Apocynin, nízkomolekulární perorální léčba neurodegenerativních onemocnění

Abstrakt

Shromažďující se důkazy naznačují, že zánětlivé mediátory vylučované aktivovanými rezidentními nebo infiltrovanými vrozenými imunitními buňkami mají významný vliv na patogenezi neurodegenerativních onemocnění. To může znamenat, že pacienti postižení neurodegenerativním onemocněním mohou mít prospěch z léčby selektivními inhibitory aktivity vrozené imunity. V tomto článku podáváme přehled terapeutického potenciálu apocyninu, v podstatě netoxické fenolické sloučeniny izolované z léčivé rostliny Jatropha multifida. Apocynin je selektivní inhibitor fagocytární NADPH oxidázy Nox2, který lze aplikovat perorálně a je pozoruhodně účinný již při nízké dávce.

1. Úvod

Stárnoucí společnost se potýká s rostoucím výskytem neurodegenerativních onemocnění. Mezi relativně rozšířené příklady patří Alzheimerova a Parkinsonova choroba, mezi méně rozšířené pak Huntingtonova choroba a Lou Gehrigova choroba (amyotrofická laterální skleróza; ALS). Všem neurodegenerativním onemocněním je společné, že neexistuje účinná léčba, která by dokázala zastavit postupné zhoršování neurologických funkcí. Za zmínku stojí, že žádná z neuroprotektivních látek, které byly testovány v klinice, nemá účinnost, která by přesahovala kontrolu symptomů.

V posledních letech sílí poznatky, že zánětlivé reakce rezidentních nebo infiltrovaných vrozených imunitních buněk mohou mít významný vliv na patogenezi neurodegenerativních poruch . Uznávaným ústředním hráčem je mikroglie, gliová buňka, která patří do myeloidní linie a je často označována jako makrofág CNS. Tento zajímavý nový poznatek může znamenat, že léky s prokázanou účinností při ochraně periferních orgánů před cytotoxickou funkcí buněk vrozené imunity, jako jsou mononukleární nebo polymorfonukleární fagocyty (resp. MNC a PMN), by mohly být užitečné i pro léčbu neurozánětlivé složky neurodegenerativních onemocnění. Hlavní překážkou, kterou musí léčiva překonat, je překonání hematoencefalické bariéry a průnik do parenchymu CNS, kde probíhá neurodegenerativní proces. V tomto přehledu se budeme zabývat preklinickými studiemi, které zdůrazňují potenciál apocyninu, malého fenolického antioxidantu, jako léčby neurodegenerativních onemocnění.

2. Apocynin, farmakologicky aktivní rostlinný fenol

Apocyin (4′-hydroxy-3′-methoxyacetofenon nebo acetovanilon) byl identifikován jako biologicky aktivní látka v kořenech Picrorhiza kurroa Royle ex Benth, vytrvalé rostliny rostoucí ve vysokohorském Himálaji. Výtažky z kořenů se používají v ájurvédské lékařské tradici v Indii a na Srí Lance k přípravě etnických léčiv k léčbě onemocnění jater, srdce, kloubů a plic. Připravili jsme 95% etanolový extrakt z kořene za kontrolovaných podmínek v laboratoři a podrobili jsme přípravek čištění řízenému aktivitou s využitím oxidačního výbuchu lidských polymorfonukleárních/neutrofilních granulocytů (PMN) jako experimentálního testu akutního zánětu .

