Aporfinové alkaloidy z Ocotea macrophylla (Lauraceae)

ARTIGO

Aporfinové alkaloidy z Ocotea macrophylla (Lauraceae)

Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Kolumbie. AA 14490

ABSTRACT

Čtyři aporfinové alkaloidy ze dřeva Ocotea macrophylla (Lauraceae) byly izolovány a charakterizovány jako (S)-3-methoxy-nordomesticin (1), (S)-N-ethoxykarbonyl-3-methoxy-nordomesticin (2), (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticin (3) a (S)-N-methoxykarbonyl-3-methoxy-nordomesticin (4); alkaloidy 2-4 jsou uváděny poprvé. Struktura izolovaných sloučenin byla určena na základě jejich spektrálních údajů a porovnáním jejich spektrálních údajů s hodnotami popsanými v literatuře. Alkaloidní frakce a sloučenina 1 vykazovaly antimykotickou aktivitu vůči Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici a také sloučenina 1 vykazovala antimikrobiální aktivitu vůči Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis as well.

Klíčová slova:

ÚVOD

Rod Ocotea (Lauraceae) zahrnuje více než 350 druhů vyskytujících se na americkém kontinentu a v jižní Africe.1,2 V Kolumbii se vyskytuje 35 druhů Ocotea rozšířených po celé zemi především v andských lesích.3 V tradiční medicíně se některé druhy Ocotea různě uplatňují. O. quixos se používá jako dezinfekční prostředek, lokální anestetikum a prostředek proti průjmu.4 O. lancifolia se používá jako antiparazitikum a O. caparrapi se používá k léčbě bodnutí hmyzem, hadího uštknutí, bronchitidy a rakovinných nádorů.5,6

Z chemického hlediska je rod Ocotea znám především jako zdroj metabolitů typu furofuranových7 a tetrahydrofuranových lignanů,8 bicyklooktanových9 a benzofuranových neolignanů10 a benzylisochinolinových11 a aporfinových alkaloidů.5 V předchozích studiích byly izolovány čtyři aporfinové alkaloidy ze dřeva Ocotea macrophylla a identifikovány jako nantenin, glaucin, isokorydin a dehydronantenin12,13 . V tomto článku popisujeme izolaci a strukturní určení tří nových aporfinových alkaloidů 2-4 vedle (S)- 3-methoxy-nordomesticinu 1 a uvádíme antibakteriální a antimykotickou aktivitu sloučenin.

VÝSLEDEK A DISKUSE

Etanolický extrakt ze stonku O. macrophylla byl podroben acidobazické extrakci za účelem získání alkaloidní frakce, která byla dále podrobena frakcionaci a čištění chromatografickými metodami, což vedlo k izolaci čtyř alkaloidů: (S)-3-methoxy-nordomesticin (1), (S)-N-ethoxykarbonyl-3-methoxy-nordomesticin (2), (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticin (3) a (S)-N-methoxykarbonyl-3-methoxy-nordomesticin (4). Struktury alkaloidů 1-4 jsou uvedeny na obr. 1 a spektroskopické údaje v tab. 1.

Signál při δH 6,30 (1H, s) nevykazoval v HMQC experimentu žádnou konektivitu, což svědčí o přítomnosti fenolové OH skupiny, podpořené IR. Analýza HMBC spektra umožnila lokalizovat substituenty podle korelací pozorovaných mezi signály při δH 5,94 a 5,95 (pro methylenedioxyskupinu) se signály při δC 145,9 (C-9) a 146. V případě methylenedioxyskupiny se jednalo o signály při δH 5,94 a 5,95 (s).2 (C-10) a tyto dva poslední signály s protony při δH 6,70 (H-8) a 7,90 (H-11), což naznačuje přítomnost methylenedioxy skupiny v polohách 9 a 10 a dvou vodíků na aromatickém kruhu v para orientaci. Přítomnost hydroxylové skupiny v poloze 1 byla určena pomocí korelace mezi signály při δH 6,30 a δC 116,5, přiřazenými C-11b. Poloha methoxylových skupin v polohách C-2 a C-3 byla přiřazena podle korelace vodíků při δH 3,96 a 3,86 s uhlíky při δC 138,4 (C-2) a δC 147,8 (C-3).

Absolutní konfigurace C-6a byla přiřazena jako S, protože má negativní Cottonův efekt při 280 nm a pozitivní Cottonův efekt při 240 nm v CD křivce.17 Navíc to bylo potvrzeno pozitivní hodnotou optické rotace 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Proto byl alkaloid 1 určen jako (S)-3-methoxy-nordomesticin, aporfinový alkaloid dříve uváděný z Nectandra sinuata19 patřící rovněž do čeledi Lauraceae. Tato zpráva opravuje a doplňuje spektroskopické údaje pro tuto sloučeninu.

