Anakinra, rekombinantní antagonista lidského receptoru pro interleukin-1, inhibuje apoptózu u experimentálního akutního infarktu myokardu

Akutní infarkt myokardu (AMI) je celosvětově hlavní příčinou morbidity a mortality. AMI je způsoben náhlým vznikem ischemie myokardu a následnou nekrózou. Osoby, které přežily AMI, zůstávají vystaveny vysokému riziku úmrtí i v letech následujících po indexové příhodě. Vzhledem k tomu, že se léčba AMI v posledních letech výrazně zlepšila, přežívá AMI stále více pacientů. Nejčastější komplikací AMI je výskyt dysfunkce levé komory a srdečního selhání. Počáteční ischemické poškození myokardu aktivuje kaskádu dějů, které nakonec vedou k nepříznivé srdeční remodelaci a srdečnímu selhání s následnou excesivní morbiditou a mortalitou.1 Proces remodelace probíhající v ischemickém i neischemickém myokardu je zprostředkován upregulací a downregulací různých drah, které spouštějí hypertrofii a apoptózu kardiomyocytů v křehké rovnováze mezi smrtí a přežitím.1,2 Antagonista receptoru pro interleukin-1 (IL-1) (IL-1Ra), člen rodiny IL-1, je přirozeně se vyskytující protizánětlivý protein, který se chová jako reaktant akutní fáze.3,4 Stejně jako ostatní reaktanty akutní fáze se hladina IL-1Ra zvyšuje během AMI a jeho hladina koreluje s prognózou.5,6 Úloha zvyšujícího se IL-1Ra během AMI je nejasná a spekuluje se o tom, že jeho role sahá od pouhého markeru poškození přes modulátor zánětlivé odpovědi až po potenciální cytoprotektivní látku.5,8 Nedávno se ukázalo, že nucená exprese IL-1Ra na zvířecím modelu je kardioprotektivní ve smyslu snížení velikosti infarktu a apoptózy.8

V této studii jsme zkoumali účinky anakinry, exogenního rekombinantního lidského IL-1Ra, na 2 experimentálních modelech s použitím chirurgického podvazu levé koronární tepny u hlodavců: Studie okamžitého podání anakinry na myším modelu s cílem posoudit její účinky na apoptózu, velikost infarktu a remodelaci a studie opožděného (24hodinového) podání anakinry s cílem posoudit její účinky na apoptózu nezávisle na potenciálních infarkt šetřících účincích a na srdeční remodelaci na potkaním modelu (s cílem posoudit také možné mezidruhové rozdíly). Kromě toho byl antiapoptotický účinek anakinry testován in vitro.

Metody

Chirurgické postupy

Všechna zvířata byla dodána společností Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind). Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny podle pokynů pro humánní používání laboratorních zvířat a péči o ně v biomedicínském výzkumu, které vydal National Institutes of Health (č. 85-23, revize 1996). Dospělým samcům outbredních myší Institute of Cancer Research (stáří 10 týdnů; hmotnost 26 až 38 g) a dospělým potkanům Wistar (stáří 10 týdnů; hmotnost 350 až 500 g) byla provedena koronární ligace. Chirurgické zákroky byly provedeny 1. den dvěma zkušenými operatéry (F. N. S. a S. S.), jak bylo popsáno dříve.9,10 Zvířata byla v anestezii (pentobarbital 50 až 70 mg/kg) intubována a umístěna do pravého dekubitu a poté podstoupila chirurgické otevření hrudníku a podvaz proximální levé koronární tepny. Osm myší a osm potkanů podstoupilo falešnou operaci, která zahrnovala všechny kroky kromě podvazu koronární tepny; polovině z nich byly denně podávány injekce anakinry (1 mg/kg) a zbývající polovině byl podáván fyziologický roztok. Studii schválil Institutional Animal Care and Use Committee of Virginia Commonwealth University. Deset myší a 4 potkani uhynuli v bezprostředním pooperačním období a nebyli zahrnuti do žádné z analýz.

Léčba

Byly provedeny dvě substudie: okamžité podání anakinry během ischemie u myši a opožděné podání anakinry 24 hodin po ischemii u potkana. V myším modelu byla anakinra v dávce 1 mg/kg (odpovídající doporučené dávce pro léčbu revmatoidní artritidy) podávána intraperitoneálně během operace a poté denně po dobu 6 dávek u 20 myší (16 s koronární ligací a 4 myši operované shamem). U potkaního modelu byla anakinra podávána intraperitoneálně 2. den a poté denně po dobu 5 dávek u 8 potkanů (4 s koronární ligací a 4 s falešnou operací). Zbývajících 24 myší (20 s koronární ligací a 4 sham-operované) a 12 potkanů (8 s koronární ligací a 4 sham-operovaní) dostalo injekce 0,9% NaCl (fyziologický roztok). K posouzení možných mezidruhových rozdílů byly použity dva různé druhy hlodavců. Dalších 28 myší podstoupilo hodnocení velikosti infarktu 24 hodin po operaci: 6 myší, kterým byl podáván fyziologický roztok, a 22 myší, kterým byly podávány rostoucí dávky anakinry (1 mg/kg , 10 mg/kg a 100 mg/kg ), aby bylo možné posoudit potenciální infarkt šetřící účinky anakinry v závislosti na dávce. Nakonec bylo dalších 6 myší (3 léčené anakinrou a 3 léčené fyziologickým roztokem) utraceno 7 dní po koronárním podvazu pro hodnocení exprese matrixové metaloproteinázy-9 (MMP-9). Celkem bylo v této studii použito 78 myší a 20 potkanů.

