Antibiotic susceptibilities of indicator bacteria Escherichia coli and Enterococci spp. izolovaných z kachen v obci Morogoro, Tanzanie
Metody
Oblast studie a odběr vzorků kachen
Tato průřezová studie byla provedena v obci Morogoro mezi listopadem 2014 a březnem 2015, kde bylo odebráno 100 kachen pižmových (Carina moschata) z 26 dvorních hejn . Studijní kachny byly náhodně vybrány z každého hejna, kde bylo odebráno 5-10 % velikosti hejna . Vzorek zahrnoval 86 samic a 14 samců kachen. Před odběrem vzorků byly pomocí dotazníku (doplňkový soubor 1) shromážděny základní informace o chovu, krmení, použití a likvidaci nepoužitých antibiotik. Vybrané kachny byly ručně znehybněny a do kloaky byl zaveden sterilní vatový tampon k odběru trusu. Vzorky byly uloženy do chladicího boxu s ledovým obalem a převezeny do laboratoře na Sokoine University of Agriculture k analýze. Pro důslednost provedli dva výzkumníci poté, co byli vyškoleni laboratorními technology pro odběr vzorků z ptáků stěrem, odběr vzorků u všech 100 kachen.
Izolace a identifikace E. coli a enterokoků
Vzorky trusu byly naneseny na MacConkeyho agar (Oxoid, Basingstoke, UK) a inkubovány po dobu 24 hodin v aerobních podmínkách pro izolaci E. coli . Podezřelé kolonie byly dále identifikovány na základě morfologie kolonií, barvení podle Grama a biochemických testů . Pro izolaci enterokoků byly vzorky naneseny na Slanetz-Bartleyho agar (Oxoid, Basingstoke, UK) a inkubovány 48 h v aerobních podmínkách a identifikovány na základě koloniální morfologie a biochemických testů . Při izolaci a identifikaci byly jako kontrolní kmeny zařazeny E. coli ATCC25922 a Enterococcus faecium ATCC 2912.
Citlivost na antibiotika
Všechny izoláty E. coli a enterokoků byly testovány na citlivost na antibiotika diskovou difuzní metodou a interpretovány podle CLSI . Testování antimikrobiální citlivosti bylo provedeno na některá antibiotika, která se v Tanzanii běžně používají v humánní medicíně. Pro E. coli byla testována čtyři antibiotika v uvedených koncentracích: ampicilin 10 µg, cefotaxim 30 µg, trimethoprim-sulfametoxin 25 µg a tetracyklin 30 µg. Enterokoky byly testovány na ampicilin 10 µg, erytromycin 15 µg, rifampin 5 µg, tetracyklin 30 µg a trimethoprim-sulfametoxin 25 µg. Všechny disky s antibiotiky pocházely od firmy Oxoid, Basingstoke, UK.
Etické aspekty
Povolení k provedení této studie udělil městský úředník pro hospodářská zvířata v Morogoro a etické schválení studie vydaly etické komise Sokoine University of Agriculture, Tanzanie. Před odběrem vzorků byl od každého chovatele získán ústní souhlas.
Výsledky
Ze 100 vykultivovaných vzorků trusu bylo 91 % vzorků E. coli, z nichž 64 (70,3 %) vykazovalo rezistenci k různým testovaným antibiotikům (tabulka 1). Vícenásobnou rezistenci k antibiotikům vykazovaly E. coli: 28 (30,8 %) izolátů na čtyři antibiotika, 35 (38,5 %) na tři antibiotika, 13 (14,3 %) na dvě antibiotika, 11 (12,1 %) izolátů na jedno antibiotikum. Enterokoky byly izolovány ze všech vzorků a 42 % z nich vykazovalo rezistenci k různým testovaným antibiotikům. Pět procent izolátů enterokoků bylo rezistentních ke všem antibiotikům, 13 % ke čtyřem antibiotikům, 21 % ke třem antibiotikům, 26 % ke dvěma antibiotikům a 28 % k jednomu testovanému antibiotiku. Výsledky týkající se chovu kachen a jejich možného přístupu k reziduím antibiotik jsou shrnuty v tabulce 2. Z 26 dotazovaných chovatelů 92,3 % hospodařilo s kachnami extenzivně, kdy měly přístup ke skládkám. Nebylo zaznamenáno podávání veterinárních léčiv kachnám, ale respondenti uváděli, že léčí jiná zvířata pomocí tetracyklinů/oxytetracyklinů.