Námi použitý odečítací test byl založen na generování chemiluminiscence zesílené luminolem lidskými PMN stimulovanými zymosanem opsonizovaným v lidském séru. Podstata testu spočívá v tom, že částice kvasinek opsonizované v séru stimulují PMN prostřednictvím povrchově exponovaných receptorů imunoglobulinů nebo faktorů komplementu. Aktivační signály přenášené přes tyto receptory vedou k vyprázdnění cytoplazmatických granulí (degranulaci) a sestavení fagocytární NADPH oxidázy Nox2. Enzymový komplex Nox2 je sestaven z membránových (, ) a cytoplazmatických (, , a Rac2) podjednotek. Proces sestavování zahrnuje fosforylaci podjednotek specifickými kinázami a tvorbu thiolových můstků. Sestavený komplex přijímá elektrony z NADPH a přenáší je na volný molekulární kyslík, což vede k tvorbě superoxidového aniontu (; redukce jednoho elektronu) a peroxidu vodíku (H2O2; redukce dvou elektronů). Oba oxidanty mají cytotoxickou aktivitu, jak bylo možné prokázat pomocí červených krvinek různých druhů. Oxidační výbuch PMN zahrnuje kaskádu silně reaktivních forem kyslíku, souhrnně označovaných jako ROS (obrázek 1). Reakcí s oxidem dusnatým vzniká silně cytotoxický peroxynitrit. V přítomnosti iontů Fe2+ se H2O2 mění na vysoce reaktivní hydroxylové radikály (OH-), které prostřednictvím peroxidace membránových lipidů ovlivňují fluiditu buněčných membrán. Myeloperoxidáza uvolněná degranulací PMN katalyzuje reakci H2O2 s molekulami halogenidů (Cl2, Br2 a J2) za vzniku vysoce toxických hypohalidů (OCl-, OBr- a OJ-). ROS jsou nezbytnými složkami intracelulárního usmrcování fagocytovaných mikrobů, ale když se uvolňují do extracelulárního prostředí, jsou důležitými mediátory tkáňové destruktivní aktivity aktivovaných PMN .

Obrázek 1

Reaktivní formy kyslíku vznikající při oxidačním výbuchu fagocytů. MPO: myeloperoxidáza; NOS: syntáza oxidu dusnatého (NO).

Lze předpokládat, že složky chemicky komplexních rostlinných extraktů mohou interferovat s odečítacím testem na více úrovních a mohou mít také nespecifické účinky, jako je usmrcování PMN nebo odstraňování oxyradikálů. Z toho vyplývá, že úspěšná purifikace řízená aktivitou musí být dobře zaměřená a pečlivě kontrolovaná z hlediska nespecifických účinků, aby se zabránilo falešně pozitivním výsledkům. Bez ohledu na tyto překážky se nám podařilo prokázat vysoce specifickou aktivitu apocyninu v testu. Bylo zjištěno, že apocynin je metabolicky aktivován v reakci katalyzované MPO s H2O2 za vzniku symetrického dimeru, diapocyninu (obrázek 2). Pozorování, že reakční meziprodukt může být zachycen pomocí GSH, nás vedlo k hypotéze, že metabolicky aktivovaný apocynin může blokovat tvorbu thiolových můstků mezi membránově vázanými a cytosolickými složkami, z nichž se skládá funkční Nox2. Později však bylo zjištěno, že diapocynin přímo inhibuje produkci superoxidu Nox2 a že tato aktivita je nezávislá na MPO . Důležitým zjištěním u apocyninu bylo, že inhibuje oxidační výbuch PMN, aniž by bránil intracelulárnímu zabíjení bakterií. To znamená, že léčba apocyninem může zabránit kolaterálnímu poškození tkání infiltrovaných aktivovanými PMN, aniž by byla narušena jejich baktericidní funkce.

Obrázek 2

Inhibice mikroglie Nox2 metabolicky aktivovaným apocyninem. Receptorem zprostředkovaná aktivace buněk mikroglie vyvolává produkci reaktivních forem kyslíku a uvolňování myeloperoxidázy (MPO). Reakce apocyninu s H2O2 katalyzovaná MPO vede k produkci reaktivního meziproduktu, který se stabilizuje vazbou na volné thiolové skupiny, například GSH, nebo dimerizací. Dimerický apocynin (diapocynin) inhibuje aktivitu Nox2.

