Beta-Galaktosidázový test (A better Miller)

BY admin
|

Protocols

zpět k protokolům

Pozadí

β-Galaktosidáza je kódována genem lacZ operonu lac u E. coli. Jedná se o velký (120 kDa, 1024 aminokyselin) protein, který tvoří tetramer. Funkcí enzymu v buňce je štěpit laktózu na glukózu a galaktózu, aby mohly být využity jako zdroje uhlíku/energie. Syntetická sloučenina o-nitrofenyl-β-D-galaktosid (ONPG) je také rozpoznána jako substrát a štěpí se za vzniku galaktózy a o-nitrofenolu, který má žlutou barvu. Pokud je v reakci přebytek ONPG nad enzymem, je produkce o-nitrofenolu za jednotku času úměrná koncentraci β-galaktosidasy; produkci žlutého zbarvení lze tedy použít k určení koncentrace enzymu.

Takže, proč nás to zajímá? Obvykle se experimenty navrhují tak, aby koncentrace β-Galaktosidázy v buňce byla ukazatelem některého aspektu studovaného systému. Například výzkumník může spojit promotor s genem lacZ a použít hladiny β-Gal jako ukazatel aktivity promotoru za různých podmínek. V roce 1972 publikoval Jeffrey Miller knihu „Experiments in Molecular Genetics“, která obsahovala protokol pro stanovení množství β-Gal pomocí ONPG. Z tohoto důvodu se testy ONPG/β-Gal označují jako „Millerovy“ testy a standardizované množství aktivity β-Gal je „Millerova jednotka“.

1 Millerova jednotka = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420}) – (1,75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

kde:

  • Abs420 je absorbance žlutého o-nitrofenolu,
  • Abs550 je rozptyl z buněčných zbytků, který se po vynásobení 1.75 aproximuje rozptyl pozorovaný při 420 nm,
  • t = reakční doba v minutách,
  • v = objem testované kultury v mililitrech,
  • Abs600† odráží hustotu buněk.

†Všimněte si, že tato hodnota je pro každý použitý spektrofotometr jiná a měla by být kalibrována naředěním známých kultur Abs600, aby se určily jednotky tvořící kolonie na Abs600.

Ve své knize dr. Miller vysvětluje, že tento vzorec dává přibližně 1 Millerovu jednotku pro neindukovanou E. coli (nízká produkce β-Gal) a přibližně 1000 jednotek pro plně indukovanou kulturu (pěstovanou na laktóze nebo IPTG).

Podle mých zkušeností mají kultury MG1655 indukované 1 mM IPTG v log fázi 1500-1800 Millerových jednotek. Důvod tohoto rozdílu není znám, ale mám podezření, že pramení z rozdílů v hustotě Abs600/buněk mezi spektrofotometrem Dr. Millera a spektrofotometrem, který používám já, a ze skutečnosti, že své Millerovy testy provádím při 30 °C (kvůli pohodlí), zatímco Dr. Miller prováděl své testy při 28 °C. Provedl jsem promotorové fúze, které generují ~40 000 Millerových jednotek; jak však bude uvedeno níže, tato hodnota je pro test příliš vysoká, a proto byl protokol změněn tak, aby tato hodnota byla nižší.

Protokol

Protokol, který používám, je odvozen z článku Zhanga a Bremera (JBC 270, 1995, Volný plný text!), ve kterém byl původní Millerův protokol značně zjednodušen, aby bylo možné měřit více vzorků s menší manipulací.

Krátce řečeno, protokol spočívá v měření buněčné hustoty kultury bakterií (Abs600), poté se z kyvety odebere alikvotní část buněk a smíchá se s „permeabilizačním“ roztokem, který obsahuje detergent, který naruší buněčné membrány (ale ponechá β-Gal neporušený). To buňky usmrtí a zastaví translaci. Po inkubaci se přidá roztok „substrátu“ ONPG a nechá se rozvinout žluté zbarvení. Poté se přidá „stop“ roztok a změří se absorbance o-nitrofenolu.

