Antispermální protilátky:

Znovu se diskutuje o detekci a klinickém významu antispermálních protilátek (ASA) (Helmerhorst et al., 1999). Ačkoli se opatrně dochází k závěru, že ´existuje důvod přijmout protilátkovou antispermální imunitu jako příčinu subfertility´, autoři uvádějí tři důvody, proč se kliničtí lékaři nepřiklánějí k testování ASA u subfertilních párů: (i) chybí standardizovaný a všeobecně uznávaný test na ASA; (ii) chybí shoda ohledně klinických důsledků ASA; a (iii) chybí důkazy pro mechanistické vysvětlení, jak ASA narušuje početí. Každé z těchto tří tvrzení si zaslouží komentář.

Diskuse Helmerhorsta et al. (1999) vychází striktně z moderních imunologických konceptů, což vede k doporučení imunoblottingu a afinitní chromatografie jako perspektivních v této oblasti. U těch, kteří se v této oblasti pohybují již řadu let, mohou tato doporučení vyvolat pocit deja vu. Před ~20 lety to byla běžná strategie a od té doby bylo provedeno mnoho studií pomocí enzymatických imunosorbentních testů (ELISA) s použitím spermií nebo antigenních frakcí a pomocí imunoblottingu (Lehmann et al., 1985; Mettler et al., 1985). Výsledky však byly obecně zklamáním; nebylo dosaženo očekávané jasnosti. Neexistuje dobré vysvětlení tohoto neúspěchu, ale jedním z aspektů problému může být to, že konvenční imunologické myšlení nestačí k dosažení pokroku v reprodukční imunologii. Je třeba vzít v úvahu také fyziologii reprodukce. Pohled na možné in-vivo účinky ASA to může ilustrovat.

Mechanistické vysvětlení zhoršení početí působením ASA?“

Tvrzení Helmerhorsta a kol. o ´neexistenci důkazů pro mechanistické vysvětlení toho, jak ASA zhoršují početí´, je poněkud překvapivé, zejména v nizozemské práci, dokonce v práci z Groningenu. Právě v Groningenu vynikající skupina pod vedením Jana Kremera prokázala, že migrace spermií s ASA třídy imunoglobulinu (Ig) A na povrchu přes cervikální hlen je silně narušena, zřejmě proto, že Fc část molekuly IgA (ale ne molekuly IgG) se účinně váže na micely cervikálního hlenu (Jager et al., 1980). Při testu kontaktu spermií s cervikálním hlenem bylo procento spermií pokrytých IgA protilátkami úměrné procentu spermií vykazujících tzv. fenomén ´třesení´, tj. těžký pohyb ocásku bez postupu vpřed v cervikálním hlenu. Další důkaz o významu IgA byl nalezen, když se ukázalo, že ošetření spermií pokrytých IgA proteázou IgA1 zlepšilo migraci spermií cervikálním hlenem (Bronson et al., 1987).

To znamená, že IgA protilátky proti jakémukoli antigenu exprimovanému na membráně spermií zhorší penetraci a že v této situaci se stává důležitější imunoglobulinová třída ASA než specifita antigenu. To je v rozporu s běžnými imunologickými reakcemi, což může být důvodem, proč je fenomén třepání v imunologických diskusích často opomíjen. Jedná se však zřejmě o velmi účinný mechanismus; při pokusech s migrací spermií pokrytých IgA do cervikálního hlenu v kapilárách se spermie pacientů se silnou imunitní reakcí často dostaly jen několik mm do hlenu. Na vazbu Fc části IgA na cervikální hlen je třeba pohlížet z evoluční perspektivy. Vzhledem k tomu, že cervikální hlen je jedinou bariérou mezi okolním prostředím a ženským pohlavním ústrojím a peritoneální dutinou, musí v hlenu existovat obranné mechanismy, které brání průniku mikroorganismů do pohlavního ústrojí. Tuto funkci plní protilátky IgA proti mikroorganismům, které mikroorganismy zachycují. Ve vzácných případech, kdy žena vytvořila protilátky IgA proti spermiím, nebo častěji, kdy jsou spermie vstupující do hlenu již pokryty IgA, bude výsledek stejný: zachycení spermií nebo zhoršení migrace.

