Asociace genotypů HPV s vnějšími anogenitálními bradavicemi: průřezová studie

Design studie a účastníci

Byla provedena průřezová studie, která využívá nepravděpodobnostní vzorek. Pacienti navštěvující dermatologické kliniky v oblasti Farwania Health District byli do studie rekrutováni postupně od listopadu 2016 do května 2017. Imunokompetentní pacienti s předchozí klinickou diagnózou zevních anogenitálních bradavic, kteří byli plánováni na kryoterapii nebo laserové ošetření, byli požádáni o podepsání souhlasu po ústním vysvětlení dermatologa, který je vyzval k účasti. V době odběru byly vzorky bradavic odebrány do univerzálního transportního média (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Itálie) a uloženy při teplotě -80 °C. Etický souhlas byl získán od etické komise Centra zdravotnických věd (číslo: VDR/EC/2310) a Ministerstva zdravotnictví.

O každém pacientovi byly odebrány demografické a klinické údaje, včetně: věk (roky), pohlaví (muž, žena), národnost (kuvajtská, nekuvajtská), počet bradavic (jedna, dvě až čtyři a nejméně pět), doba trvání přítomnosti bradavic (< jeden měsíc, jeden až šest měsíců, sedm až 12 měsíců a více než 12 měsíců), velikost každé bradavice (v centimetrech) (< jedna, jedna, jedna až dvě, více než dvě), partneři mají bradavice (ano, ne) a zda byly bradavice předmětem předchozí léčby (ano, ne). Žádný z účastníků nebyl očkován proti HPV, protože očkování proti HPV nebylo v Kuvajtu dosud zavedeno, ačkoli se o jeho zavedení v současné době jedná na ministerstvu zdravotnictví.

Extrakce DNA a kontroly

Přijaté vzorky tkání byly uchovávány při teplotě -80 °C. Vzhledem k velkému počtu obdržených vzorků byly všechny bradavice na jednoho pacienta rozmělněny dohromady a byly podrobeny jedné izolaci DNA. Tkáň byla mletá sterilními nůžkami a kleštěmi na Petriho misce a bylo zváženo asi 25 mg tkáně. Tkáň byla promyta ve fosfátovém pufru (PBS) a přenesena do 1,5ml zkumavek Eppendorf. Genomová DNA byla ze vzorků tkáně extrahována pomocí soupravy QIAmp DNA Mini (Qiagen, USA) podle pokynů výrobce.

Vektory HPV typu 2, HPV typu 1 a HPV typu 16 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) byly použity jako kontroly v experimentech PCR.

PCR v reálném čase

K vyšetření DNA HPV v genitálních bradavicích byl proveden test PCR v reálném čase. Pět mikrolitrů (5 μl) extrahované DNA bylo kombinováno s 12,5 μl 2X Syber Green master mixu (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) obsahujícího ROX jako pasivní referenci a 10 pmol dopředných a reverzních primerů (10-uM, popsáno níže). Všechny sady primerů byly syntetizovány na zakázku společností Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA. Směs byla doplněna na objem 25 μl vodou bez nukleáz (Ambion, Austin, TX, USA). Za účelem snížení počtu falešně pozitivních nebo negativních výsledků byly vzorky analyzovány duplicitně na reakční destičce s 96 optickými jamkami (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). V každé amplifikační dávce byly zahrnuty pozitivní a negativní kontroly. Za účelem kvantifikace HPV ve vzorcích bylo vedle vzorků provedeno pětinásobné až desetinásobné sériové ředění známé pozitivní kontrolní DNA. Amplifikace PCR v reálném čase byla provedena na přístroji ABI 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Test PCR v reálném čase byl proveden na třech různých destičkách. První destička byla použita ke stanovení integrity cílové DNA pomocí testu β-globin PCR, přičemž se amplifikoval cílový fragment o velikosti 268 bp, jak již dříve popsali Lum a Le Marchand v roce 1998 . Nukleotidová sekvence β-globinových primerů je následující: β-globinový PCR primer: 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. β-globinový reverzní PCR primer: 5′-AACAGCATCAGGAGTGGACAGAT-3′. Amplifikace PCR byla zahájena při 95 °C po dobu deseti minut a dokončena 45 amplifikačními cykly (denaturace při 95 °C po dobu 15 s, žíhání při 55 °C po dobu 45 s a extenze při 65 °C po dobu jedné minuty).

Druhá destička byla použita ke screeningu na přítomnost HPV infekce pomocí MY11/GP6 primerů z HPV L1 ORF . Nukleotidové sekvence primerů MY11/GP6 jsou následující: Přední primer MY11: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ a reverzní primer GP6: 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3′. Očekávaná velikost amplifikovaného fragmentu je 185 bp. Amplifikace PCR byla zahájena při 95 °C po dobu deseti minut a dokončena 45 amplifikačními cykly (denaturace při 95 °C po dobu 15 s, žíhání při 45 °C po dobu 45 s a extenze při 65 °C po dobu jedné minuty).

