Analytická citlivost, funkční citlivost

Jednou ze základních charakteristik každé analytické metody je nejmenší koncentrace, kterou lze spolehlivě změřit. Pro popis nejnižší koncentrace, kterou může imunoanalýza vykazovat, se používá řada termínů a pojmů a toto množství termínů může být skutečně matoucí. Následuje diskuse o některých z těchto pojmů a o tom, jak souvisejí s odpovědí na základní otázku: Jaká je nejnižší koncentrace, kterou mohu tímto testem zjistit?
Analytická citlivost
Formální definice analytické citlivosti je „nejnižší koncentrace, kterou lze odlišit od šumu pozadí“. Tato koncentrace se správně nazývá detekční limit zkoušky, ale nejčastěji se označuje jako citlivost. Obvykle se tato hodnota stanoví analýzou replikátů vzorku, o němž je známo, že neobsahuje žádný analyt. Poté se naměřené počty (CPS) z těchto replikátů použijí k výpočtu průměru a směrodatné odchylky (SD). Analytická citlivost se stanoví jako koncentrace odpovídající průměrným počtům získaným z nulového vzorku plus 2 SD u imunometrických testů a průměr minus 2 SD u kompetitivních testů. Tato hodnota je zveřejněna v části „Analytická citlivost“ v příbalových informacích k testům IMMULITE® a IMMULITE® 2000.
V reálném světě má analytická citlivost omezenou praktickou hodnotu. Skutečné omezení spočívá v tom, že u jakéhokoli testu nepřesnost velmi rychle roste s klesající koncentrací. Tento jev je snadno patrný při pohledu na profil přesnosti analýzy, což je grafické znázornění toho, jak se nepřesnost analýzy mění s měřenou koncentrací. (Příklady viz obrázky 1 a 2.)

Obrázek 1. Reprezentativní profil přesnosti DPC

Obrázek 2. Reprezentativní profil přesnosti DPC. Všimněte si, že funkční citlivost v oblasti 0,01-0,02 µIU/ml je podle definice vyžadována od testu TSH „třetí generace“.1,2
Nejen při analytické citlivosti, ale dokonce i při koncentracích, které ji výrazně převyšují, může být nepřesnost tak velká, že se výsledky nereprodukují dostatečně dobře, aby byly skutečně klinicky užitečné. V důsledku toho analytická citlivost obvykle nepředstavuje nejnižší měřitelnou koncentraci, která je klinicky užitečná.
Toto omezení analytické citlivosti nás provázelo vždy, u RIA i IMMULITE, a platí pro všechny metody všech výrobců. Vzhledem k tomu, že vzorky pacientů se obvykle neprovádějí v replikátech, nemusí být nedostatek reprodukovatelnosti při rutinním testování snadno patrný. Ovlivňuje však celkovou kvalitu a užitečnost výsledků. Proto je dolní mez rozsahu hlášení v softwaru IMMULITE a IMMULITE 2000 často nastavena na koncentraci nad analytickou citlivostí. Společnost DPC nastavuje meze vykazování pro každou zkoušku podle toho, jaký je podle komplexního posouzení rozsah efektivního a spolehlivého výkonu pro danou zkoušku vzhledem k jejímu zamýšlenému klinickému použití.
Omezení analytické citlivosti pro popis dolní hranice klinicky efektivního výkonu testu vedla k vytvoření dalšího konceptu.
Funkční citlivost
Přibližně před deseti lety, v reakci na omezenou použitelnost analytické citlivosti jako měřítka výkonnosti testu, vyvinula skupina výzkumníků hodnotících testy TSH koncept, který nazvali funkční citlivost.1 Definovali ji jako „nejnižší koncentraci, při které může test vykazovat klinicky užitečné výsledky“. Za klinicky užitečné výsledky pro TSH byla považována dobrá přesnost s denní CV nepřesahující 20 %. Ačkoli tato volba hranice CV byla poněkud arbitrární, výzkumníci se domnívali, že pro TSH je CV 20 % největší nepřesností, kterou lze pro klinické účely tolerovat.1
Protože CV je směrodatná odchylka vyjádřená jako procento průměru, CV 20 % znamená, že SD bude 20 % průměru. Například pro vzorek s koncentrací TSH 0,1 µIU/ml by rozsah zahrnující 95 % očekávaných výsledků z opakované analýzy činil ±40 % (±2 SD), neboli 0,06 µIU/ml až 0,14 µIU/ml.
