Apc-related models of intestinal neoplasia: a brief review for pathologists

Kolorektální karcinom je v západním světě častou příčinou úmrtí na rakovinu. V mnoha patologických ordinacích tvoří kolorektální adenomy odstraněné při screeningových kolonoskopiích vysoké procento denní pracovní zátěže, a proto je morfologie lidského kolorektálního karcinomu a adenomů, jeho prekurzorových lézí, chirurgickým patologům dobře známá. V akademických centrech mohou být chirurgičtí patologové požádáni, aby pro vyšetřovatele interpretovali myší modely neoplazie, a pro přesnou interpretaci je nezbytné základní pochopení podobností a rozdílů mezi morfologií lidské střevní neoplazie a myšími modely.

Geneticky změněné myší modely tumorigeneze, i když jsou někdy kritizovány pro nedokonalé modelování lidského onemocnění, jsou užitečné při posuzování, zda specifické mutace mohou vést ke vzniku nádoru, pro studie chemoprevence a pro objasnění funkčnosti změněných genových produktů. Ačkoli je ve vědecké literatuře popsáno mnoho geneticky upravených myších modelů střevní neoplazie, lze je obecně rozdělit do 5 skupin: Modely související s Apc se změnami v signalizaci Wnt, modely s deficitem mismatch repair, modely ošetřené karcinogeny, modely se změnami v transformujícím růstovém faktoru β a neoplazie související s kolitidou vznikající u imunodeficitních modelů, jako jsou IL10-/- myši. Tento přehled se zaměří na patologii jednoho z prvních GEM modelů střevní neoplazie, myši ApcMin+/- a příbuzných modelů, s cílem popsat morfologické rysy střevních lézí s porovnáním s lidskými kolorektálními adenomy a karcinomy.

Jedním z nejpoužívanějších modelů lidské střevní neoplazie je model ApcMin+/-, vyvinutý v roce 1990 v laboratoři Williama Dovea (Moser et al., 1990). Myš ApcMin+/-, první zárodečný mutantní myší model střevní neoplazie, nese autozomálně dominantní mutaci ztráty funkce v kodonu 850 Apc, která vznikla působením N-ethyl-N-nitrosourey (ENU), vysoce účinného mutagenu. Od té doby byla vytvořena řada dalších modelů s mutací Apc, z nichž mnohé mají zkracující mutace (tabulka 1).

Tyto modely související s Apc jsou obzvláště užitečné, protože nejčastější řídící mutací pro kolorektální karcinom u lidí je mutace v nádorovém supresorovém genu APC, vedoucí k inaktivaci APC a aktivaci signální dráhy Wnt se stabilizací β-kateninu a jeho translokací do jádra. Gen APC u lidí kóduje 213 kilodaltonový protein, který se podílí na buněčné adhezi a motilitě, regulaci buněčného cyklu, apoptóze a přenosu signálu (Boman & Fields, 2013), a jeho zárodečná mutace vede k familiární adenomatóze polypózy (FAP). Tento nádorový predispoziční syndrom je charakterizován vznikem stovek kolorektálních adenomů, které vedou k adenokarcinomu v mladém věku. Většina mutací způsobujících FAP se nachází v 5′ polovině genu a vede ke zkráceným polypeptidům.

Genetika zvířecích modelů souvisejících s APC

Mnoho myších modelů souvisejících s Apc bylo vytvořeno tak, aby obsahovaly zárodečné mutace v Apc, které vedou k expresi zkráceného proteinu Apc; u většiny těchto modelů jsou životaschopní pouze heterozygoti, protože homozygotnost je embryonálně letální. Ztráta kontroly růstu při ztrátě zbývající divoké kopie Apc vede ke vzniku mnohočetných střevních adenomů. Konkrétní umístění mutace Apc ovlivňuje multiplicitu polypů, jejich umístění a délku života myší (McCart et al., 2008). Například myš Apc1638N/+ má ve srovnání s myší ApcMin/+ menší zátěž polypy a delší život (Smits et al., 1998), U myši Apc1322T si mutantní protein zachovává jednu 20-aminokyselinovou β-kateninovou vazebnou/degradační repetici (u ApcMin/+ není žádná); adenomy u těchto myší jsou detekovatelné dříve, mají závažnější dysplazii a jsou větší (Pollard et al., 2009) ve srovnání s myší ApcMin/+. Důležité může být také načasování ztráty funkce Apc; například postupná ztráta Apc pomocí Apc(Min/CKO) nebo Apc(1638N/CKO) vede ke vzniku hrubě viditelné neoplazie ve střevě, zatímco současná ztráta vede k okultní klonální expanzi prostřednictvím dělení krypt bez morfologické transformace (Fischer et al., 2012). Delece celého genu Apc u myší ApcΔel-15 vede k rychlejšímu rozvoji nádorů ve srovnání se zkrácením Apc, se sníženým přežitím, závažnější polypózou a pokročilejší progresí nádorů tlustého střeva ve srovnání s myší ApcMin/+ (Cheung et al., 2010).