3. Účinnost apocyninu u zvířecích modelů AIMID

Počátečním cílovým onemocněním, u kterého jsme testovali klinický účinek apocyninu, byl model kolagenem indukované artritidy (CIA) na potkanech WAG/Rij (RT-), což je uznávaný preklinický model autoimunitního zánětlivého onemocnění (AIMID) revmatoidní artritidy (RA). V tomto modelu mají PMN jasnou patogenní roli , což odráží situaci u pacientů s RA. Ve studii na potkanech jsme zvolili podávání apocyninu v dávkovém rozmezí 0,3 až 200 μg/ml pitné vody, která byla poskytována ad libitum. Bylo zjištěno, že již při nejnižší dávce 0,3 μg/ml, která odpovídá denní perorální dávce 6 μg, byla artritida téměř zcela potlačena . Nebyl pozorován žádný vliv apocyninu na sérové hladiny antikolagenních autoprotilátek ani IL-6, důležitého patogenního cytokinu u CIA a RA, což naznačuje vysokou selektivitu pro zánětlivou složku onemocnění. Nezávisle na nás Hougee et al. prokázali na myším modelu CIA, že perorálně podávaný apocynin obnovuje zablokovanou produkci proteoglykanu chrupavky v artritickém kloubu . Zajímavým vedlejším účinkem léčby, ilustrujícím silný protizánětlivý účinek apocyninu, bylo dramatické potlačení nekrotizujících kožních lézí v místech, kam byl aplikován imunizační antigen/CFA preparát .

Od své první identifikace jako silné protizánětlivé látky v roce 1990 se apocynin stal uznávaným inhibitorem oxidačního výbuchu v neutrofilech, jak bylo prokázáno v celé řadě in vivo modelů imunitně zprostředkovaných zánětlivých poruch postihujících periferní a centrální orgány. Pro tento přehled jsou zvláště důležité slibné klinické účinky pozorované na modelech neurodegenerativních onemocnění, včetně ALS, Alzheimerovy a Parkinsonovy choroby. V těchto modelech není antioxidační aktivita apocyninu zaměřena na neutrofily, ale na „makrofágy mozku“, tj. mikroglie.

4. Mikroglie

Mozku obsahuje různé typy buněk se schopností vykonávat imunitní funkce včetně astrocytů, buněk mikroglie a makrofágů nacházejících se v meningách a perivaskulárních prostorech mozkových tepen a kapilár . Pro své imunitní úkoly jsou tyto buňky vybaveny konzervovanými receptory pro molekulární vzory spojené s patogeny nebo poškozením, které předávají aktivační signály buňkám pro vyvolání zánětlivých efektorových mechanismů .

Mikroglie jsou buňky vrozené imunity všudypřítomné v centrálním nervovém systému, kde jsou zapojeny do těsných interakcí s neurony, oligodendrocyty a astrocyty. Pouze mikroglie však po stimulaci uvolňují MPO, který je nezbytnou podmínkou pro metabolickou aktivaci apocyninu.

Mikroglie ve zdravém CNS mají rozvětvený klidový fenotyp. Oproti dřívějším představám nejsou mikroglie ve zdravém mozku klidové, ale jsou to vysoce dynamické buňky, které provádějí homeostatický dohled nad extracelulárním prostředím vysouváním a zasouváním svých výběžků a fagocytózou tkáňových zbytků, které by jinak mohly způsobit zánět . Aktivované mikroglie se nacházejí v nemocné tkáni CNS, například uvnitř demyelinizovaných lézí šedé kůry mozkové u RS, v okolí amyloidních plaků u Alzheimerovy choroby a v degenerující substantia nigra u Parkinsonovy choroby . Ačkoli se zdá, že rozmanité expresní profily mikroglie odrážejí široké, kontinuální spektrum aktivačních stavů, lze rozpoznat dva aktivační stavy na obou koncích spektra, které odpovídají stavům M1 a M2 označovaným pro makrofágy . „Klasicky aktivované“ mikroglie M1, například indukované LPS nebo IFNγ, mají prozánětlivé funkce, které se projevují sekrecí prozánětlivých cytokinů, jako jsou TNF-α, IL-1β a IL-12, a toxických látek, jako jsou reaktivní formy kyslíku a dusíku. „Alternativně aktivované“ mikroglie M2, například indukované v prostředí obsahujícím vysoké hladiny IL-4 nebo IL-13, mají protizánětlivé a tkáňové regenerační aktivity, které jsou zprostředkovány cytokiny, jako je IL-4, IL-10 nebo TGF-β, a reparačními faktory, jako je inzulínu podobný růstový faktor, argináza-1 nebo chitináze podobný-1. Nejen cytokinové prostředí, ale také redoxní stav mikroprostředí, který přímo souvisí s aktivitou NADPH oxidázy, určuje funkční diferenciaci mikroglie směrem k fenotypu M1 nebo M2 .