Zhodnocení velikosti infarktu

Čtyřiadvacet hodin po dokončení infarktového protokolu bylo srdce rychle vyjmuto a upevněno na Langendorffův přístroj. Koronární tepny byly perfundovány 0,9% NaCl s obsahem 2,5 mmol/l CaCl2. Po promytí krve bylo do aorty vstříknuto ≈2 ml 10% Evansova modrého barviva jako bolus, dokud většina srdce nezmodrala. Srdce bylo perfundováno fyziologickým roztokem, aby se vyplavil přebytek Evansovy modři. Nakonec bylo srdce vyjmuto, zmrazeno a rozřezáno na 8 až 10 příčných řezů od apexu k bazi o stejné tloušťce (≈1 mm). Řezy byly poté inkubovány v 10% roztoku trifenyltetrazoliumchloridu v izotonickém fosfátovém pufru (pH 7,4) při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Plochy infarktové tkáně, rizikové zóny a celé levé komory byly stanoveny počítačovou morfometrií pomocí zobrazovacího softwaru BIOQUANT (BIOQUANT Image Analysis Corp, Nashville, Tenn). Velikost infarktu byla vyjádřena jako procento ischemické rizikové zóny, která byla stanovena jako procento levé komory.

Echokardiografie

Transtorakální echokardiografie v lehké anestezii (pentobarbital 30 až 50 mg/kg) byla provedena těsně před operací a 7 dní po operaci těsně před smrtí. Dopplerovská echokardiografie byla provedena pomocí zobrazovacího systému Vevo770 (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) a 30MHz sondy u myší; u potkanů byl použit echokardiografický systém vybavený 15MHz snímačem s fázovým polem (Hewlett-Packard, Palo Alto, Kalifornie). Snímač byl umístěn na levé přední straně hrudníku. Srdce bylo nejprve zobrazeno ve dvourozměrném režimu v pohledu na levou komoru v krátké ose. Kurzor v režimu M byl umístěn kolmo na přední a zadní stěnu, aby bylo možné změřit enddiastolický a endsystolický průměr levé komory (LVEDD a LVESD). V souladu s doporučeními Americké echokardiografické společnosti11 byly poté pořízeny M-mode snímky v úrovni papilárních svalů pod hrotem mitrální chlopně. U myší byly rovněž získány apikální 4 a 5komorové zobrazení k měření transmitrálního průtoku, výtoku z levé komory a transaortálních průtokových rychlostí. Frakční zkrácení LK (FS) bylo vypočteno následujícím způsobem: FS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100. Ejekční frakce byla vypočtena podle Teichholzova vzorce. Z apikálního pohledu byla získána transmitrální a pulzní dopplerovská průtoková spektra výtokového traktu levé komory. Bylo provedeno měření průtoku výtokovým traktem. Byly měřeny izovolumetrické kontrakční (ICT) a relaxační (IRT) časy a ejekční čas (ET). Rovněž byl měřen integrál rychlosti průtoku výtokovým traktem LK (LVOT) v čase (AoVTI). Tyto údaje byly použity k výpočtu Teiova indexu (Teiův index=ICT+ IRT/ET)12 a srdečního výdeje (CO=AoVTI×π×(průměr LVOT/2)2×srdeční frekvence, kde LVOT byla měřena jako plocha průřezu v parasternálním zobrazení v dlouhé ose). U lidí je vyšší index Tei spojen se systolickou i diastolickou dysfunkcí a horšími výsledky12. Přidělení k různým léčebným postupům bylo náhodné a vyšetřovatel provádějící a odečítající echokardiogram byl ohledně léčby zaslepen.

Patologie

7. den po provedení echokardiografie a v anestezii byla břišní aorta kanylována polyethylenovým katétrem, hrudník byl otevřen, aorta byla naplněna fosfátovým pufrem (0,2 mol/l, pH 7,4) a heparinem (100 IU) a pravá síň byla rozříznuta, aby byla umožněna drenáž. V rychlém sledu bylo srdce zastaveno v diastole a byla zahájena perfuze fosfátem pufrovaným formalínem. Pouze u potkanů bylo ze srdce získáno 1 až 2 ml plné krve pro stanovení cytokinů v plazmě. Levá komora byla naplněna fixativem pro 10minutovou fixaci. Na konci procedury byly odebrány příčné řezy střední třetiny levé komory a uloženy ve formalínu po dobu nejméně 48 hodin. Apoptóza byla definována barvením na terminální deoxynukleotidyltransferázou zprostředkované značení dUTP nick-end (TUNEL; fragmentace DNA, Oncor, Gaithersburg, Md). Podrobný protokol byl publikován jinde.13 Peri-infarktová oblast byla definována jako zóna ohraničující infarkt, kde převažoval životaschopný myokard.13 Míra apoptózy byla vyjádřena jako počet apoptotických kardiomyocytů na všechny kardiomyocyty v jednom poli. K dokumentaci typu buněk bylo provedeno barvení na TUNEL a svalový aktin (předředěná protilátka proti myšímu α-sarkomerickému aktinu, Invitrogen, San Francisco, Kalifornie). Uvažovali jsme především apoptózu v kardiomyocytech, ale měřili jsme také apoptózu v granulační tkáni (aktin-negativní mononukleární buňky) v infarktových oblastech.

Počet leukocytů v myokardu byl měřen jako počet CD45+ buněk na 1 mm2 (pomocí protilátky proti myším CD45, ředění 1:100, Southern Biotech, Birmingham, Ala) a porovnáván mezi myší s AMI léčenou anakinrou a fyziologickým roztokem. Míra apoptózy v periinfarktových oblastech byla vypočtena v 10 náhodných polích, která pokrývají téměř celou periinfarktovou oblast. Vyšetřovatelé provádějící počítání buněk nevěděli o přidělení léčby.