K dispozici jsou také geneticky upravené modely potkanů s mutací Apc, které jsou atraktivní na základě dlouhověkosti modelů a relativně snadného provádění kolonoskopie, což umožňuje longitudinální experimenty (tabulka 2). Nejběžnějšími jsou potkan Kyoto Apc Delta (KAD) a potkan Pirc. Potkan KAD byl odvozen pomocí ENU mutageneze a má nesmyslnou mutaci v kodonu 2523 v exonu 15 Apc, čímž vzniká zkrácený protein. Tito potkani jsou v homozygotním stavu životaschopní a spontánně se u nich nevyvíjejí střevní nádory. K vyvolání střevní neoplazie je nutná léčba azoxymetanem a dextran sulfátem sodným (AOM/DSS). Potkan Pirc, který byl rovněž získán mutagenezí vyvolanou ENU, má mutaci Apc na nukleotidu 3409, která vytváří zkrácený protein. Tato mutace je v homozygotním stavu embyronicky letální. Mutace má 100% penetranci, přičemž u všech potkanů se po 4 měsících věku vyvinou polypy tlustého střeva.

Byl vyvinut geneticky upravený model prasete nesoucí mutaci APC 1311, ortologickou lidské APC 1309. U těchto zvířat se vyvíjejí aberantní ložiska krypt, adenomy jednotlivých krypt a mnohočetné kolorektální adenomy, podobně jako u lidské FAP. Větší adenomy vykazují progresi v podobě dysplazie vysokého stupně. Charakteristické je povrchové postižení podobné lidským adenomům (Flisikowska et al., 2012).

Modifikátory nádorových fenotypů

U modelu ApcMin+/-, který je obvykle chován na pozadí C57Bl/6J, je již dlouho známo, že kmenové rozdíly mají významný vliv na nádorovou zátěž. Křížení myší B6 Min/+ s AKR a dalšími inbredními kmeny vedlo ke snížení průměrného počtu nádorů u myší F1 (Shoemaker et al., 1997). Pokusy se zpětným křížením a další genetické analýzy s cílem zmapovat modifikační lokusy přinesly řadu kandidátních genů Modifier of Min (Mom) (McCart et al., 2008). Kromě toho má strava a střevní mikrobiom myší kolonie důležitý vliv na množení, progresi a velikost polypů. Například bylo prokázáno, že dieta s vysokým obsahem tuku a nízkým obsahem vlákniny západního typu zvyšuje počet polypů a progresi nádorů u myší ApcΔ716/+ (Hioki et al., 1997).

Patologie

Morfologie střevních lézí u ApcMin+/-a příbuzných modelů je u všech modelů podobná, i když věk vzniku, stupeň dysplazie a distribuce v gastrointestinálním traktu se liší (tabulka 1). Nejdříve rozpoznatelné léze se skládají z jedné zvětšené krypty nebo malého shluku krypt lemovaných přeplněnými buňkami se zvýšeným poměrem jádra k cytoplazmě a jadernou hyperchromazie (obr. 1). Tyto časné léze jsou dysplastické léze nízkého stupně podobné malým tubulárním adenomům tlustého střeva pozorovaným u pacientů s FAP. V tenkém střevě vzniká malá invaginace v lamina propria v proliferační zóně na rozhraní krypty a villy (obr. 2). Adenomatózní buňky se protlačují do lamina propria a nahoru do váčku, čímž se pod normální povrchovou sliznicí vytvoří dvojitá vrstva adenomatózního epitelu (obr. 3). V tlustém střevě časné adenomy invaginují do lamina propria mezi kryptami, i když lze identifikovat i adenomy v jednotlivých kryptách (Oshima et al., 1997). Imunohistochemie na beta katenin může pomoci identifikovat časné adenomy, protože i jednotlivé kryptové adenomy u ApcMin+/- a příbuzných modelů vykazují akumulaci jaderného beta kateninu (obr. 1). 4).