Diskuse
V současné studii bylo zjištěno, že míra izolace E. coli byla 91 %, zatímco všechny kachny obývaly enterokoky a izoláty měly vysokou míru rezistence k více antibiotikům. Tato studie vrhá světlo na to, že indikátorové bakterie z volně žijících mrchožravých kachen v Tanzanii mohou být použity ve studiích rezistence k antibiotikům. To naznačuje, že problém rezistence na antibiotika je rozšířený i u bakterií izolovaných ze zvířat, která nejsou léčena antibiotiky. To má dopad na veřejné zdraví, protože kachny shánějí krmivo v okolí usedlostí a vylučují svůj trus všude možně a rezistentní bakterie se mohou dostat do potravního řetězce a ovlivnit člověka nebo se rezistentní gen může přenést na patogenní bakterie .
Odhadovaná prevalence rezistence k antibiotikům u E. coli izolované během této studie je srovnatelná s rezistencí hlášenou v Malajsii . V Nigérii byla zaznamenána nízká prevalence 8,6 % pravděpodobně v důsledku používání různých antibiotik, jako je ofloxacin, kyselina nalidixová a gentamycin . Vysoká prevalence rezistence k antibiotikům pozorovaná během této studie pravděpodobně kachny neustále vystavuje reziduím antibiotik z výplachů zvířat a lidí z důvodu širokého používání . Studie ukazují, že antibiotika používaná u potravinových zvířat se ve střevě špatně vstřebávají a mateřské sloučeniny se vylučují výkaly . To potvrzuje několik studií, které uvádějí vysoké hladiny reziduí antibiotik v odpadních vodách a zvířecích odpadech . Proto je normální flóra v mrchožroutech neustále vystavena reziduím antibiotik, což způsobuje, že se u nich vyvíjí rezistence, jak bylo pozorováno během této studie.
Rezistence E. coli k ampicilinu byla nejvyšší (81 %) ve srovnání s ostatními antibiotiky použitými ve studii podobně jako v předchozí zprávě na Slovensku, kde byla zaznamenána rezistence 87,8 % . Obecně studie ukazují, že u 60-70 % izolátů E. coli se vyvinula rezistence vůči ampicilinu . To může být způsobeno příliš častým používáním ampicilinu v lidské praxi, jehož rezidua jsou potenciálním zdrojem kontaminace životního prostředí, kde kachny shánějí krmivo. V případě sulphamethoxinu byla zaznamenána rezistence 76 %, jak již dříve zaznamenal Van Tuat . Antibakteriální rezistence vykázaná u tetracyklinu byla v této studii 59 %, zatímco na Slovensku 37,5 % a v Nigérii 75 % . Zajímavé je, že E. coli vykazovala antibakteriální rezistenci také k cefotaximu, a to 63 %, což je antibiotikum, které se v Tanzanii při léčbě zvířat běžně nepoužívá. Kachny mohou mít přístup k reziduím cefotaximu na skládkách, kde se nacházejí lidské výkaly a zbytky zlikvidovaných léčiv (tabulka 2). Vysoká rezistence k cefotaximu však byla pozorována u bakterií izolovaných z kanalizace různých zdravotnických zařízení .
Ve studii byla také pozorována vícenásobná rezistence E. coli k více než jednomu antibiotiku. Tato zjištění byla příliš vysoká ve srovnání se studií provedenou ve Vietnamu, kde vícenásobná rezistence E. coli na čtyři antibiotika činila 16,7 %, na tři antibiotika 20 % a na dvě antibiotika 23,3 % . Tento výskyt vícenásobné rezistence k léčivům naznačuje, že hospodářská zvířata hrají roli rezervoárů rezistentních bakterií pro kontaminaci životního prostředí . Bylo zjištěno, že u bakteriálních populací izolovaných ze střev zvířat vystavených působení antibiotik byla zjištěna pětkrát vyšší pravděpodobnost rezistence k danému antibiotiku. Nerezistentní bakterie obvykle získávají extrachromozomální plazmidy rezistence k antibiotikům (R-plazmidy) od rezistentních bakterií, když jsou v těsném kontaktu . K pozorované rezistenci může přispívat nerozumné používání antibiotik, při kterém se do životního prostředí uvolňuje značné množství reziduí. Dalšími faktory, které způsobují rozvoj rezistence, může být snadná dostupnost a bezuzdné používání širokospektrých antibiotik při presumptivní léčbě infekcí i ve zdravotnických zařízeních. Nedostatečné prosazování předpisů o používání antibiotik v rámci programů kontroly infekcí mohlo do značné míry ovlivnit strukturu výsledků rezistence.
