat na promotor genu, aby mohl vykonávat svou regulační roli. Dosud bylo u K. pneumoniae identifikováno mnoho typů kapsul,34 a nepřítomnost vazebných míst pro AmpR u některých typů kapsul může vysvětlovat, proč nelze zvýšit virulenci izolátů KL1 pomocí AmpR nalezeného u izolátů KL47.

Nové důkazy naznačují, že hypermukóznost a hypervirulence jsou různé fenotypy, které by se neměly používat jako synonyma. Kromě toho je důležité stanovit, že negativní řetězový test nestačí k určení, zda je izolát hypervirulentní.35 Klíčovým zjištěním naší práce bylo, že jsme identifikovali nehypermukoviskózní subklon ST11 CRKP se zvýšenou virulencí.

Hlavním omezením této studie je, že se jedná pouze o malý počet případů, proto nemůžeme studovat vztah mezi klinickými výsledky a nehypermukoviskózní hypervirulentní infekcí CRKP. Rovněž se nám nepodařilo zkonstruovat knockoutovaný kmen ampR, což lze vysvětlit tím, že genomická analýza ukázala, že ampR se domněle nachází na plazmidu (obrázek S3). Vzhledem k tomu, že kmeny s nehypermukózním fenotypem se v klinice téměř nerozlišují, je naléhavě nutné pokračovat ve sledování a zkoumání těchto nových kmenů

.