Auxotrofie
GenetikaEdit
V genetice, se o kmeni říká, že je auxotrofní, pokud je nositelem mutace, která mu znemožňuje syntetizovat esenciální sloučeninu. Například kvasinkový mutant s inaktivovaným genem dráhy syntézy uracilu je uracil auxotrofní (např. pokud je inaktivován gen kvasinkové orotidin 5′-fosfát dekarboxylázy, výsledný kmen je uracil auxotrofní). Takový kmen není schopen syntetizovat uracil a je schopen růstu pouze tehdy, pokud může uracil přijímat z prostředí. To je opak uracil prototrofa, nebo v tomto případě kmene divokého typu, který může růst i bez uracilu. Auxotrofní genetické markery se často používají v molekulární genetice; byly slavně použity v práci Beadleho a Tatuma, kteří získali Nobelovu cenu za hypotézu jednoho genu a jednoho enzymu, která spojuje mutace genů s mutacemi proteinů. To pak umožňuje mapování biosyntetických nebo biochemických drah, které může pomoci určit, který enzym nebo enzymy jsou ve studovaných auxotrofních kmenech bakterií mutovány a nefunkční.
Výzkumníci použili kmeny E. coli auxotrofní pro specifické aminokyseliny k zavedení nepřirozených analogů aminokyselin do proteinů. Například buňky auxotrofní pro aminokyselinu fenylalanin lze pěstovat v médiu doplněném analogem, jako je para-azido fenylalanin.
Mnoho živých organismů, včetně člověka, je auxotrofních pro velké třídy sloučenin potřebných pro růst a musí tyto sloučeniny získávat stravou (viz vitamin, esenciální živina, esenciální aminokyselina, esenciální mastná kyselina).
Složitý vzorec evoluce vitaminové auxotrofie napříč eukaryotickým stromem života úzce souvisí se vzájemnou závislostí mezi organismy.
Test mutagenity (nebo Amesův test)Edit
Zkouška mutageneze Salmonella (Amesova zkouška) využívá více kmenů Salmonella typhimurium, které jsou auxotrofní k histidinu, k testování, zda daná chemická látka může způsobit mutace, pozorováním její auxotrofní vlastnosti v reakci na přidanou chemickou sloučeninu. Mutace, kterou chemická látka nebo sloučenina způsobí, se měří tak, že se aplikuje na bakterie na destičce obsahující histidin a poté se bakterie přemístí na novou destičku bez dostatečného množství histidinu pro kontinuální růst. Pokud látka nezpůsobí mutaci genomu bakterií z auxotrofního na histidinový zpět na prototrofní na histidinový, pak bakterie na nové destičce nevykazují růst. Porovnáním poměru bakterií na nové destičce a na staré destičce a stejného poměru u kontrolní skupiny je tedy možné kvantifikovat, jak je látka mutagenní, nebo spíše jaká je pravděpodobnost, že způsobí mutace v DNA. Chemická látka je považována za pozitivní pro Amesův test, pokud způsobuje mutace zvyšující pozorovanou míru reverze, a za negativní, pokud se prezentuje podobně jako kontrolní skupina. Očekává se normální, ale malý počet revertantních kolonií, když je auxotrofní bakterie nanesena na médium bez metabolitu, který potřebuje, protože by mohla mutovat zpět k prototrofii. Pravděpodobnost, že se tak stane, je malá, a proto se tvoří velmi malé kolonie. Pokud se však přidá mutagenní látka, bude počet revertantů viditelně vyšší než bez mutagenní látky. Amesův test je v podstatě považován za pozitivní, pokud látka zvýší šanci na mutaci v DNA bakterií natolik, že způsobí kvantifikovatelný rozdíl v počtu revertantů na desce s mutagenem a na desce s kontrolní skupinou. Negativní Amesův test znamená, že možný mutagen nezpůsobil zvýšení počtu revertantů, a pozitivní Amesův test znamená, že možný mutagen zvýšil pravděpodobnost mutace. Tyto mutagenní účinky na bakterie jsou zkoumány jako možný ukazatel stejných účinků na větší organismy, jako je člověk. Předpokládá se, že pokud může v bakteriální DNA vzniknout mutace za přítomnosti mutagenu, pak by stejný účinek mohl nastat i u větších organismů a způsobit rakovinu. Negativní výsledek Amesova testu by mohl naznačovat, že látka není mutagenem a nezpůsobí vznik nádorů u živých organismů. Pouze několik chemických látek s pozitivním výsledkem Amesova testu však bylo při testování na větších organismech považováno za nevýznamné, ale pozitivní výsledek Amesova testu na bakteriích stále nelze jednoznačně spojit s projevy rakoviny u větších organismů. I když to může být možný faktor určující vznik nádorů u živých organismů, lidí, zvířat a tak dále, je třeba dokončit další studie, aby se dospělo k závěru.
Metody založené na auxotrofii k začlenění nepřirozených aminokyselin do proteinů a proteomůRedakce
Velké množství nepřirozených aminokyselin, které se tvarem, velikostí a chemickými vlastnostmi podobají svým kanonickým protějškům, se zavádí do rekombinantních proteinů pomocí auxotrofních expresních hostitelů. Například auxotrofní kmeny Escherichia coli s methioninem (Met) nebo tryptofanem (Trp) lze kultivovat v definovaném minimálním médiu. V tomto experimentálním uspořádání je možné exprimovat rekombinantní proteiny, jejichž kanonické zbytky Trp a Met jsou zcela nahrazeny různými příbuznými analogy doplněnými médiem. Tato metodika vede k nové formě proteinového inženýrství, které se neprovádí manipulací s kodony na úrovni DNA (např. mutagenezí řízenou oligonukleotidy), ale přeřazováním kodonů na úrovni translace proteinů pod účinným selekčním tlakem. Proto se tato metoda označuje jako inkorporace selekčním tlakem (SPI).
Žádný dosud studovaný organismus nekóduje jiné aminokyseliny než kanonických dvacet; dvě další kanonické aminokyseliny (selenocystein, pyrrolyzin) se do proteinů vkládají překódováním signálů ukončení translace. Tuto hranici lze překročit adaptivní laboratorní evolucí metabolicky stabilních auxotrofních mikrobiálních kmenů. Například v roce 2015 byl učiněn první jasně úspěšný pokus o evoluci Escherichia coli, která dokáže přežít pouze na nepřirozené aminokyselině thienopyrrolyl) alaninu jako jediné náhradě tryptofanu
.