Ačkoli byl původně vyvinut pouze pro testy TSH, koncept funkční citlivosti a použití 20% CV jako hranice klinické užitečnosti byl široce aplikován i na jiné imunoanalýzy. Tento koncept se prosadil, protože poskytuje laboratoři objektivní a klinicky smysluplný údaj o praktické dolní hranici testu.
Při vývoji nového testu používá DPC v podstatě stejný přístup a hodnotí jak přesnost, tak správnost, aby stanovila koncentrace, při kterých bude pravděpodobně dosaženo hranice klinické použitelnosti. Rozsah hlášení softwaru je založen na tomto hodnocení. Zejména u konkurenčních testů obvykle existuje významný rozdíl mezi analytickou citlivostí a dolní mezí pro hlášení. Rozsah vykazování, jak je nastaven v softwaru IMMULITE a IMMULITE 2000, představuje doporučení společnosti DPC pro „vykazovaný rozsah“ podle nařízení CLIA’88* – což je rozsah koncentrací, v němž je výkonnost testu dokumentována jako platná.
Ověřování výkonnosti testu
V současné době je pro laboratoře používající automatizované imunoanalytické systémy v USA jedinou charakteristikou výkonnosti související s citlivostí, jejíž ověření laboratoří vyžaduje norma CLIA’88, dolní mez vykazovaného rozsahu. Některé laboratoře se mohou také rozhodnout odhadnout funkční citlivost nového testu; a v minulosti některé chtěly ověřit analytickou citlivost. Každé z těchto hodnocení představuje jiný experiment s odlišnými protokoly a požadavky. Prvním krokem je tedy rozhodnutí, co má být ověřeno, a poté použití příslušného protokolu a odpovídající vyhodnocení údajů.
Pokud se laboratoř rozhodne vyhodnotit analytickou citlivost, cílem je obvykle ověřit hodnotu uvedenou pro toto výkonnostní měřítko v příbalovém letáku. Je nezbytné, aby vzorek použitý pro studii analytické citlivosti byl skutečný vzorek o nulové koncentraci s vhodnou matricí vzorku. Jakýkoli jiný typ vzorku může výsledky zkreslit. Obvyklý protokol zahrnuje analýzu 20 opakování nulového vzorku, po níž následuje výpočet průměru a SD CPS. Analytická citlivost se odhaduje jako koncentrace rovnající se průměrnému počtu nulového vzorku plus 2 SD u imunometrických („sendvičových“) testů, jako je TSH, nebo minus 2 SD u kompetitivních testů, jako je T4. Technické služby mohou pomoci s výpočtem této koncentrace. Tento protokol poskytuje počáteční odhad, který je obvykle dostatečný pro porovnání s analytickou citlivostí uvedenou v příbalovém letáku. K získání spolehlivého a přesného odhadu je však třeba provést více pokusů zahrnujících několik šarží soupravy.
Při posuzování funkční citlivosti je cílem určit nejnižší koncentraci odpovídající laboratoří specifikovanému cíli pro denní (interassay) nepřesnost, která představuje hranici klinické užitečnosti pro daný test. Běžně se jako cíl používá CV 20 %, což vychází z původní aplikace tohoto konceptu na TSH. Tato hodnota CV však nemusí být vždy nejvhodnějším limitem. U některých testů může být CV vyšší než 20 % v souladu s klinicky spolehlivými a informativními výsledky, zatímco u jiných může CV nižší než 20 % představovat hranici klinické užitečnosti. Cíl výkonnosti je třeba stanovit pro každý test na základě jeho zamýšleného klinického použití.