5. Apocynin jako potenciální léčba neurodegenerativních onemocnění

M1 buňky mikroglie jsou hlavním zdrojem Nox2 v mozku. Exprese aktivované Nox2 produkující ROS mikrogliemi M1 je základní složkou neurotoxicity zprostředkované mikrogliemi. Obecně přijímaný názor, že ROS produkované mikrogliemi jsou důležitými mediátory neurodegenerativního poškození mozku, vyvolává otázku, zda lze příznivý farmakologický profil a nízkou toxicitu apocyninu využít k neuroprotektivní léčbě. Buňky mikroglie nejenže exprimují Nox2, ale po aktivaci také vylučují MPO, a mohly by tak potenciálně působit metabolickou aktivaci apocyninu. Několik autorů uvádí příznivý účinek apocyninu na (modely) akutních neurologických poruch, jako je ischemie, intracerebrální krvácení a cévní mozková příhoda (přehled v ). Jaké jsou perspektivy apocyninu u chronických neurodegenerativních poruch?

Studie in vitro využívající kultivované mikroglie ukázaly, že ROS odvozené od Nox2 se podílejí na proliferaci a funkční polarizaci mikroglie . Zásadním zjištěním bylo, že inhibice Nox2 podporuje alternativní a protizánětlivou aktivaci mikroglií během neurozánětu . To znamená, že potlačení Nox2 apocyninem by mohlo obnovit zdravou rovnováhu mezi prozánětlivým M1 a protizánětlivým/proregenerativním fenotypem M2 mikroglií . Jiné studie ukázaly, že apocynin snižuje produkci IL-1β, TNF-α a oxidu dusnatého mikrogliemi, čímž přerušuje sebeudržující cyklus škodlivé činnosti. Přestože přesný neurotoxický mechanismus aktivace mikroglie u neurodegenerativních onemocnění je stále nejistý, je také značně zajímavé, že uvolňování excitotoxinu glutamátu vyžaduje aktivitu Nox2 a že ji lze apocyninem inhibovat . Celkově tyto údaje naznačují potenciálně prospěšnou roli apocyninu u neurodegenerativních onemocnění. Slibné účinky apocyninu byly skutečně pozorovány u myších modelů některých závažných neurodegenerativních onemocnění.

Amyotrofická laterální skleróza (ALS, Lou Gehrigova nemoc). Amyotrofická laterální skleróza je běžné neurodegenerativní onemocnění dospělých postihující motorické neurony. Onemocnění vede k rychle progredujícímu motorickému postižení a smrti obvykle do 5 let. Zatímco u většiny pacientů je příčina onemocnění neznámá, v části případů má nemoc genetickou příčinu, konkrétně mutace v genu pro superoxiddismutázu-1 (SOD1) . Mutace zvyšuje oxidační stres dysregulací produkce superoxidového aniontu v důsledku snížené dismutace na H2O2. Mutantní astrocyty exprimující SOD1 jsou spojovány s patologií ALS kvůli jejich snížené schopnosti absorbovat glutamát a/nebo uvolňováním neurotoxických faktorů . Selektivní umlčení mutantní SOD1 nebo nahrazení mutantní mikroglie divokým typem u myšího modelu s mutantní SOD1 silně poukazují na ústřední patogenetickou roli mikroglie. Harraz a spol. použili perorální apocynin ke kontrole progrese neurodegenerace u modelu mutantní myši SOD1 a pozorovali slibné účinky ; bylo zjištěno, že podávání apocyninu v pitné vodě významně prodloužilo přežití a oddálilo nástup motorických defektů. Tato studie ukazuje, že perorálně podávaný apocynin může v parenchymu CNS vytvořit dostatečně vysokou koncentraci pro zmírnění neurotoxické úrovně produkce ROS. Tyto slibné údaje se však nepodařilo zopakovat v jiné studii s použitím stejného mutantního myšího kmene.