Konvenčnější imunologický mechanismus, kterým by ASA mohla snížit plodnost, by spočíval ve vazbě na receptor, kterým se spermie připojují k vajíčku, čímž by se blokovala interakce spermie a vajíčka. V této situaci bude rozhodující antigenní specifita ASA, a protože v membráně spermií je více než jeden autoantigen, nemusí mít tento účinek všechny ASA. V posledních dvou desetiletích byl tento jev intenzivně studován v souvislosti s oplodněním in vitro (IVF) za použití spermií mužů s ASA. Téměř ve všech studiích bylo pozorováno významné snížení procenta oplodněných vajíček. Jedna z prvních studií také naznačila, že blokační účinek je způsoben hlavně protilátkami IgA (Clarke et al., 1985), ale v pozdějších studiích to nebylo zaznamenáno a absorpční experimenty ukázaly, že inhibiční účinek mohou způsobovat také protilátky IgG (Bronson et al., 1982). Zvláště ilustrativní je nedávná studie o vazbě spermií na zona pellucida (Francavilla et al., 1997). V každém experimentu přidali stejný počet spermií od plodné osoby a od pacienta se silnou reaktivitou v imunobead testu, takže oba druhy spermií, označené různými fluorochromy, mohly soutěžit o vazbu na zona pellucida. Ve srovnání se spermatozoidy od plodných mužů byly spermatozoidy od pacientů s normálními vzorky spermatu (kromě přítomnosti ASA) inhibovány v ~ 50 % případů, zesíleny v několika případech a neovlivněny ve zbývajících případech, což odpovídá konceptu, že specifita protilátek musí hrát roli. Nicméně navzdory silné imunitní odpovědi pacientů s vysokými titry cirkulující ASA a ve většině případů s IgG i IgA na téměř všech spermiích nebyla inhibice nikdy úplná, ale některé spermie pokryté protilátkami byly vázány na zona pellucida. To je v souladu se zkušenostmi z mnoha jiných studií IVF, že i když může být procento oplozených vajíček sníženo přítomností ASA, některá vajíčka obvykle oplozena byla.

Z této diskuse o možných účincích ASA na snížení fertility vyplývá, že narušení migrace spermií cervikálním hlenem protilátkami IgA je velmi účinný mechanismus, zatímco blokování interakce spermie-ovum (způsobené jak IgG, tak IgA ASA) se zdá být méně účinné, pravděpodobně zřídka zabrání, ale možná oddálí početí. Klinické zkušenosti tyto závěry podporují. Na klinikách pro léčbu neplodnosti mají muži s ASA zřídka izolovanou reakci IgG, ale obvykle se u nich vyskytuje směs protilátek IgG a IgA. Na druhou stranu ve studiích plodnosti u vasektomovaných a následně vazovasostomovaných mužů nebyly imunitní odpovědi omezené na třídu IgG vzácné, ale zdálo se, že tito muži mají normální plodnost, zatímco míra plodnosti byla nepřímo úměrná odpovědi IgA (Meinertz et al., 1990). Zdá se tedy, že ´nedostatek důkazů pro mechanistické vysvětlení´ by neměl klinickému lékaři bránit v testování pacientů (přinejmenším mužů) s problémy s plodností na ASA.

Nedostatek standardizovaného a všeobecně uznávaného testu na ASA?

Ačkoli proti tomuto tvrzení Helmerhorsta et al. (1999) nelze nic namítat, je otázkou, zda je spravedlivým a nezbytným požadavkem, aby byl test používán? Pokud ano, mohlo by dojít k dramatickému omezení širokého spektra laboratorních testů. Zdá se, že zásadní otázkou je, zda určité testy na ASA poskytují klinicky relevantní výsledky.

Po mnoho let byly běžnými testy aglutinační testy spermií (buď makroskopická želatinová aglutinace, nebo mikroskopická aglutinace na zásobníku) (Rose et al., 1976). V poslední době jsou tyto testy diskreditovány a často popisovány jako nespolehlivé, zejména v souvislosti s popisem nových technik. Je pravda, že žádná z nich není ideální, obě vyžadují čerstvé vzorky spermatu optimální kvality. Při želatinovém aglutinačním testu se používají velké objemy spermatu a při zásobníkovém aglutinačním testu je třeba zkušeností a opatrnosti při odečítání výsledků, aby bylo možné rozlišit skutečné aglutináty od nespecifických shluků. Přesto tyto testy poskytují u mužů klinicky relevantní výsledky. Několik studií ukázalo, že vysoké titry v séru nebo volné protilátky v seminální plazmě se vyskytují velmi zřídka, s výjimkou pacientů s problémem plodnosti (u ~10 % mužů z párů s nevysvětlitelnou plodností) (např. Bronson et al., 1985) a u normospermických mužů v následné studii (Rümke et al..), 1974), zvyšující se titry v séru při želatinové aglutinaci korelovaly s klesající plodností (např. pouze 12,5 % z 64 mužů s titry od 128-512 a žádný z 11 mužů s titry ≥1024 neměl během sledovaného období 2-16 let indukované početí). Vzhledem k tomu, že ASA detekované v séru jsou převážně třídy IgG, může se zdát zvláštní, že titry v séru souvisejí s neplodností, pokud je protiplodnostní účinek ASA způsoben především IgA protilátkami ve spermatu. Vysvětlení spočívá v tom, že protilátky IgA se velmi zřídka vyskytují bez protilátek IgG a vysoké koncentrace IgA se vyskytují hlavně u pacientů, kteří mají také vysoké koncentrace IgG.