Po stanovení denní CV představující klinicky užitečnou hranici reprodukovatelnosti je dalším krokem odhadnout koncentraci, při které by CV mohla této hranice dosáhnout. Na základě předchozích studií, údajů v příbalovém letáku a odhadů provedených na základě profilu přesnosti testu může technický servis obvykle pomoci určit „cílové rozmezí“ koncentrací ohraničující předem stanovenou hranici CV.
V ideálním případě by tato studie měla být provedena s použitím několika neředěných vzorků pacientů nebo skupin vzorků pacientů s koncentracemi, které pokrývají cílový rozsah. Tyto vzorky však může být obtížné získat. Rozumné alternativy zahrnují vzorky pacientů zředěné na koncentrace, které pokrývají cílové rozmezí, nebo kontrolní materiály v tomto rozmezí nebo v jeho blízkosti. Pokud je pro studii potřeba ředit jakýkoli typ vzorku, je rozhodující, jaké ředidlo se použije. Rutinní ředidla vzorků jsou určena pouze k ředění vzorků s velmi vysokou koncentrací; pro některé testy mohou mít měřitelnou, i když velmi nízkou, zdánlivou koncentraci. Použití těchto ředidel může zkreslit výsledky studie.
Vzorky by měly být analyzovány opakovaně v několika různých sériích, ideálně po dobu několika dnů nebo týdnů, aby bylo možné posoudit denní přesnost. (Jediný běh o 20 opakováních neposkytuje platné posouzení funkční citlivosti). Po shromáždění údajů vypočítejte CV pro každý testovaný vzorek. Funkční citlivost je koncentrace, při které CV dosáhne předem stanovené hranice. Tuto koncentraci lze odhadnout z výsledků studie interpolací, pokud se náhodou neshoduje s jednou z testovaných hladin.
Ověřování dolní meze ohlašovaného rozmezí je jednou částí procesu ověřování celého ohlašovaného rozmezí. Toho se obvykle dosáhne provedením opakované analýzy na sérii tří až pěti vzorků se známými koncentracemi pokrývajícími ohlašovaný rozsah. Tyto vzorky lze získat pomocí jediného vzorku s koncentrací blízkou horní hranici rozsahu, který se pak zředí tak, aby vznikly další vzorky pokrývající celý ohlašovaný rozsah. Získané výsledky se vyhodnocují jak z hlediska reprodukovatelnosti, tak z hlediska výtěžnosti očekávaných hodnot, aby se zjistilo, zda výkonnost testu odpovídá potřebám klinické použitelnosti v celém ohlašovaném rozsahu.
Závěr
Proč je tedy spodní hranice softwarového rozsahu hlášení 1,0 µg/dl (13 nmol/l), když příbalový leták uvádí citlivost 0,3 µg/dl (3,9 nmol/l)? V tomto příkladu se jedná o kompetitivní test a nepřesnost testu překračuje klinicky užitečné limity při koncentraci výrazně vyšší, než je analytická citlivost.
Jestliže je nepřesnost taková, že nelze s jistotou říci, že výsledky řekněme 0,4 µg/dL (5 nmol/L) a 0,7 µg/dL (9 nmol/L) se ve skutečnosti liší, nebylo by lepší uvést oba výsledky jako “
V konečném důsledku to obvykle není detekční limit testu (analytická citlivost), ale spíše reprodukovatelnost výsledků, která určuje spodní hranici klinicky spolehlivého výkonu testu v rutinní praxi.

1. Spencer CA. Profilování štítné žlázy pro 90. léta: odhad volného T4 nebo citlivé měření TSH. J Clin Immunoassay 1989; 12:82-9.
2. Spencer CA, et al. Interlaboratory/intermethod differences in functional sensitivity of immunometric assays of thyrotropin (TSH) and impact on reliability of measurement of subnormal concentrations of TSH. Clin Chem 1995;41:367-74. Reprint (katalogové číslo ZD060) je k dispozici na vyžádání v DPC.
*CLIA’88: americký zákon o zdokonalování klinických laboratoří.