Měřili jsme myší fibrózu myokardu 7 dní po AMI, abychom se zabývali otázkou, zda okamžité použití anakinry souvisí se zhoršeným hojením infarktu. Řezy srdcem byly obarveny barvením Massonovým trichromem (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo). Krátce, řezy byly přes noc mořeny v Bouinově roztoku a promyty v tekoucí vodě, aby se odstranila žluť. Řezy byly obarveny Mayerovým hematoxylinem, Biebrichovým fuchsinem na bázi kyseliny šarlatové, pracovním roztokem kyseliny fosfotungové/fosfomolybdenové a anilinovou modří vždy na 5 minut a poté byly na 2 minuty umístěny do 1% kyseliny octové. Řezy byly opláchnuty, dehydratovány alkoholem, očištěny v xylenu a upevněny. Cytoplazma a svalová vlákna se zobrazují červeně, kolagen a jádra modře. Plochy fibrózy a celé levé komory byly určeny počítačovou morfometrií pomocí zobrazovacího softwaru BIOQUANT a poměr byl použit k výpočtu plochy jizvy vyjádřené v procentech levé komory. Poměr fibrózy a životaschopného myokardu v periinfarktové oblasti (intersticiální fibróza) byl stanoven počítačovou morfometrií pomocí zvětšení ×20 a vyjádřen jako procento plochy. K detekci (pre)nekrotických ložisek vápníku v myokardu bylo použito barvení Von Kossa (Diagnostic Biosystem, Pleasanton, Kalifornie).

Hladiny cytokinů

Plná krev byla odebrána do zkumavek s citrátem sodným 9 potkanům (4 léčeným anakinrou a 5 léčeným normálním fyziologickým roztokem) v době smrti a okamžitě centrifugována při 1000 g při 4 °C po dobu 10 minut. Supernatant byl odebrán a přefiltrován přes 0,22 μm filtr. Vzorky byly poté uloženy při -20 °C a následně analyzovány. Ke stanovení cirkulujících hladin IL-1β, tumor nekrotizujícího faktoru-α, IL-6 a interferonu-γ byl použit systém multiplex cytokinových kuliček (Bio-Plex Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, Kalifornie) podle pokynů výrobce. Reakční směs byla odečtena pomocí čtečky Bio-Plex protein array a data byla analyzována pomocí softwarového programu Bio-Plex Manager.

Syntéza MMP

MMP-9 neboli gelatináza B byla vybrána jako prototypová metaloproteináza regulovaná po AMI a spojená s nepříznivou remodelací.14,15 Celkový rozpustný protein byl extrahován z infarktu a periinfarktového myokardu 7 dní po koronárním podvazu u 6 myší (3 léčené anakinrou a 3 fyziologickým roztokem) s pufrem 20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA a 1 mmol/l EGTA. Homogenát byl centrifugován při 14 000 g po dobu 10 minut při 4 °C a supernatant byl získán zpět. Poté bylo 50 μg proteinu z každého vzorku separováno pomocí 7,5% akrylamidového gelu, přeneseno na nitrocelulózovou membránu a následně blokováno 5% odtučněným sušeným mlékem v Tris-buffered saline Tween-20 (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/L NaCl a 0,1% Tween 20) po dobu 1 hodiny. Membrána byla poté inkubována s kozí polyklonální primární protilátkou v ředění 1:1000 pro MMP-9 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornie) po dobu 16 hodin při 4 °C, poté byla promyta a inkubována se sekundární protilátkou proti králičí křenové peroxidáze (1:2000; Amersham Biosciences, Inc, Piscataway, NJ) po dobu 1 hodiny. Bloty byly vyvolány chemiluminiscenčním systémem. Byly patrné dva pásy odpovídající pro-MMP-9 a aktivnímu MMP-9. Pro měření byl vybrán pouze aktivní pás (105 kDa) MMP-9. Optická hustota pro každý pás byla snímána a kvantifikována pomocí denzitometrie a vyjádřena jako poměr aktivního MMP-9 k β-aktinu.

Antiapoptotické účinky Anakinry in vitro

Komorové kardiomyocyty byly izolovány z potkana enzymatickou technikou upravenou podle dřívějšího popisu.16 Stručně, potkan byl anestetizován pentobarbitalem sodným (100 mg/kg IP) a srdce bylo rychle vyjmuto z hrudníku. Během 3 minut byl aortální otvor kanylován na Langendorffův perfuzní systém a srdce bylo retrográdně perfundováno. Enzymatické štěpení bylo zahájeno přidáním kolagenázy typu II (po 0,5 mg/ml; Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) a proteázy typu XIV (0,02 mg/ml) do perfuzního pufru a pokračovalo ≈15 minut. Poté bylo do roztoku enzymu přidáno 50 μmol/l Ca2+ a srdce bylo perfundováno dalších 10 až 15 minut. Natrávená komorová tkáň byla nakrájena na kousky a jemně odsáta přenosovou pipetou, aby se usnadnila disociace buněk. Buněčná peleta byla resuspendována pro třístupňový postup obnovy Ca2+ (tj. 125, 250 a 500 μmol/l Ca2+). Čerstvě izolované kardiomyocyty byly poté suspendovány v minimálním esenciálním médiu (katalogové číslo M1018, pH 7,35 až 7,45, Sigma). Buňky byly poté naneseny na 35mm misky pro buněčné kultury, které byly předem potaženy 20 μg/ml myšího lamininu ve fosfátovém pufrovaném roztoku s 1% penicilinem a treptomycinem po dobu 1 hodiny. Kardiomyocyty byly kultivovány v přítomnosti 5% CO2 po dobu 1 hodiny ve zvlhčeném inkubátoru při 37 °C, což umožnilo kardiomyocytům přilnout k povrchu misky před experimentálním protokolem. Poté byly kardiomyocyty vystaveny simulované ischemii po dobu 40 minut nahrazením buněčného média „ischemickým pufrem“, který obsahoval 118 mmol/l NaCl, 24 mmol/l NaHCO3, 1,0 mmol/l NaH2PO4, 2,5 mmol/l CaCl2-2H2O, 1,2 mmol/l MgCl2, 20 mmol/l laktátu sodného, 16 mmol/l KCl a 10 mmol/l 2-deoxyglukózy (pH upraveno na 6,2). Kromě toho byly buňky po celou dobu simulované ischemie inkubovány v hypoxických podmínkách při 37 °C nastavením tříplynového inkubátoru na 1 % až 2 % O2 a 5 % CO2. Po 40 minutách byla simulována reperfuze nahrazením ischemického pufru normálním médiem za normoxických podmínek. Současně byla na destičku přidána anakinra ve zvyšujících se koncentracích (×100) počínaje koncentrací 25 × 10-16 g/ml až po koncentraci 25 × 10-6 g/ml (n=3 na skupinu). Do 3 destiček byl přidán ekvivalentní objem normálního média, který sloužil jako kontrola. Destičky byly inkubovány po dobu 18 hodin. Apoptóza kardiomyocytů byla analyzována barvením TUNEL pomocí soupravy zakoupené od společnosti BD Biosciences (San Jose, Kalifornie), která detekuje fragmentaci jaderné DNA pomocí fluorescenčního testu. Stručně řečeno, po 40 minutách simulované ischemie a 18 hodinách reperfuze byly buňky ve dvoukomorových preparátech fixovány 4% formaldehydem/fosfátovým roztokem při 4 °C po dobu 25 minut a podrobeny testu TUNEL podle protokolu výrobce. Sklíčka byla poté protibarvena montážním médiem Vectashield s 4,6-diamidino-2-fenylindolem (interkalační barvivo DNA pro vizualizaci jader ve fixovaných buňkách; katalogové číslo H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornie). Obarvené buňky byly zkoumány pod fluorescenčním mikroskopem Olympus IX70 (Olympus Inc, Center Valley, Pa).