  1. Pěstujte kultury za jakýchkoli podmínek, které si přejete testovat.
  2. Během růstu předem odměřte 80 μl alikvotů permeabilizačního roztoku do 1 ml.
  3. Odměřte Abs600 a ZAZNAČTE TO!
  4. Odeberte alikvotní část kultury o objemu 20 μl a přidejte ji k 80 μl permeabilizačního roztoku.

Vzorek je nyní stabilní po dobu několika hodin. To vám umožní provádět experimenty s časovým průběhem.

  1. Po odebrání posledního vzorku přemístěte vzorky a roztok Substrátu na 20-30 minut do teplé místnosti o teplotě 30 °C.
  2. Přidejte 600 μl roztoku Substrátu do každé zkumavky a POZNAČTE ČAS PŘIDÁNÍ.
  3. Po vytvoření dostatečného množství barvy přidejte 700 μl roztoku Stop, dobře promíchejte a POZNAČTE ČAS STOP.
  4. Po zastavení posledního vzorku (některé mohou trvat déle než jiné, ale obecně jsou hotové za 30-90 minut) přeneste zkumavky do mikrostředivky a točte 5-10 minut plnou rychlostí.
  5. Opatrně vyjměte zkumavky z centrifugy a přeneste roztok z horní části zkumavek do kyvety (kyvet). Snažíte se vyhnout tomu, aby se v kyvetě nacházely pevné částice, aby rozptyl neovlivnil odečet.
  6. Zaznamenejte Abs420. Tato hodnota by měla být menší než 1 a větší než 0,05. Pokud je trochu mimo tento rozsah, netrapte se tím.

Vypočítejte Millerovy jednotky jako:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{ vzorkované kultury})*(\text{objem } )*(\text{reakční čas}))} } }

Komentáře k testu

  • Reshma 11:28, 15. října 2007 (CDT): Miller doporučuje kulturu s OD600 = 0,28 až 0,70. Tvrdí však, že lze použít i jednodenní kultury, ale že exponenciálně rostoucí buňky poskytují přesnější testy .
  • Kdy se reakce provádí? Na tuto otázku jsem v literatuře nikdy nenašel dobrou odpověď. Pokud jsem nechal reakci proběhnout až do konce, naměřil jsem Abs420 ~2-3. To je samozřejmě mimo spolehlivý rozsah spektrofotometru, ale naznačuje to, jak daleko může reakce dojít. Získal jsem reprodukovatelné údaje, když byla žlutá barva před přidáním zastavovacího roztoku právě detekovatelná až zhruba do barvy LB bujónu před zastavením. Nezapomeňte, že potřebujete substrát, aby se enzym v průběhu reakce nasytil, takže je nenechte zajít příliš daleko. Běžně provádím tři samostatná měření pro každou kulturu a průměruji je.
    • Reshma 11:28, 15. října 2007 (CDT): Miller doporučuje, aby hodnota OD420nm byla ideálně 0,6-0,9 .