Neméně důležitým zjištěním v těchto studiích bylo, že nízké koncentrace protilátek (titry 4-16) byly stejně časté u plodných kontrol i neplodných pacientů, což naznačuje, že takto nízké hodnoty zřejmě nijak významně neovlivňují plodnost.

V poslední době se stal nejpopulárnějším nepřímý imunobead test (Bronson et al..), 1982). Čerstvé spermie, odebrané technikou swim-up, se inkubují se sérem nebo seminální plazmou, poté se pečlivě promyjí a přidají se imunokuličky pokryté anti-IgG nebo anti-IgA (nebo anti-IgM). Pod mikroskopem jsou vidět imunokuličky přiléhající k pohyblivým spermiím, pokud vzorek obsahuje ASA správné imunoglobulinové třídy. Použití antiimunoglobulinu zaručuje specifičnost reakce; je to velmi citlivý test, určuje imunoglobulinovou třídu ASA a vyžaduje pouze malé množství spermií, což z něj zřejmě činí ideální test. Přesto existuje problém. Aby byl test proveditelný, provádí se obvykle pouze s jedním ředěním séra, obvykle s nízkým ředěním (nejčastěji 1:4). V takových případech funguje nepřímý imunoglobulinový test jako velmi citlivý screeningový test, takže i nízké hladiny protilátek bez významu pro plodnost (což je pravděpodobně hlavní část pozitivních reakcí) mohou vyvolat silné reakce, přinejmenším pro IgG (např. viz Bronson et al., 1985). To může vysvětlovat, proč několik vyšetřovatelů zpochybnilo hodnotu testování na ASA a význam ASA jako příčiny neplodnosti. Pokud by se test prováděl s vyššími ředěními séra (např. 1:50 a 1:250), mohl by poskytnout lepší klinické vodítko.

Nejracionálnějším způsobem testování ASA u mužů je zřejmě stanovení imunoglubulinů (IgG a IgA) na povrchu pacientových spermií pomocí přímé smíšené aglutinační reakce (MAR) nebo imunobead testu. Oba testy jsou rychlé, snadné a citlivé, ale vyžadují pohyblivé spermie, aby se zajistilo, že erytrocyty nebo imunokuličky přilnou k membráně spermií. Jsou to vynikající screeningové testy; pokud je reakce negativní nebo slabě pozitivní (≤ 50 % pohyblivých spermií nese imunoglobuliny), může mít pacient sotva problém s neplodností způsobený ASA a další imunologické testy nejsou potřeba. Na druhou stranu, pokud mají všechny nebo většina spermií na své membráně imunoglobuliny, je obtížnější vyhodnotit důsledky pro plodnost, především proto, že tyto citlivé testy nedokáží rozlišit mezi spermiemi s pouze nepatrným množstvím imunoglobulinu a spermiemi, které jsou plně nasyceny protilátkami na všech dostupných molekulách antigenu. Jak pro IgA indukované zhoršení migrace spermií cervikálním hlenem, tak pro možné zablokování interakce spermie-ovum je třeba předpokládat, že roli hraje počet molekul protilátek. V této situaci může být užitečné stanovení ASA v séru a seminální plazmě. Při vysokých titrech v séru nebo nadbytku volné ASA v seminální plazmě se zdá být pravděpodobné, že množství ASA na spermiích bude také vysoké.

To, že tyto teoretické úvahy jsou v souladu s klinickou realitou, nejzřetelněji ilustrovala naše výše zmíněná navazující studie na vazovasostomizovaných mužích (Meinertz et al..), 1990).