Anakinra Uptake In Vitro

HL-1 buňky, buněčná linie myšího srdečního svalu, která si zachovává fenotypové vlastnosti dospělých kardiomyocytů, byly pěstovány do konfluence v Claycombově médiu (Sigma Chemical Co) doplněném 10% FCS (JHR Bioscience, Ltd, Andover, Hampshire, Velká Británie) a norepinefrinem 0,5 %.1 mmol/l (Sigma Chemical Co) na 22mm skleněných krycích sklíčkách potažených želatinou/fibronektinem umístěných na dně 35mm Petriho misek17. Poté byla k buňkám přidána anakinra konjugovaná s FITC (10 μg/ml) a buňky byly inkubovány při 37 °C v normoxických nebo hypoxických podmínkách (2 % kyslíku) v inkubátoru Micro galaxy, RS Biotech po dobu 5 hodin. Poté byly buňky dvakrát promyty Hanksovým solným roztokem obsahujícím 10 % FCS. Jádra byla protibarvena Hoechstem a pozorování bylo provedeno fluorescenčním mikroskopem Leica DM 2000 (Meyer Instruments Inc, Houston, Tex).

Testy aktivity kaspázy-1 a -9

Inhibice aktivity kaspázy-1 a -9 anakinrou byla stanovena pomocí komerčních testovacích souprav (QuantiZyme assay system, Plymouth, Pa) za použití rekombinantní lidské kaspázy-1 a YVAD-AMC, varianty sekvence YVHD, která se nachází v místě štěpení pro-Il-1β, jako fluorogenního substrátu pro kaspázu-1 a Ac-LEHD-AMC pro kaspázu-9. Experiment byl proveden při 22 °C s fluorometrickou destičkovou čtečkou (SLT, Fluostar, Tecan US, Research Triangle Park, NC) v kinetickém režimu s excitační a emisní vlnovou délkou 390 a 460 nm. Pro substrát byla použita počáteční koncentrace 11,5 μmol/l (odpovídající Km kaspázy-1), která byla následně zvýšena na 37,5 μmol/l pro testování kompetitivní a nekompetitivní inhibice.18 Pro anakinru byla zvolena počáteční dávka 100 nmol/l v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10 μg/ml polyklonální blokující protilátky proti IL-1Ra (R&D Systems, Minneapolis, Minn) a poté zvýšena na 300 a 900 nmol/l pro vyhodnocení křivky závislosti dávky na odpovědi. Provedly se korekce ze slepého pokusu a křivky se přizpůsobily interceptu 0,0, protože se předpokládá, že aktivita je v čase 0. Regresní sklony (r>0,95) jsou získány pro každý experiment při každé dávce a koeficienty jsou porovnány mezi 3 skupinami (anakinra, kontrola, anakinra plus blokující protilátka). Experimenty byly provedeny ve třech opakováních pro každou skupinu a křivky byly provedeny nejméně pětkrát u každého vzorku. Hodnota pravděpodobnosti odráží 1-way ANOVA mezi skupinami s 2stranným post-hoc Dunnettovým testem porovnávajícím každou skupinu s anakinrou.

