[Antigen retrieval: its significance and drawbacks in immunohistochemistry]

Jedním z největších problémů v imunohistochemii bylo, jak zachovat dobrou morfologii i imunoreaktivitu antigenů v tkáňových řezech. Byly vyvinuty různé techniky pro získání imunoreaktivity antigenů (odmaskování) po rutinní přípravě tkáně, jako je fixace, dehydratace a vložení, které si nyní nacházejí cestu k použití pro imunoznačení nejen při cytohistologických vyšetřeních, ale i při patoklinické diagnostice. V této zprávě byly nejprve zkoumány mechanismy a význam fixace i získávání antigenu z hlediska inaktivace proteinů. Za druhé byly přezkoumány některé praktické problémy a poznámky ke dvěma nejoblíbenějším technikám demaskování, enzymovému štěpení a tepelně indukovanému získávání epitopů (HIER), aby bylo možné tyto techniky přesně přizpůsobit v imunohistochemii. Hlavním artefaktem vyvolaným fixací je maskování tkáňových antigenů v důsledku zesíťování aminokyselinových zbytků proteinů. Je důležité zvolit vhodné podmínky fixace pro každý antigen s ohledem na jeho biochemickou povahu a odolnost vůči fixaci. (tabulka 2) a udržovat fixační podmínky na minimu, aby bylo možné snadno získat imunoreaktivitu antigenu různými technikami demaskování (tabulka 3, obr. 1). Získání antigenu jako takové je proces způsobující denaturaci proteinů ve tkáních, stejně jako mnoho dalších procesů inaktivace proteinů (tab. 1). Enzymové štěpení může natrávit maskující části proteinů kolem antigenu a odhalit tak jeho epitop. Ačkoli je enzymové štěpení relativně jednoduché a podmínky jeho zpracování snadno kontrolovatelné, výsledky nemusí být nutně dramatické a konzistentní v závislosti na typech nebo množství enzymů. Proto je třeba najít si vlastní návod na trávení, aby se dosáhlo nejlepšího výsledku barvení pro každý antigen (např. tabulka 4). Například trávení pepsinem poskytlo nejlepší výsledky při imunobarvení brom-deoxyuridinu (BrdU) a jaderného antigenu proliferujících buněk (PCNA), zatímco ostatní enzymy měly malý vliv (tabulka 5). Zahřívání může také štěpit polypeptidovou páteř a narušovat příčné vazby vzniklé fixací. Účinek zahřívání na získávání antigenu je závislý na teplotě a zdá se, že je úměrný součinu teploty a času. V případě imunobarvení PCNA na paraformaldehydem fixovaných parafinových řezech bylo nutné zahřívání při 90 °C po dobu nejméně 3 min, avšak s přibývajícími podmínkami zahřívání se zvyšovalo i nespecifické barvení pozadí (tab. 6), což je jeden z nejzávažnějších problémů při získávání antigenu (obr. 2a, c). Jednou z možných voleb, jak se vyhnout těmto nežádoucím výsledkům, je kombinace suboptimálního zahřívání (při 80 °C po dobu 10-15 min) a pepsinového štěpení (obr. 2b, d). Důležitou teoretickou úvahou pro použití takto dramatické metody denaturace je, zda lze maskované epitopy antigenu dostatečně odhalit, aniž by došlo k falešně pozitivním (nebo falešně negativním) výsledkům s dříve důvěryhodnými protilátkami. Zdá se, že každý antigen vyžaduje přípravu tkáně „na míru“ pro optimální zachování jeho antigenicity a přesné lokalizace. V souladu s rozvojem imunologie, molekulární biologie, genetiky nebo embryologie by měla vzrůst potřeba vícenásobného imunoznačení v kombinaci s dalšími technologiemi, jako je hybridizace in situ, aby bylo možné analyzovat prostorové a funkční vztahy mezi různými molekulami in situ. Získávání antigenů by se pak stalo účinnou strategií.