Alzheimerova choroba (AD). Alzheimerova choroba je progresivní neurologické onemocnění spojené se stárnutím, které vede k nevratné demenci. Neuropatologickými znaky AD jsou senilní plaky z chybně složených a fibrilárních agregátů amyloidu-β a intraneuronální spleti tau proteinu v mozkové kůře . Bylo zjištěno, že kolem senilních plaků se shlukují aktivované buňky mikroglie, které produkují neurotoxické látky, jako jsou ROS, NO a TNF-α. Byla zaznamenána aktivace mikroglie Nox2 oligomerním a/nebo fibrilárním amyloidem-β a exprese aktivované Nox2 v mozku Alzheimerovy choroby.

Lull et al. testovali apocynin v denní perorální dávce 10 mg/kg prostřednictvím pitné vody na transgenním myším modelu AD hAPP . U myší léčených apocyninem pozorovali významné snížení velikosti plaků v kůře a hipokampu a snížení počtu mikroglie v kůře, nikoli však v hipokampu. Behaviorální rys AD pozorovaný u tohoto myšího modelu, tj. výkon v testu plavání v Morrisově vodním bludišti, který testuje prostorovou paměť organizovanou v hipokampu, však nebyl léčbou výrazně zlepšen. Omezený klinický účinek apocyninu v tomto modelu může být způsoben absencí jasného neurozánětu, zatímco ten je u pacientů s AD výraznější, a tím, že tvorba plaků nemusí nutně předpovídat zhoršení kognitivních funkcí.

Parkinsonova choroba (PD). Patologickým znakem PD je progresivní degenerace neuronů produkujících dopamin v substantia nigra (SN), pigmentované struktuře umístěné v dolní části středního mozku. Prostřednictvím uvolňování dopaminu hraje SN ústřední roli v koordinaci různých neurologických funkcí, včetně odměny, závislosti a pohybu. Posledně jmenovaná funkce je narušena zejména u PD. Ke kompenzaci ztráty dopaminu se podává metabolicky stabilní prekurzor dopaminu (L-DOPA), který u značného počtu pacientů způsobuje typické mimovolní pohyby známé jako hyperkinetický syndrom. Zatímco u naprosté většiny (sporadických) pacientů s PD není příčina onemocnění známa, u malé části byla nalezena genetická příčina, a to mutace v několika genech, včetně alfa-synukleinu, parkinu, leucin-rich repeat kinázy 2, PTEN-indukované putativní kinázy 1 a ATP13A2 . Pozorování, že u uživatelů heroinu kontaminovaného MPTP se objevily příznaky PD, umožnilo vytvořit klinicky relevantní zvířecí model PD. Po přeměně MPTP na MPP+ monoaminooxidázou B v astrocytech se MPP+ koncentruje v dopaminergních buňkách prostřednictvím vychytávání specifickým dopaminovým transportérem, kde blokuje komplex I mitochondriálního dýchacího řetězce. Následný redoxní stres způsobuje mimo jiné dysregulaci buněčného Ca2+ vedoucí k buněčné smrti. Stejně jako u ALS a AD se zjistilo, že neurodegenerace u PD je spojena s aktivací mikroglií Nox2, o níž se předpokládá, že významně přispívá k patogenetickému procesu .