Fyzikální interakce a vazba mezi anakinrou a kaspázou-1 a -9 byly testovány pomocí koimunoprecipitace. Anakinra (1 μg) byla inkubována s komerčně dostupnou rekombinantní lidskou kaspázou-1 a -9 (1 μg, BIOMOL International, Plymouth Meeting, Pa) po dobu 1 hodiny při 4 °C. Směs byla poté vysrážena přidáním ke dvěma různým sadám sefarosových kuliček spojených s protilátkou proti IL-1Ra (Santa Cruz) nebo protilátkou proti kaspáze-1 (Santa Cruz). Frakce navázané na sefarosu byly vyvařeny v SDS pufru a separovány v SDS-PAGE. Koprecipitované proteiny v každém nastavení byly poté imunoblotovány a analyzovány pomocí Western blotu. Pro detekci imunoreaktivity anakinry a kaspázy-1, resp. kaspázy-1 v koprecipitátu byly použity protilátky anti-IL-1Ra a anti-caspase-1 nebo -9. Pokud nedošlo ke koprecipitátu, očekával se při Western blotu jediný pás odpovídající rozpustné protilátce stejného typu jako protilátka navázaná na sefarosové kuličky (tj. imunobarvení pro IL-1Ra v testu precipitace IL-1Ra navázaného na sefarosové kuličky). Pokud by došlo ke koprecipitaci, pak bychom očekávali přítomnost dvojitého pásu pro obě rozpustné protilátky v obou precipitačních testech (celkem 4 pásy). Anakinra a kaspáza-1 nebo -9 byly provedeny ve Western blotu v dalších liniích a použity jako pozitivní kontroly.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí balíčku SPSS 11.0 pro Windows (SPSS Inc, Chicago, Ill). Spojité proměnné jsou vyjádřeny jako průměr a SE. K porovnání průměrů mezi více (>2) skupinami byla použita jednosměrná ANOVA s post hoc 2stranným Dunnettovým testem pro konkrétní porovnání účinků mezi subjekty s kontrolami v každé skupině. T test pro nepárová data byl použit pouze k porovnání průměrů mezi 2 skupinami. ANOVA s náhodnými efekty pro opakovaná měření byla použita k porovnání předintervenčních a pointervenčních echokardiografických parametrů mezi 4 různými skupinami s post hoc 2stranným Dunnettovým testem pro specifické porovnání mezisubjektových efektů (skupiny s anakinrou a AMI s fyziologickým roztokem). Korelace mezi 2 spojitými proměnnými byly hodnoceny Pearsonovým testem. Byly sestrojeny Kaplanovy-Meierovy křivky přežití a k vyhodnocení významných rozdílů mezi skupinami byl použit log-rank test. Míry přežití byly rovněž porovnány pomocí Fisherova přesného testu. V celém textu jsou uvedeny neupravené hodnoty pravděpodobnosti 2-tailed, přičemž statistická významnost je stanovena na hladině 0,05.

Autoři měli plný přístup k údajům a nesou plnou odpovědnost za jejich integritu. Všichni autoři si přečetli rukopis tak, jak je napsán, a souhlasí s ním.

Výsledky

Studie zahrnovala hodnocení účinků anakinry in vivo (v modelu podvazu koronární tepny u myši a potkana) a in vitro (v primární kultuře potkaních kardiomyocytů, kultuře HL-1 kardiomyocytů a izolované kaspáze-1).

Podání anakinry in vivo

Přežití

Dvaceti osmi myším byla po 24 hodinách provedena eutanazie za účelem posouzení velikosti infarktu. Šest myší bylo eutanazováno po 7 dnech pro analýzu exprese MMP-9; tyto myši nebyly zahrnuty do analýzy přežití. Po 7 dnech od podvazu koronární tepny žilo 15 z 16 myší (94 %) léčených anakinrou oproti 11 z 20 myší (55 %) léčených fyziologickým roztokem (P=0,013, Kaplan-Meierův log-rank test; P=0,021, Fisherův přesný test). Podobně 4 ze 4 potkanů (100 %) léčených anakinrou byli naživu, zatímco pouze 5 z 8 potkanů (62 %) léčených fyziologickým roztokem bylo naživu. Všechny myši (n=8) a potkani (n=8) léčení shamem byli po 7 dnech naživu.

Velikost infarktu

Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v rizikové ploše a ploše infarktu (vyjádřené jako plocha infarktu na rizikovou plochu) mezi myšmi léčenými fyziologickým roztokem a myšmi léčenými dávkami anakinry 1 a 10 mg/kg; anakinra 100 mg/kg však byla spojena s mírným, avšak významným (13%) zmenšením velikosti infarktu (P=0,015 oproti fyziologickému roztoku; obrázek 1).

Apoptóza

Použití přípravku Anakinra bylo spojeno s významným snížením apoptózy kardiomyocytů v periinfarktovém myokardu ve skupinách s okamžitou i opožděnou léčbou (3,1±0,2 % oproti 0,5±0,3 %, P<0,001; resp. 4,2±0,4 % oproti 1,1±0,2 %, P<0,001; obr. 2). Míra apoptózy v periinfarktovém myokardu přímo korelovala se známkami nepříznivé remodelace, jako je LVEDD (r=0,65, P=0,001), LVESD (r=0,66, P<0,001), FS (r=-0,62, P=0,001), diastolická tloušťka přední stěny (r=-0,50, P=0,012) a systolická tloušťka přední stěny (r=-0,50, P=0,012). Míra apoptózy ve vzdáleném myokardu byla buď nedetekovatelná, nebo velmi nízká, bez významných rozdílů mezi zvířaty s AMI (0,03±0,03 %) a zvířaty operovanými shamem (0,01±0,01 %) a mezi zvířaty léčenými anakinrou (0,02±0,02 %) a fyziologickým roztokem (0,03±0,03 %) (P>0,05 pro všechny analýzy).

Fibróza myokardu a depozita vápníku

Nebyly zjištěny žádné rozdíly ve fibróze myokardu (tvorba jizev, vyjádřená v procentech levé komory) mezi myšmi léčenými anakinrou a fyziologickým roztokem (31±2 % versus 33±2 %; P=0,81; obrázek 1). Intersticiální fibróza v periinfarktové oblasti byla minimální u myší operovaných shamem (<0,1 %), ale více se vyskytovala u myší léčených anakinrou a fyziologickým roztokem bez významných rozdílů mezi skupinami (13±2 % versus 15±3 %; P=0,58; obrázek 1). Pomocí barvení von Kossa jsme 1 týden po AMI zjistili minimální množství kalciových depozit v myokardu (<0,1 %) bez jakýchkoli rozdílů mezi myšmi léčenými anakinrou a fyziologickým roztokem.