Třetí destička byla použita ke screeningu na přítomnost HPV infekce pomocí primerů HVP2/B5 z HPV L1 ORF . Nukleotidové sekvence primerů HVP2/B5 jsou následující: HVP2 dopředný primer: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5 reverzní primer: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. Očekávaná velikost amplifikovaného fragmentu je 650 bp. Amplifikace PCR byla zahájena při 95 °C po dobu deseti minut a dokončena 45 amplifikačními cykly (denaturace při 95 °C po dobu 15 s, žíhání při 50 °C po dobu 45 s a extenze při 65 °C po dobu jedné minuty).

Fluorescenční spektra byla zaznamenána během elongační fáze každého cyklu PCR. Ke generování amplifikační křivky pro každou reakci byl použit software pro detekci sekvence (SDS v1.7) systému ABI 7500 pro PCR v reálném čase. Po každé reakci byla vygenerována disociační křivka pro rozlišení specifických a nespecifických amplikonů. Na základě amplifikační křivky byly pro analýzu vybrány všechny vzorky s amplifikací HPV začínající v jakémkoli cyklu až do počtu cyklů 40 (s hraniční linií 0,2). Za HPV DNA pozitivní byly považovány pouze vzorky s disociační křivkou mezi 70 °C a 80 °C a s hodnotou derivace mezi 0,100-0,500.

Sangerovo sekvenování

DNA HPV v bradavicích byla před sekvenováním amplifikována pomocí vnořené PCR s použitím směsi AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) V první PCR byly použity primery HVP2/B5 a ve druhé PCR primery CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R a C4F/C4R. První amplifikace PCR byla zahájena při 95 °C po dobu deseti minut a dokončena 35 amplifikačními cykly (denaturace při 95 °C po dobu 15 s, žíhání při 50 °C po dobu 45 s a extenze při 68 °C po dobu jedné minuty). Druhá amplifikace PCR byla provedena za použití 3 μl prvního produktu PCR a stejných cyklických podmínek. Očekávané širokospektré genotypy HPV, které mají být detekovány z kožních bradavic pomocí primerů HVP2/B5 a CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R a C4F/C4R, zahrnují typy HPV z rodů alfa (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 a 94), gama (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 a 88), mu (HPV 1 a 63) a nu (HPV 41) .

Produkty PCR byly přečištěny pomocí soupravy pro přečištění PCR (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Německo) podle pokynů výrobce. Poté byly podrobeny Sangerově sekvenační reakci s použitím BigDye terminator v3.1 cycle sequencing mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a vnořených PCR primerů popsaných výše. Po sekvenování byla provedena purifikace PCR za účelem odstranění nenavázaných deoxyterminátorů s fluorescenčním barvivem pomocí BigDye XTerminator™ Purification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Vzorky byly denaturovány po dobu 2 minut při 95 °C a ihned zchlazeny na ledu a vloženy do genetického analyzátoru ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Vzorky byly elektroforetizovány na 50 cm kapilárním poli s použitím polymeru POP 6 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) jako separačního média.

Vzorky byly analyzovány pomocí softwaru Sequencing Analysis v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Zarovnání sekvencí HPV bylo provedeno se sekvencemi uvedenými v databázi GenBank pomocí softwaru BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) a databáze HPV Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics (https://pave.niaid.nih.gov/).

Pokud byly získané sekvence nekvalitní z důvodu nízkého výtěžku produktu PCR, byly produkty PCR klonovány do vektoru pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) po přečištění pomocí soupravy Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) a bylo provedeno sekvenování inzertů pomocí M13 dopředných a zpětných primerů.

Statistická analýza

Údaje o klinické diagnóze, demografické údaje a virologická analýza byly zpracovány do tabulek a analyzovány pomocí statistického softwaru SPSS „Statistical Package for Social Sciences, SPSS verze 25.0“ (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Byla vypočtena popisná statistika: četnosti/procenta, míry středu a rozptylu. Pro testování rovnosti průměrů byl pro všechny spojité proměnné použit dvouvýběrový t-test, pokud byla dodržena normalita, jinak byl použit Mann Whitney U test. Pro porovnání průměrů tří skupin byla použita analýza rozptylu nebo Kruskalův-Wallisův test v závislosti na splnění předpokladů. Pro testování asociací mezi dvěma kategoriálními proměnnými byl použit Pearsonův chí kvadrát test nezávislosti nebo Fisherův přesný test, pokud byly splněny předpoklady. Pro modelování binárního výsledku se souborem kovariát byla použita logistická regrese a byly odhadnuty hrubé a upravené poměry šancí a jejich 95% intervaly spolehlivosti. Všechny testy byly dvouvýběrové a hodnota P menší než 5 % byla považována za statisticky významnou

.