  • Často lidé používají jednorázové plastové kyvety k měření zákalu kultury i žlutého o-nitropenolu. Podle mých zkušeností mají jednorázové kyvety HROZNOU optiku: ano, jsou čiré, ale dráha světla je žalostně zkreslená (stačí se přes jednu podívat na vzdálený objekt). To není velký problém, pokud se pro slepý vzorek a vzorek použije stejná kyveta a ve spektrofotometru se orientuje stejným způsobem. Problém nastává, když se v různých kyvetách měří mnoho různých vzorků. Hodnoty se mohou VELMI lišit i u stejné kultury měřené v různých kyvetách. Doporučuji používat buď kvalitní skleněné nebo křemenné kyvety, nebo měřit vzorky v destičkové čtečce s použitím 96jamkových destiček s plochým dnem. Zjistil jsem, že moje chyba při pipetování 150 μl kultury pro měření Abs600 byla DOST menší než při použití jednorázových kyvet. Samozřejmě, že měřený zákal by měl být kalibrován na buňky/ml jako u 1cm kyvety.
  • Otočením vzorků a opatrným odebráním vzorku ze supernatantu se vyhnete nutnosti měřit rozptyl při 550 nm a odhadovat, jaký by byl při 420 nm.
  • Pokud vaše reakce obsahuje příliš mnoho β-Gal, zkumavka během několika minut (nebo dokonce sekund) zežloutne. To je příliš rychlé. Jedním z největších příspěvků k chybě bude váš odhad reakční doby. Tím, že podmínky reakce nastavíte tak, aby trvala přibližně hodinu, se časové chyby stanou zanedbatelnými. Pokud potřebujete reakci zpomalit, můžete použít méně buněk a zvýšit množství permeabilizačního pufru tak, aby objem byl stále 100 μl. Případně můžete znovu upravit vazebné místo pro ribozom v konstruktu β-Gal, abyste ho oslabili. Zjistil jsem, že pokud mé buňky vytvářely 40 000 Millerových jednotek β-Gal, byly velmi nemocné z translačního stresu. V tomto případě bylo lepší oslabit translaci mRNA β-Gal.
    • Tyto reakce dělám stejně jako kinetiku enzymů. Vzorky spouštím s odstupem 10 s (s odpočítáváním času), takže je možné získat přesné reakční časy, i když reakce necháte probíhat jen několik minut. Získávám velmi reprodukovatelné výsledky s reakčními časy 1,5-30 min. Jakmile zjistíte, jak dlouho budou reakce trvat, je snadné seskupit vzorky, které budou potřebovat stejnou reakční dobu. Provedení každého vzorku ve třech opakováních vám dá jistotu, že vaše časování je reprodukovatelné.–Kathleen 16:43, 14. prosince 2005 (EST)
  • Tady je příklad skutečných údajů, které jsem získal pomocí tohoto testu. Jednalo se o experiment s časovým průběhem. V každém okamžiku jsem odebral 1 ml z každé z mých kultur, změřil OD600, odebral tři alikvoty po 20 µl přímo z kyvety a každý přidal do 80 µl permeabilizačního roztoku. Test jsem provedl přesně podle výše uvedeného popisu a všechny vzorky jsem uchovával při pokojové teplotě až do ukončení časového průběhu. OD600 těchto kultur se v průběhu tohoto experimentu pohybovala od 0,4 do 4 (v mém spektru) a reakční časy pro testy β-Gal se pohybovaly od 2 do 25 min. V grafu jsou vyneseny tři jednotlivé β-Gal testy pro každý časový bod pro každou kulturu (červené nebo černé symboly), aby byla znázorněna reprodukovatelnost testu v rámci každého experimentu.Kathleen

Millergraph.jpg

Recepty

Permeabilizační roztok

Potřebujete 80 μl na vzorek.

  • 100 mM dibasický fosforečnan sodný (Na2HPO4)
    • (Protokol Zhang má 200 mM fosforečnan sodný. Ten se mi nikdy nepodařilo dostat do roztoku s ostatními složkami, ať jsem zkoušel, co jsem zkoušel, tak jsem ho stáhl na 100 mM. Použil jsem dokonce 50 mM bez zjistitelné změny.“
  • 20 mM KCl
  • 2 mM MgSO4
  • 0,8 mg/ml CTAB (hexadecyltrimethylamonium bromid)
  • 0.4 mg/ml deoxycholátu sodného
  • 5,4 μl/ml beta-merkaptoethanolu

Substrátový roztok

Na jeden vzorek potřebujete 600 μl.

  • 60 mM Na2HPO4
  • 40 mM NaH2PO4
  • 1 mg/ml o-nitrofenyl-β-D-galaktosidu (ONPG)
  • 2.7 μl/mL β-merkaptoethanolu

(Zhangův protokol obsahuje také 20 μg/mL CTAB a 10 μg/mL deoxycholátu. Ty vynechávám v domnění, že jich je ještě dost z permeabilizačního roztoku, a pokud ještě nejsou mrtvé, tak už nebudou)

Zastavovací roztok

Na jeden vzorek potřebujete 700 μl.

  • 1 M uhličitan sodný (Na2CO3)

Vysoké pH zastavovacího roztoku denaturuje β-Gal a přibližně zdvojnásobuje žluté zbarvení reakce.