Remodelace a funkce LV

Předintervenční hodnoty LVEDD a LVESD byly ve všech skupinách myší a potkanů podobné. V 7. den bylo pozorováno významné zvýšení LVEDD a LVESD a snížení diastolické tloušťky přední stěny, systolické tloušťky přední stěny a FS u myší léčených fyziologickým roztokem (oproti výchozí hodnotě a shamu ) (obr. 3). Ve srovnání s myšmi léčenými fyziologickým roztokem došlo u myší s AMI léčených anakinrou k významně menšímu nárůstu LVEDD a LVESD a poklesu FS 7. den oproti výchozímu stavu. Pokles systolické tloušťky přední stěny byl také spíše menší u myší léčených anakinrou (oproti zvířatům léčeným fyziologickým roztokem), což ukazuje na ochranný účinek v periinfarktové oblasti, zatímco v diastolické tloušťce zadní stěny (0,96±0,08 oproti 0,78±0,11; P=0,86) a systolické tloušťce zadní stěny (1,32±0,08 oproti 1,14±0,12; P=0,44) jsme nezjistili žádné významné rozdíly. Myši léčené anakinrou měly také kratší hodnoty izovolumetrické doby kontrakce (6±4 versus 16±5 ms; P=0,022) a izovolumetrické doby relaxace (12±5 versus 29±8 ms; P=0,042) a následně nižší Tei index (odrážející výkonnost myokardu) (0,28±0,03 versus 0,66±0,07; P=0,044; obr. 3). Index FS/Tei, který ještě těsněji koreluje s invazivním měřením dP/dt19 , byl rovněž významně vyšší u myší s AMI léčených anakinrou (0,74±0,06 versus 0,17±0,02; P=0,008). Mezi myší léčenou fyziologickým roztokem a myší léčenou anakinrou po falešné operaci nebyly zjištěny žádné rozdíly (obr. 3).

Podobný účinek na LVEDD a LVESD byl pozorován i na modelu potkanů (obr. 4). Průměrné procentuální zvýšení LVEDD a LVESD bylo významně větší u myší než u potkanů nezávisle na léčebné větvi (P<0,001). Absolutní snížení změn LVEDD a LVESD pomocí anakinry bylo významně větší u myší než u potkanů (P<0,001), nicméně procentuální snížení změn LVEDD a LVESD bylo podobné u myší (56±6 %, resp. 53±5 %) i u potkanů (68±7 %, resp. 47±4 %; P=0,66, resp. P=0,32), což ukazuje na podobné účinky okamžitého a opožděného podání anakinry.

Infiltrace leukocytů

Nebyly zjištěny žádné rozdíly v počtu leukocytů na 1 mm2 myokardu v infarktové oblasti u zvířat s AMI léčených anakinrou a fyziologickým roztokem (obr. 4). Míra apoptózy v granulační tkáni 1 týden po AMI byla u myší léčených anakinrou a fyziologickým roztokem podobná (obrázek 4). Leukocyty se prakticky nevyskytovaly ve vzdálených oblastech myokardu a u zvířat léčených shamem.

Hladiny cytokinů

Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v plazmatických hladinách IL-1β, IL-6, tumor nekrotizujícího faktoru-α a interferonu-γ (obrázek 4).

Aktivita MMP

Aktivní MMP-9 byla u falešně operovaných zvířat prakticky nedetekovatelná, zatímco u myší s AMI byla 7 dní po operaci trvale detekována. Mezi myší s AMI léčenou fyziologickým roztokem a myší léčenou anakinrou nebyl zjištěn žádný rozdíl v hladinách aktivní MMP-9 (obr. 4).

Podání anakinry in vitro

Apoptóza

Inkubace kardiomyocytů s anakinrou (2.5×10-12 g/ml) v době „simulované reperfuze“ (po 40 minutách „simulované ischemie“) byla spojena s významným 36% snížením apoptózy (11,2 ± 0,5 % oproti 17,5 ± 0,1 % u kontroly). Zvyšování (×100) koncentrací anakinry až na 25×10-6 g/ml nevykazovalo žádné další snížení apoptózy, zatímco koncentrace nižší než 25×10-12 g/ml neměly na apoptózu žádný vliv (obr. 5).

Zvýšené vychytávání anakinry buňkami během hypoxie

V porovnání s normoxií bylo vychytávání anakinry během hypoxie významně zvýšené a bylo patrné u ≈95 % buněk během hypoxie (oproti 35 % během normoxie; P=0,048; obrázek 6).

Inhibice aktivit kaspázy-1 a -9

In vitro anakinra (100 až 900 nmol/l) významně inhibovala aktivity kaspázy-1 a -9 o ≈50 % (P<0,001 pro všechny hodnoty koncentrací oproti kontrole), bez rozdílů mezi různými koncentracemi. Anakinra se chovala jako smíšený kompetitivní a nekompetitivní inhibitor enzymu pro kaspázu-1 (Ki, 0,201 μmol/l; Kic, 0,239 μmol/l; Kuc, 0,231 μmol/l) a pro kaspázu-9 (Ki, 0,31 μmol/l; Kic, 0,34 μmol/l; a Kuc, 0,28 μmol/l). Přidání protilátek blokujících IL-1Ra zvrátilo inhibici kaspázy-1 a -9 anakinrou (obr. 7). Koprecipitační test potvrdil fyzikální interakci a vazbu mezi anakinrou a kaspázami-1 a -9 (obrázek 7).

Diskuse

Tato studie poprvé ukazuje, že exogenní rekombinantní lidský IL-1Ra anakinra podaný během prvních 24 hodin po AMI významně zlepšuje srdeční remodelaci snížením apoptózy kardiomyocytů u 2 různých zvířecích modelů trvalého infarktového uzávěru tepny a že anakinra má přímý antiapoptotický účinek na kardiomyocyty in vitro.

Biologie IL-1Ra

IL-1Ra je považován za reaktant akutní fáze.3,4 V současné době je úloha endogenního IL-1Ra v zánětu nejasná. IL-1Ra se váže na receptor IL-1, a je tedy kompetitivním inhibitorem aktivity IL-1, potenciálně se chová jako protizánětlivé činidlo.3 Protože se však IL-1 váže na svůj receptor s vyšší afinitou a receptorů je nadbytek (spare receptor effect), zdá se, že role endogenního agonisty je omezená.3 Gen IL-1Ra je v biologii dobře zachován a mezidruhové rozdíly nebyly zaznamenány. V této studii jsme testovali 2 nejběžnější druhy hlodavců a zaznamenali jsme podobné účinky.