Enterokoky jsou přirozenými komensály lidského a zvířecího střeva. Všechny studované kachny měly ve střevním obsahu Enterococci spp. které vykazovaly 42% míru rezistence k různým testovaným antibiotikům. Nicméně výsledky této studie ukázaly vysokou rezistenci k rifampicinu (62 %), ampicilinu (62 %) a tetracyklinu (42 %). U více než 65 % izolátů byla rovněž pozorována rezistence k více léčivům. Jak již bylo uvedeno dříve, pozorovaná rezistence bakterií k různým testovaným antibiotikům při absenci použití léčivých přípravků u kachen by mohla být způsobena rezidui vypouštěnými do prostředí, kde se kachny mrskají, mohou se snadno dostat do kontaktu s antibiotiky a dalšími rezistentními bakteriemi . Při kontaktu rezistentních bakterií s nerezistentními může dojít k výměně genetického materiálu a získání rezistentního genu. Jinde studie uvádějí, že Enterococci spp. izolované z kachen vykazovaly rezistenci vůči makrolidům a linkosamidovým antibiotikům . Nicméně Enterococci spp. jsou vnitřně rezistentní vůči několika skupinám antibiotik včetně cefalosporinů a aminoglykosidů. Kromě toho mnoho kmenů obsahuje přenosné genetické elementy pro získanou rezistenci k různým antibiotikům, jako je tetracyklin . Další studie rezistence k antibiotikům u Enterococci spp. izolovaných z kachen byly provedeny za použití antibiotika vankomycinu . Do budoucna se navrhují další studie citlivosti Enterococci spp. na vankomycin, protože toto antibiotikum je dnes v Tanzanii běžným lékem v humánní medicíně.
Dotazníková studie dále podporuje laboratorní pozorování o vysoké míře rezistence, kterou vykazují E. coli a Enterococcus spp. Bylo zjištěno, že antibiotika jsou široce používána při léčbě zvířat a lidí. Bez ohledu na to, že se veterinární léčiva v dušičkách nepoužívají, rozsáhlý systém nakládání s mrchožrouty je vystavuje působení reziduí antibiotik a dalších bakterií ze zvířat a lidí, kteří antibiotika užívali. To potvrzují i zjištění, že zjištěná rezistence byla k antibiotikům, která se běžně používají u lidí a zvířat (tabulka 2). Rezistentní bakterie byly izolovány z různých zdrojů včetně vypouštění odpadních vod a životního prostředí . Zbytky a nádoby s léky byly náhodně odhozeny v okolním prostředí domácností, což mohlo kachny vystavit působení antibiotik. Proto může systém intenzivního chovu kachen pomoci minimalizovat zbytečné vystavení ptáků reziduím antibiotik.
Závěr
Obecně byla rezistence k antibiotikům, kterou v této studii vykazovaly E. coli a Enterococcus spp. To ukazuje na roli, kterou hrají hospodářská zvířata a kuřata, která jsou neustále na antibiotikách, jako potenciální primární zdroje genů rezistence k antibiotikům pro bakterie izolované z kachen. Izolace multirezistentních E. coli a Enterococcus spp. z kachen slouží jako potenciální přenašeči kmenů rezistentních k antibiotikům na člověka a představuje vážný problém pro veřejné zdraví.
Omezení
V této studii bylo použito pouze 100 vzorků kachen odebraných z obce Morogoro, což omezuje zobecnění výsledků, aby mohly být použity jako reprezentativní o stavu antimikrobiální rezistence u E. coli a Enterococcus spp. u kachen v Tanzanii. Také počet testovaných antibiotik byl malý. Testování citlivosti bakterií na antibiotika metodou diskového difuzního testu může být horší než bujónové mikrodiluční metody. Studie také neurčila genotypy rezistence u E. coli a Enterococcus spp., které byly rezistentní k různým typům antibiotik. Nicméně přítomnost jiných zvířat v místě, kde byl proveden odběr vzorků z kachen, působí jako matoucí faktor na míru rezistence zjištěnou u bakteriálních izolátů z kachen.
.