V průběhu sledovaného období (22-111 měsíců, medián 44 měsíců) došlo u 10 z 15 mužů (66,7 %) s negativním přímým MAR (≤ 10 % pohyblivých spermií s ulpělými erytrocyty) k indukci početí, ale stejně tak u 42 ze 79 mužů (53,2 %) s pozitivním MAR (Fisherův dvouhrotý přesný test: P = 0,4995). Pouhá pozitivita MAR (>10 % pro IgG nebo IgA) tedy neposkytovala žádnou informaci o stavu plodnosti. Většina mužů s ASA měla na spermiích IgG i IgA, ale někteří měli pouze IgG. Reakce čistě na IgA nebyly zaznamenány. Při pohledu na muže s imunitními reakcemi omezenými na třídu IgG byla míra početí u celé skupiny 85,7 % (18/21) a u mužů s IgG na všech spermiích byla stejně vysoká (11/13 = 84,6 %). U IgG tedy nebylo možné zaznamenat žádný antifertilitní účinek; ve skutečnosti byla míra početí pozoruhodně vysoká, dokonce vyšší než u pacientů bez ASA (i když rozdíl nebyl statisticky významný). Na druhou stranu u mužů s reaktivitou IgG i IgA byla zjištěna klesající plodnost s rostoucí reaktivitou IgA. U celé skupiny byla míra početí 42,9 % (24/56) a u těch s IgA na všech spermiích 21,7 % (pět z 23). Ve srovnání se skupinami s reaktivitou pouze IgG byly rozdíly vysoce signifikantní. Při pokusu o identifikaci mužů se zvláště silnou imunitní reakcí se ukázalo, že u žádného z 10 mužů se 100% reaktivitou IgA v MAR a cirkulujícími aglutininy ve spermiích v titrech 256 nebo vyšších se nepodařilo vyvolat těhotenství a pouze u jednoho ze 13 mužů se 100% reaktivitou IgA v MAR a volnými aglutininy ve spermatické plazmě.

Ačkoli v současné době neexistuje jediný test, který by dokázal jednoznačně vyhodnotit stav plodnosti u jednotlivého pacienta s ohledem na imunitní subfertilitu nebo neplodnost, zdá se být oprávněný závěr, že vhodnou kombinací testů (např. testů MAR nebo imunoglobulinů v kombinaci s aglutininy spermií v séru nebo seminální plazmě) se můžeme tomuto cíli poměrně přiblížit. Nedávný průzkum diagnostiky a léčby ASA prováděný centry reprodukční medicíny ve Velké Británii (Krapez et al., 1998) ukázal, že velká většina center tuto strategii skutečně dodržuje. Tak 44 ze 48 center testovalo ASA na spermiích pomocí přímého MAR (28 laboratoří) nebo imunobead testů (19 laboratoří). V některých případech byla testována také seminální plazma a 17 laboratoří vyšetřovalo sérum mužských partnerů různými testy, především zásobníkovým aglutinačním testem. To znamená, že téměř všechna centra snadno identifikovala muže, kteří by mohli mít imunologickou příčinu své subfertility. I když je to to nejlepší, co lze v současné době udělat, není to optimální. Potřebujeme techniku, která by dokázala přesněji identifikovat muže, kteří mají imunologický problém. V současné době se jako slibná technika jeví průtoková cytometrie, která by mohla být schopna určit přesné množství IgG a IgA na jednotlivých spermiích (Räsanen et al., 1992; Ke et al., 1995).

Nedostatek shody o klinických důsledcích ASA?“

Na první pohled se toto tvrzení Helmerhorsta et al. může zdát správné, ale je otázkou, zda lze srovnávat vyšetření s mnoha různými technikami a kritérii? Před lety se všeobecně věřilo, že ASA může způsobit neplodnost, ale dnes se zdá být situace mnohem méně jasná. Důvodů pro tuto změnu názoru může být několik.

Předně jsme se dozvěděli, že i při nejvyšších hladinách ASA (zejména IgA) lze jen stěží vyloučit početí. Proto je spíše otázkou, do jaké míry může ASA způsobovat subfertilitu. Studie o mužské neplodnosti, o nichž pojednává tento přehled, byly většinou založeny na různých konvenčních (někdo by mohl říci staromódních) technikách. Ačkoli je shoda možná příliš silným slovem, výsledky těchto studií jsou obecně v dobré shodě, což naznačuje, že nízké hladiny ASA škodí jen málo, poněkud vyšší hodnoty (zejména IgA) způsobují subfertilitu, která se u velmi vysokých hladin ASA blíží neplodnosti; závěr, který zřejmě představuje vážnou překážku pro pokusy o výrobu vakcíny proti neplodnosti založené na antigenech spermií!