IL-1Ra u AMI

Hladiny IL-1Ra se významně zvyšují po ischemii-reperfuzi myokardu.7 Jeho hladiny jsou zvýšeny časně u pacientů s AMI s elevací ST segmentu5 a čím větší je plocha ohroženého myokardu, tím větší je zvýšení hladin IL-1Ra.6 V observačních studiích byly navíc vyšší hladiny IL-1Ra u pacientů s akutními koronárními syndromy spojeny s nepříznivým výsledkem.20,21 Zda IL-1Ra představuje marker poškození, pokus o kardioprotekci pomocí protizánětlivé aktivity, nebo mediátor poškození, zůstává nejasné. Nadměrná exprese IL-1Ra na modelu globální ischemie-reperfuze u potkanů poprvé prokázala kardioprotektivní účinek IL-1Ra, který vedl k přibližně 50% snížení apoptózy kardiomyocytů.8

Exogenní IL-1Ra

Rekombinantní lidský IL-1Ra (anakinra) je komerčně dostupný (vyrábí ho společnost Amgen), schválený Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv a používá se u velkého počtu pacientů k léčbě revmatoidní artritidy.22-24 Úloha IL-1 v patogenezi revmatoidní artritidy je ústřední. Bylo prokázáno, že systémové podávání anakinry je u pacientů s revmatoidní artritidou bezpečné a účinné a vede ke změně aktivity onemocnění. Probíhá klinická studie anakinry u pacientů s akutními koronárními syndromy, její výsledky však zatím nejsou k dispozici.25 V nedávno publikované studii fáze II bylo 17 pacientů s ischemickou cévní mozkovou příhodou léčeno anakinrou podávanou ve formě 100 mg bolusu a následné 72hodinové infuze; dalších 17 pacientů dostávalo odpovídající placebo.26 Bylo zjištěno, že anakinra nemá žádné nežádoucí účinky související s lékem a v sekundární analýze bylo zjištěno, že je spojena s větším počtem pacientů s minimálním nebo žádným postižením souvisejícím s cévní mozkovou příhodou. Na experimentálních zvířecích modelech cévní mozkové příhody byla anakinra spojena se snížením apoptózy, snížením zánětu a zlepšením výsledků chování.27,28

Mechanismus účinku

Přesný mechanismus, kterým anakinra uplatňuje své příznivé účinky, není zcela jasný. Přijímá se názor, že anakinra podávaná ve vysokých dávkách konkuruje IL-1 a snižuje jeho aktivitu. Anakinra se váže na receptor IL-1 typu I, ale zabraňuje transdukci intracelulárního signálu tím, že brání interakci mezi receptorem IL-1 a akcesorním proteinem IL-1. Bylo prokázáno, že IL-1Ra snižuje sekreci prostaglandinu-E2 závislou na IL-1, který může být přímo zodpovědný za buněčnou toxicitu a apoptózu.3,29 Zda anakinra zasahuje IL-1 pocházející převážně ze zánětlivých buněk nebo IL-1 uvolňovaný lokálně parakrinním nebo autokrinním způsobem a zda má přímý účinek na buňku nezávisle na interakci s receptorem IL-1, zůstává nejasné. Intracelulární působení IL-1Ra je nezávislé na intracelulární signální dráze IL-130 a byl popsán transmembránový aktivní transport IL-1Ra přes receptor purinergního kanálu P2X7.31 Účinky pozorované in vitro, kde jsou kultivovány pouze kardiomyocyty, naznačují, že účinky anakinry na myokard jsou alespoň částečně nezávislé na přítomnosti zánětlivého infiltrátu. V souladu s tím jsme v tomto experimentálním modelu nezjistili žádné účinky anakinry na hladiny cirkulujících cytokinů, infiltrát myokardiálních leukocytů ani aktivitu MMP-9. Z toho vyplývá, že anakinra nemá žádné účinky na myokardiální infiltrát. Antiapoptotické účinky IL-1Ra již byly zaznamenány u neuronů a epiteliálních buněk.32,33 Tyto účinky jsou patrné in vivo i in vitro, což naznačuje parakrinní nebo autokrinní účinek IL-1Ra.32,33 Zde uvádíme vychytávání anakinry buňkami během ischemie, vazbu mezi anakinrou a kaspázami-1 a -9 a významnou inhibici aktivity kaspáz-1 a -9 anakinrou. Údaje získané in vitro, ačkoli vzhledem k přirozeným omezením modelů vytvářejí pouze hypotézy týkající se dějů in vivo, naznačují zvyšující se práh pro apoptózu vyvolanou hypoxií pomocí anakinry.

Ukázali jsme, že časné (okamžité) nebo opožděné (o 24 hodin později) podání anakinry snižuje apoptózu a zabraňuje srdeční dilataci po AMI. V dávce, která prokazatelně inhibuje apoptózu a zabraňuje dilataci (1 mg/kg), neměla anakinra při časném podání žádný vliv na velikost infarktu a podobný přínos pro remodelaci je pozorován při podání anakinry 24 hodin po AMI, což odpovídá účinku na srdeční remodelaci, který je nezávislý na šetření infarktu. Pozoruhodné je, že příznivé účinky IL-1Ra na zvířecích modelech cévní mozkové příhody jsou také, alespoň částečně, nezávislé na čase.34 Jak však již bylo uvedeno v literatuře o cévní mozkové příhodě, infarkt šetřící účinek byl pozorován u 100krát vyšší dávky anakinry. Zda by se malé, ale významné zmenšení velikosti infarktu při vyšších dávkách promítlo do klinicky relevantního přínosu z hlediska srdečního selhání nebo přežití, není známo a vyžaduje další testování.