Pomocí systému in vitro Gao et al. prokázali, že ROS generované mikroglií Nox2 zvyšují citlivost dopaminergních neuronů na MPP+ . Příznivý účinek apocyninu na neurotoxické účinky zprostředkované mikrogliemi byl prokázán na myším modelu PD .

6. Účinek apocyninu na modelu Parkinsonovy choroby u nehumánních primátů

Pakovaná injekce nízké dávky MPTP u marmošek obecných, neotropických primátů s malým tělem, vyvolává neurologické onemocnění, které se na úrovni klinického a neuropatologického obrazu velmi blíží PD . Tento model MPTP jsme použili u 5 dvojčat marmoset, abychom otestovali, zda je perorální apocynin účinný i u vyššího druhu . Pro perorální podání byl apocynin rozpuštěn v arabské gumě; jednomu sourozenci každého dvojčete byla podána guma obsahující apocynin a druhému pouze guma. Léčba apocyninem (100 mg/kg, TID) začala týden před indukcí PD pomocí MPTP (1 mg/kg, subkutánní injekcí po dobu 8 dní). Apocynin omezil typický úbytek tělesné hmotnosti spojený s parkinsonským syndromem. Také motorické funkce u opic léčených apocyninem se zlepšily, což svědčí o antiparkinsonské účinnosti apocyninu. Kromě toho apocynin zvýšil počet přežívajících dopaminových neuronů, což svědčí o neuroprotektivní účinnosti. Pozoruhodné je, že apocynin má podobnou molekulární strukturu jako kyselina homovanilová (HVA), metabolit dopaminu. Vysvětlení ochranné účinnosti apocyninu u PD by mohlo souviset také s kompenzací snížené hladiny přirozeně dostupného o-methoxykatecholu HVA.

7. Perspektiva pro léčbu lidských pacientů

Apocynin je potenciálně atraktivní perorální proléčivo díky své nízké celkové toxicitě a skutečnosti, že jeho specifický antioxidační účinek je vyvolán po metabolické aktivaci fagocytárními buňkami uvolňujícími MPO. Údaje o bezpečnosti apocyninu jsou vzácné, ale ty, které jsou k dispozici, ukazují nízkou toxicitu a vysokou stabilitu (částečně přezkoumáno v ). LD50 po perorálním podání u myší byla odhadnuta na 9 g/kg. U potkanů se přibližně 80 % intraperitoneálně podaného apocyninu v dávce 120 mg/kg získalo v nezměněné formě ve vzorku moči odebraném o 20 hodin později. Intravenózní dávka 420 mg/kg apocyninu u myší způsobila minimální známky toxicity .

Podle našich znalostí nebyl apocynin testován u lidských pacientů s neurodegenerativním onemocněním. Peters a spol. však hodnotili terapeutický potenciál inhalačního apocyninu na ozonem indukovanou bronchiální hyperreaktivitu na methacholin u astmatických pacientů jako model zánětlivého onemocnění plic . Autoři mohli vyloučit vymývání ozonu apocyninem a dospěli k závěru, že účinek spočívá ve zmírnění produkce ROS PMN a eosinofilů, které infiltrovaly plíce při expozici ozonu.

Studie na myších, o nichž pojednává tento přehled, ukazují, že nízké dávky apocyninu podávané perorální cestou se dostávají do parenchymu CNS v dostatečné koncentraci, aby inhibovaly oxidační výbuch mikroglie a potlačily neurodegeneraci. S ohledem na velmi nízkou systémovou toxicitu a vysoce specifický způsob účinku apocyninu by to byla atraktivní perspektiva pro testování terapeutické hodnoty u lidských neurodegenerativních onemocnění.

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikováním tohoto článku nedošlo ke střetu zájmů.

Poděkování

Autoři děkují panu Henku van Westbroekovi (BPRC) za přípravu výtvarného díla.

Poděkování