Alkaloid 2 byl získán jako žlutý olej, který pozitivně reaguje na Dragendorffovo činidlo a jeho hodnota optické otáčivosti byla 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). UV a IČ spektrum 2 bylo podobné spektru 1, s výjimkou toho, že se v obou spektrech objevily absorpce způsobené karbamátovou skupinou při vlnové délce 282 nm a při 1688 cm-120. 1H a 13C NMR spektra vykazovala podobný profil jako 1. V 1H NMR se objevily dva nové signály při δH 4,29 (2H, m) a 1,29 (3H, m), stejně jako posunutí signálu H-5 v důsledku přítomnosti deprotektující skupiny v blízkosti. Experiment COSY ukázal korelaci signálů δH 4,29 a 1,29, což naznačuje přítomnost ethylové skupiny, která vzhledem ke svému posunu naznačuje, že je připojena k heteroatomu. 13C NMR a DEPT spektra ukázala výskyt tří nových signálů při δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) a 14,8 (CH3), typických signálů ethoxykarbonylové skupiny připojené k atomu dusíku. Absolutní konfigurace C-6a byla určena jako S, protože vykazovala stejné Cottonovy efekty jako 1. Proto byla alkaloidní sloučenina 2 identifikována jako (S)-N-ethoxykarbonyl-3-methoxy-nordomesticin. Její ESIMS spektrum poskytlo pseudomolekulární iontový pík při m/z 414+ odpovídající molekulovému vzorci C22H22NO7 a fragmentace byly způsobeny ztrátou CH3OH a CH3CH2OH při m/z 382+ a m/z 368+. ESI spektrum v režimu záporných iontů vykazovalo píky při m/z 412 – a m/z 383 ., přičemž poslední z nich byl ztrátou ethylové skupiny. Tento typ alkaloidů se substituenty N-ethoxykarbonyl byl izolován z Lindera angustifolia (Lauraceae).21

Alkaloid 3, byl získán jako žlutý olej s hodnotou optické rotace 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). IČ spektrum bylo podobné spektru alkaloidů 1 a 2. Navíc byla pozorována přítomnost absorpcí při 2830, 2700, 1739 cm-1 , charakteristických pro formylovou skupinu. V negativním režimu HRESIMS byl pozorován pseudomolekulární ion – při m/z 369,1133, odpovídající molekulovému vzorci C20H20NO6. V negativním iontovém módu ESI-MS spekter byla zjištěna ztráta formylové skupiny při m/z 339.. NMR profil byl podobný jako u alkaloidů 1 a 2. V 1H NMR se objevily odlišné signály patřící směsi dvou isomerů v poměru 3:1. Srovnání hlavního isomeru s alkaloidem 1 v NMR ukázalo stejný vzorec substituce aromatického kruhu, kromě toho se objevily dva nové signály při δH 8,25 (1H, s) v 1H a při δC 161,9 v 13C formylové skupiny k 3. Tato funkčnost na dusíku vedla ke vzniku rotačních isomerů, které byly dříve popsány pro alkaloidy s N-formylovou a N-acetylovou skupinou22 . Proto byl tento alkaloid 3 identifikován jako (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticin.

Alkaloid 4 byl získán jako bílá pevná látka s bodem tání 222-223 ºC (MeOH) a s optickou rotací 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). Analýza NMR dat 4 ukázala, že má stejný základní skelet jako 2, ale má methylester podle signálů při δH 3,76 (3H, s) a δC 52,6 pro 4 na místě signálů pro ethylovou skupinu v 2. HRESIMS ukázala pseudomolekulární ion – při m/z 398,1233 odpovídající molekulovému vzorci C22H22NO7. Proto byl alkaloid 4 identifikován jako (S)-N-methoxykarbonyl-3-methoxy-nordomesticin.

Antifungální aktivita byla hodnocena diskovou difuzní metodou proti Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 fytopatogenní houbě, která napadá plodiny rajčat a způsobuje zemědělcům obrovské ztráty. Alkaloidní frakce byla účinná proti F. oxysporum v koncentraci 250 μg/μl. Inhibiční aktivita proti růstu houby byla mírná při 5 μg/μl pro (S)-3-methoxy-nordomesticin 1, zatímco ostatní alkaloidy byly neúčinné, což naznačuje, že přítomnost substituentů stahujících elektrony na atomu dusíku snižuje antifungální aktivitu.