Jak adenomy rostou, vytvářejí polypoidní, stopkaté nebo někdy pohárkovité léze s propadlým středem (obr. 5a a b). V mnoha modelech adenomy nepokračují dále než k dysplazii nízkého stupně. U déle žijících modelů s menším počtem nádorů se však u některých z nich vyvine dysplazie vysokého stupně charakterizovaná kribriformní architekturou, při níž nejsou všechny buňky v kontaktu s bazální membránou (obr. 6). Četné mitotické figury a apoptotická tělíska jsou běžné u adenomů ve všech stadiích vývoje.

Střevní novotvary vznikající u ApcMin+/- a příbuzných modelů obsahují více typů buněk, ale jsou složeny především z buněk absorpčního typu a pohárkových buněk (tab. 3). Adenomy vznikající v tenkém střevě u ApcMin+/- a příbuzných modelů obsahují Panethovy buňky, které jsou snadno identifikovatelné při barvení hematoxylinem a eozinem (obr. 7) a zvýrazněné imunohistochemií na lysozym. Bylo prokázáno, že tvoří 10 % nebo méně buněk v adenomech tenkého střeva (Moser et al., 1992). Myší tlusté střevo neobsahuje Panethovy buňky, ale v adenomech tlustého střeva těchto modelů byly identifikovány buňky exprimující lysozym bez PAS pozitivity, což naznačuje diferenciaci podobnou Panethovým buňkám i v lézích tlustého střeva (Moser et al., 1992; Husoy et al., 2006). Neuroendokrinní buňky tvoří malou část buněk v adenomech typu ApcMin+/-, ale specifický typ buněk odráží neuroendokrinní buňky nalezené v normální střevní sliznici v místě adenomu (Moser et al., 1992). Například buňky exprimující serotonin jsou nejčastějšími neuroendokrinními buňkami ve střevě myší a nacházejí se v celém střevě; tyto buňky tvoří až 5 % buněk ApcMin+/- adenomů, v lézích z tenkého střeva a tlustého střeva (Moser et al., 1992). Naproti tomu PYY pozitivní buňky se nacházejí pouze v adenomu z distálního tračníku, což odráží normální distribuci těchto buněk. Neuroendokrinní buňky jsou difuzně rozptýleny po celém adenomu a netvoří malé shluky jako lysozym-pozitivní buňky (Moser et al., 1992).

Dysplazie ve střevních adenomech u myších modelů by měla být hodnocena pomocí stejné terminologie (dysplazie nízkého stupně, dysplazie vysokého stupně, intramukózní karcinom) a kritérií jako u lidských kolorektálních adenomů (Washington et al., 2013). Většina adenomů u myší ApcMin+/- a příbuzných modelů vykazuje dysplazii nízkého stupně, ale mnoho z nich se postupně zvětšuje, jak myš stárne, a několik z nich postupuje v sekvenci adenom-karcinom. Invazivní karcinom je vzácný, protože většina myší umírá na anémii nebo intususcepci před progresí. U několika déle žijících modelů s menším počtem adenomů se však vyvinul adenokarcinom invadující do submukózy (Colnot et al., 2004; Fodde et al., 1994; Robanus-Maandag et al., 2010). Metastázy se u myší ApcMin+/- nevyskytují a u příbuzných modelů jsou mimořádně vzácné (Fodde et al., 1994).

Chirurgičtí patologové, kteří jsou požádáni o analýzu střevních vzorků, by si měli být vědomi úskalí při hodnocení nádorové invaze u myších modelů. Vzhledem k tomu, že vrstvy myšího střeva jsou tenké a jemné, dochází často k herniaci benigního epitelu do submukózy (Boivin et al., 2003), zejména v případě prolapsu rekta a při zánětlivých stavech (obr. 8a a b). K podobnému posunu adenomové sliznice (pseudoinvazi) dochází u stopkatých kolorektálních adenomů u lidí a u colitis cystica profunda. Konsenzuální pokyny pro rozlišení herniace a invazivního adenokarcinomu byly vypracovány na semináři Mouse Models of Intestinal Neoplasia Workshop v Jacksonových laboratořích v roce 2000 skupinou vědců a patologů (Boivin et al., 2003) a jsou shrnuty v tabulce 4. Invazivní karcinom nemusí být možné s jistotou diagnostikovat, zejména u zánětlivých modelů nebo v oblastech prolapsu, a pro jednoznačné určení invaze může být nutné vyhodnocení starších myší s lépe vyvinutými lézemi.

Invaze do lamina propria je charakterizována vývojem angulárních profilů krypt s jednotlivými infiltrujícími buňkami a může být doprovázena stromálními změnami, jako je desmoplazie a zvýšená hustota zánětlivých buněk (obr. 9a a b).

.