Optimální délka léčby IL-1Ra po AMI není známa. V modelu reakce cévní stěny na poškození byl IL-1Ra podávaný po dobu 28 dnů spojen s větším účinkem ve srovnání s IL-1Ra podávaným po dobu 14 dnů.35 Za zmínku stojí, že po přerušení léčby IL-1Ra nebyly zjištěny žádné rebound účinky.35

Úloha kaspáz při ischemii a srdečním selhání

Kaspázy jsou proteázy zapojené do apoptotické a zánětlivé kaskády.36-40 Kaspáza-3 je ústředním mediátorem apoptotické kaskády, což vede k následné aktivaci sekundárních efektorů odpovědných za fragmentaci DNA a štěpení strukturálních proteinů cytoskeletu. Kaspáza-1, známá také jako enzym konvertující interleukin-1, je považována za prozánětlivou kaspázu, protože mimo jiné přeměňuje pro-IL-1β na IL-1β. Kaspáza-1 je však také jedním z enzymů, které štěpí prokaspázu-3, což vede k její aktivaci.36-40 Kaspáza-3 je totiž obecně aktivována ze štěpení jinými kaspázami, jako je kaspáza-9, která hraje ústřední roli v mitochondriální dráze, kaspáza-8, která se podílí především na receptorem zprostředkované apoptóze, a kaspáza-1. Kaspáza-1 je také jedním z enzymů, které štěpí prokaspázu-3, což vede k její aktivaci. Experimentální studie ukázaly, že inhibice aktivity kaspázy-1 je spojena se snížením apoptózy a příznivější remodelací po AMI nezávisle na hladině IL-1.38,39 Vzhledem k tomu, že IL-1 je substrátem pro kaspázu-1, testovali jsme, zda by IL-1Ra mohl uplatnit své příznivé účinky přímou intracelulární inhibicí kaspázy-1.40 V souladu s tím jsme poprvé popsali, že anakinra se in vitro váže na kaspázu-1 a významně inhibuje její aktivitu. Přímá inhibice kaspázy-1 anakinrou může být alespoň částečně zodpovědná za její protizánětlivé a antiapoptotické účinky. Anakinra však může mít antiapoptotické účinky vyplývající z nepřímého účinku na aktivitu kaspázy-1 tím, že zabraňuje translokaci kaspázy-1 do jádra, a tím inhibuje apoptózu41 , nebo prostřednictvím inhibice kaspázy-9. Kaspáza-9 je klíčovým mediátorem mitochondriální dráhy, která vede k aktivaci apoptózy během hypoxie/ischemie.37 Zda inhibice kaspázy-1 nebo -9 hraje větší roli v přínosu pozorovaném u anakinry, je třeba ještě objasnit. V dávce testované v této studii měla anakinra pravděpodobně podobný inhibiční účinek na obě kaspázy a byla zaznamenána vzájemná interakce mezi různými kaspázami v apoptotické kaskádě.36-41

Farmakokinetika anakinry a odezva na dávku

Ve studii fáze I u 25 zdravých dobrovolníků byla jednorázová dávka anakinry v dávce podobné té použité v této studii (1 mg/kg) podaná intravenózně spojena s plazmatickou hladinou 3,1 μg/ml a poločasem 2,64 hodiny.42 In vivo jsme nezjistili žádný významný vliv na velikost infarktu při použití anakinry v dávce až 10krát vyšší, než je doporučená dávka, ale zjistili jsme malé, ale významné snížení velikosti infarktu při použití dávky 100krát vyšší. Není jisté, zda by se tento infarkt šetřící účinek spojený s takto vysokou dávkou promítl do příznivých dlouhodobých výsledků, a vyžaduje další studie. In vivo byla koncentrace >106 nižší než maximální plazmatická hladina pozorovaná u lidí spojena s významným snížením apoptózy. Nižší dávky nebyly účinné, zatímco vyšší dávky nevykazovaly žádné aditivní účinky. Tyto údaje odpovídají klinickému profilu anakinry, kdy se obvykle používá standardní dávka 1 mg/kg a vyšší dávky jsou spojeny s větším množstvím lokálních nežádoucích účinků bez významného dalšího klinického přínosu.22-24 V nedávné studii43 byla anakinra podávaná v dávce 100 mg (hrubě odpovídající 1 mg/kg) použita k inhibici apoptózy β-buněk pankreatu a ukázalo se, že je dobře snášena a že je spojena s ukazateli lepší funkce β-buněk ve srovnání s placebem, aniž by ovlivnila citlivost na inzulin.

Ischemie, apoptóza a srdeční selhání po AMI

Zjištění souvislosti mezi apoptózou a remodelací podporuje koncept apoptózy jako ústředního mediátoru srdeční remodelace bez ohledu na velikost infarktu.1,37,44 Absence rozdílů v účincích na apoptózu nebo remodelaci mezi okamžitou a opožděnou strategií léčby a absence vlivu na velikost infarktu při dávce 1 mg/kg naznačují, že anakinra specificky ovlivňuje subakutní postinfarktovou remodelaci, v níž, jak známo, hraje hlavní roli apoptóza,1,36,43 aniž by ovlivňovala hojení infarktu, degradaci matrix a fibrózu nebo podporovala rupturu stěny.

Závěry

Podání anakinry do 24 hodin po AMI zlepšuje postinfarktovou remodelaci a zároveň inhibuje apoptózu. Navzdory omezením této studie (jako je relativně malá velikost vzorku omezená na mužské pohlaví, jednorázové časové určení výsledků zájmu a použití echokardiografie, která zůstává suboptimální a na operátorovi závislou metodou hodnocení remodelace a funkce LK) mohou zjištění příznivého účinku exogenního IL-1Ra (anakinry) podaného do 24 hodin od AMI otevřít nové terapeutické okno pro léčbu ischemického poškození a remodelace pro prevenci a léčbu ischemického srdečního selhání.

Poznámky

.