Ačkoli je málo hodnotících zpráv o antifungální aktivitě aporfinů, bylo zjištěno, že jsou aktivní proti druhům, jako je Candida albicans,24,25 ale neaktivní proti houbovým patogenům jako Cladosporium herbarium.26 Tyto výsledky jsou novou zprávou o hodnocení antifungální aktivity těchto alkaloidů, kde je zdůrazněno, že typ substituentů na dusíku aporfinů má vliv na antifungální aktivitu, kterou vykazují.

Antibakteriální aktivita byla hodnocena radiální difuzní metodou, kterou uvádí Lerhrer27 proti dvěma standardním Gramovým (+) kmenům: Staphylococcus aureus 6538 a Enterococcus faecalis 29212 a třem kmenům Gram (-): Escherichia coli 25922 a Salmonella tiphymurium, kmeny MS7953 a 14028s. Alkaloid 1 (2,5 μg) vykazoval antimikrobiální aktivitu proti oběma hodnoceným grampozitivním bakteriím s hodnotami 30 AU, jak ukazuje tabulka 2.

U racemické směsi sloučeniny 3-methoxy-nordomesticin byla zaznamenána její aktivita proti E. coli (MIC= 256 μg/ml) a S. aureus (MIC= 512 μg/ml),28 avšak v tomto případě není sloučenina 1 aktivní proti E. coli. coli.

Podobně jako u antimykotické aktivity výsledky ukazují, že povaha substituentu na dusíku ovlivňuje antibakteriální aktivitu (tabulka 2).

EXPERIMENTÁLNÍ

Všeobecné postupy

Teplota tání byla stanovena pomocí laboratorního přístroje Mel-temp Fisher Johns. UV spektra byla zaznamenána na spektrometru Perkin Elmer Lambda 2S a CD spektra na spektrometru JASCO J-720. IR spektra byla získána na přístroji Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 series 1000 jako tenká vrstva. Optické otáčky byly zaznamenány na Schmidt-Haenschově polarimetru. 1H (400 MHz) a 13C (100 MHz) NMR spektra a 2D spektra (COSY, HMQC a HMBC) byla provedena na spektrometru Bruker Avance 400 MHz s použitím CDCl3 jako vnitřní reference. HRMS byly stanoveny na systému LCMS-IT-TOF hmotnostního spektrometru Shimadzu s ESI v režimu pozitivních a negativních iontů. Kolonová chromatografie (CC) byla provedena pomocí silikagelu (70-230 a 230-400 mesh, Merck) a analytická chromatografie byla provedena pomocí silikagelu 60 PF254 (0,25 mm).

Rostlinný materiál

The stems of O. macrophylla were collected in July 2006 from Nocaima, Colombia by W. Delgado. Botanický vzorek byl identifikován A. Jarou a voucherový exemplář (COL-517191) a byl uložen v Kolumbijském národním herbáři Kolumbijské národní univerzity, Bogota, Kolumbie.

Extrakce a izolace

Sušené a napájené stonky (2,0 kg) Ocotea macrophylla byly extrahovány EtOH macerací při pokojové teplotě a koncentrovány ve vakuu za účelem získání extraktu (102,6 g). Vzorek (48,9 g) tohoto extraktu byl rozpuštěn ve vodě za použití ultrazvuku a okyselen 5% HCl na pH 2,0. Vzorek byl rozpuštěn ve vodě za použití ultrazvuku. Kyselá suspenze byla poté přefiltrována a bazifikována 20% NaOH na pH 8,0 a postupně extrahována chloroformem. Chloroformová frakce (3,01 g) byla podrobena sloupcové chromatografii se silikagelem a eluována gradientem petrolether:AcOiPr (4:6 až 0:10) a AcOiPr:MeOH (10:0 až 0:10), čímž byly získány čtyři frakce (I-IV). Frakce I (347 mg) byla opakovaně chromatografována na koloně (CC) na silikagelu a eluována n-hexanem:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3 a Tol:AcOiPr 7:3. Frakce II byla chromatografována na koloně (CC). Tím se získaly alkaloidy 1 (7 mg) a 2 (4 mg). Frakce II (250 mg) byla podrobena sloupcové chromatografii na silikagelu a eluci s CHCl3:AcOEt (85:15), poté byla podrobena CC na Sephadexu LH-20 (CH3OH) za vzniku alkaloidu 3 (8 mg). Frakce IV (1433 mg) byla přečištěna opakovanou sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití CH2Cl2:MeOH 97:3 a CH2Cl2 jako elučních systémů. Nakonec se postupným promýváním MeOH získal alkaloid 4 (98 mg).