Druhé, když se zavádějí nové testy na ASA, měly by se porovnat s konvenčními testy, a pokud nestanovují stejný druh ASA, mělo by se na to pamatovat. Když byla před 15 lety provedena multicentrická studie Světové zdravotnické organizace (WHO) o protilátkách proti reprodukčním antigenům, ukázalo se, že několik technik, včetně většiny ELISA, imunoblotovacích technik, pasivní hemaglutinace a testů cytotoxicity, nezjistilo ASA zaznamenané konvenčními technikami. Kromě toho měly výsledky obvykle malý klinický význam a nevykazovaly žádný významný rozdíl mezi fertilními a neplodnými skupinami (Hjort et al., 1985). Na to se bohužel v diskusích o ASA často zapomíná.

Zatřetí je třeba do testování zahrnout kvantitativní hledisko a imunoglubulinovou třídu protilátek. Tedy všichni pacienti s reaktivitou v přímém testu MAR nebo imunobead by neměli být považováni za jednu skupinu, ale ti se slabou reaktivitou (pravděpodobně fertilní) by měli být odlišeni od těch, kteří mají protilátky téměř na všech spermiích (pravděpodobně subfertilní), a podobně ti, kteří mají pouze IgG (pravděpodobně fertilní), by neměli být směšováni s těmi, kteří mají silnou reaktivitu pro IgG i IgA (pravděpodobně subfertilní nebo neplodní).

Nedávný průzkum center reprodukční medicíny ve Velké Británii (Krapez a kol, 1998) ukázal, že obvykle se nerozlišuje mezi IgG a IgA ASA. To je pravděpodobně způsobeno skutečností, že většina neplodných mužů s ASA bude mít na spermiích směs obou tříd imunoglobulinů. Pokusy o léčbu pacientů se však dobře shodují se závěry vyplývajícími z laboratorních vyšetření a ´klinických experimentů´ (studie na vazovasostomizovaných mužích). Ve většině center se tedy k překonání IgA indukované poruchy průniku spermií cervikálním hlenem používá intrauterinní inseminace. U pacientů se silnou imunitou vůči spermiím (>50% reaktivita v MAR nebo imunobead testu) byla použita buď IVF, nebo intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI), ale obecně s liberálními indikacemi ve srovnání s výše uvedenými závěry. To zřejmě odráží skutečnost, že ASA často není jedinou příčinou neplodnosti u těchto pacientů, ale roli může hrát i nízký počet spermií, špatná pohyblivost nebo problémy u partnerky. Antifertilní účinky ASA je tedy obtížné analyzovat ve skupinách neplodných pacientů.

Vasektomovaní a následně vazovasestomovaní muži se zdají nabízet mnohem lepší skupinu; ve skutečnosti skupinu velmi podobnou experimentálním zvířatům. Oba partneři obvykle již dříve prokázali svou plodnost, takže lze vyloučit genetické faktory neplodnosti. Lze vybrat skupinu mužů, kteří byli vasektomizováni po omezenou dobu a kteří prodělali úspěšnou vazovasostomii s přijatelným počtem spermií vykazujících dobrou pohyblivost ve vzorku spermatu. Pokud tedy byli oba partneři od posledního početí zdraví, jsou jiné faktory neplodnosti než možná ASA mnohem méně pravděpodobné než u skupiny neplodných pacientů. Velkou výhodou u skupiny pacientů s vasovasostomií je skutečně to, že jejich stav plodnosti není od počátku znám, a proto je automaticky zařazena kontrolní skupina; tj. někteří nemají ASA, někteří mají pouze IgG a někteří mají IgG i IgA. Tato skupina se zdá být ideální pro studium účinků ASA a pro hodnocení nových technik a je překvapivé, že byla tak málo využívána. Zásadní otázkou v této souvislosti samozřejmě je, zda vasektomovaní muži produkují protilátky proti všem stejným antigenům, proti kterým mohou reagovat neplodní muži. Je třeba provést další studie, ale zatím nemáme žádné důkazy, že by tomu tak nemělo být.

To vede k závěru, že imunologie spermií může klinikům poskytnout užitečné informace. V současné době, kdy lze imunologický faktor spolu s mnoha dalšími faktory neplodnosti překonat technikami asistované reprodukce, nemusí být tak zásadní. Stále je však dobrou zásadou dosáhnout co nejpřesnější diagnózy před zahájením léčby.

.