Antifungální test

F. oxysporum byl získán ze sbírky kultur University of Cundinamarca (katedra agronomie, laboratoř fytopatologie). Jako médium pro testy antifungální aktivity bylo použito PDA. Kultivační médium bylo inokulováno 100 μl roztoku 105 spor. Vzorky byly připraveny v roztocích o různých koncentracích, které odpovídaly 50, 25 a 10 μg/μl alkaloidní frakce a 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 a 0,1 μg/μl čistých alkaloidů. Deset mikrolitrů vzorků bylo naneseno na disky filtračního papíru a umístěno na inokulované médium. Destičky byly uzavřeny a ponechány v inkubátoru po dobu 3 dnů při 25 °C. Jasné zóny objevující se proti rostoucí houbě ukazovaly minimální množství frakce nebo alkaloidu potřebné k inhibici růstu houby. Pro každé ošetření byla provedena tři opakování. Jako pozitivní kontrola byl použit benomyl (benzimidazol – 5 μg) a jako negativní kontrola sloužil aceton.23

Antibakteriální testy

Antibakteriální aktivita byla hodnocena radiální difuzní metodou upravenou podle metodiky dříve publikované Lehrerem.27 Sloučeniny byly hodnoceny proti dvěma Gram(+) kmenům: Staphylococcus aureus ATCC 6538 a Streptococcus fecalis ATCC 29212 a třem Gramovým (-) kmenům: Escherichia coli ATCC 25922 a Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s a Salmonella tiphymurium MS7953. Kolonie izolovaná z každého kmene byla uložena do 3 ml sójové tryptikázy (TSB) pro Gram (+) kmeny a Luriova bujónu (LB) pro Gram (-) kmeny a inkubována při 37 °C za míchání, dokud mikroorganismy nebyly v logaritmické fázi. Supernatant byl odstraněn a získaný sediment byl znovu suspendován ve fosfátovém pufru (PBS), následovalo promytí PBS a odstředění. Nakonec byl sediment znovu suspendován v PBS a byla stanovena optická hustota při 620 nm pro výpočet počtu CFU (colony forming units) na mililitr. V každé misce se rozptýlí určitý objem, který obsahuje 4 x 107 CFU. Odměřený objem se promíchal a homogenizoval v 15 ml agarózy roztavené na teplotu víceméně 45 °C. Tato bakteriální suspenze byla naservírována do Petriho misek a ponechána ztuhnout při pokojové teplotě, načež byly sterilním děrovačem vytvořeny otvory o průměru 2 mm.

Testované vzorky byly připraveny rozpuštěním 1 mg čisté sloučeniny v 500 μl DMSO, do kterého se umístilo 8 μl vzorku ve dvojím provedení a inkubovalo se při 37 °C po dobu 30 min. Po této době bylo přidáno živné médium, které obsahuje roztavený agarový agar a TSB, inkubováno 18 h při 37 ºC a poté byl změřen průměr inhibičních zón podle aktivity sloučeniny. Jako pozitivní kontroly byla použita různá antibiotika, Ampicilin (50 mg/ml), Kanamycin (10 mg/ml) a Tetracyklin (4,12 mg/ml) v ředění 1:100 v PBS a jako negativní kontroly byly použity DMSO a PBS, každá kontrola 8 μl v každé jamce. Průměry inhibičních zón byly měřeny v milimetrech a výsledky byly uváděny v jednotkách aktivity podle poměru, který stanoví, že 1 jednotka účinku (UA) se rovná 0,1 mm inhibiční zóny.

PODROBNÝ MATERIÁL

PODĚKOVÁNÍ

Autoři by rádi poděkovali Národní univerzitě Kolumbie za finanční podporu tohoto projektu. Rovněž děkujeme laboratoři nukleární magnetické rezonance a laboratoři hmotnostní spektrometrie za podporu při záznamu NMR spekter, respektive HR-ESI-MS. Dále by autoři rádi poděkovali Javeriana University za optické rotace, FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) za záznam CD spekter a zejména Prof. J. M. Lozanovi za provedení testů antibakteriální aktivity.

1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.

2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.

4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.

5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.

6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.

7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.

8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.

9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.

10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.

11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.

12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.

13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.

14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.

15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.

16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.

17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.

18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.

19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.

20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.

21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.

22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.

23. Gomez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Biol. Trop. 2007, 55, 767.

24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Phytochemistry 2001, 57, 421.

25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.

26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Phytotherapy 2000, 71, 527.

27. Lerhrer R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Metody. 1991, 137, 167.

28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Pharm. Bull. 2009, 57,

Přijato 26. 6. 2009; přijato 6. 11. 2009; publikováno na webu 10. 3. 2010

* email: [email protected]

DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

.