Biologické hodiny

Střídání dne a noci zemského cyklu je natolik spolehlivé, že není překvapivé, že živočichové, rostliny a bakterie přizpůsobují své chování a fyziologii (přehled viz ref. 1). Cirkadiánní rytmy jsou všudypřítomnou adaptací všech organismů na nejpředvídatelnější výzvy prostředí. Biologický rytmus, který přetrvává za stálých podmínek a má periodu ≈1 den, se nazývá „cirkadiánní“ (circa, „kolem“; dian, „den“).

Do nedávna zůstávaly molekuly, které jsou základem oscilace, neznámé. Narušení těchto oscilací inhibitory syntézy RNA nebo proteinů naznačuje, že se tyto molekuly podílejí (2).

Přístupem, který byl úspěšný při odhalování mechanismů, je použití genetických změn. Prvním a druhým mutantem hodin objeveným u ovocné mušky Drosophila melanogaster jsou periodické a bezčasové geny (3-5).

U ovocných mušek se množství mRNA a proteinových produktů periodických a bezčasových genů cyklicky mění po dobu ≈24 hodin ve specifických místech mušího mozku (6). Maki Kaneko a kol. hovořili o těchto domnělých pacemakerových buňkách v mozku ovocných mušek pomocí těchto molekulárních oscilací jako markeru (7). V dospělé hlavě studie proteinů ukázaly, že per je rytmicky exprimován ve specifických místech, laterálních neuronech nacházejících se mezi centrálním mozkem a optickými laloky. Laterální neurony jsou považovány za domnělé pacemakerové buňky pro rytmus lokomoční aktivity dospělé mouchy.

Kaneko a spol. prokázali (7), že produkty per a tim jsou detekovatelné v omezeném počtu neuronů v larválním mozku. Expresní vzorce v několika takových buňkách jsou cyklické. Mezi těmito neurony exprimuje pět laterálně umístěných buněk. PERIOD (PER) od raného larválního stádia, což naznačuje, že mohou být zodpovědné za larvální udržování času eklúze a lokomoční aktivity. Dalším zajímavým nálezem je shluk neuronů s cyklickou expresí per a tim v antifázi k laterálním neuronům. Výsledky naznačují přítomnost více oscilátorů zapojených do rytmů různých fyziologických nebo behaviorálních procesů v jednom organismu. Kaneko a spol (7) také popsali anatomickou charakterizaci vzorců zapojení pacemakerových neuronů pomocí exprese reportérového genu závislého na promotoru per. Takový molekulárně anatomický přístup by měl přinést nový pohled na funkční mapování tohoto mozkového systému. Srovnání savčích a muších hodinových buněk by navíc mělo objasnit evoluční vztahy mezi těmito systémy.

Cirkadiánní řízení transkripce poskytuje vstupní bod pro analýzu cis-regulačních prvků a trans-regulačních faktorů, jejichž prostřednictvím mohou hodiny regulovat exprese mnoha genů řízených hodinami (6). Předpokládá se, že tyto domnělé cis-akční regulační elementy, nazvané „time-box“ (8), se nacházejí v promotorové a enhancerové oblasti hodinově řízených genů. Hodinami řízený responzivní element (6) neboli time-box může navíc regulovat endogenní cirkadiánní fyziologické jevy za konstantních podmínek. Nejnověji byl možný kandidát na time-box identifikován v promotorové oblasti genu pro periodu u drozofily (9). Ačkoli bylo navrženo, že per zprostředkovává koloběh mRNA prostřednictvím transkripční represe, přímá interakce mezi per a DNA je velmi nepravděpodobná, protože v PER chybí DNA vazebná doména. Hardinova skupina rozsáhle analyzovala promotorovou oblast genu per ve studiích využívajících transgenní mouchy s fúzním genem per-lacZ (9). Identifikovali cirkadiánní transkripční enhancer v 69-bp fragmentu DNA obsahujícím E-box před genem per, který je zodpovědný za noční aktivaci exprese genu per. E-box je známé vazebné místo pro transkripční faktory třídy basic helix-loop-helix.

Nejnověji je zatím nejsilnějším kandidátem na transkripční faktor v oscilátoru Clock, klonovaný pomocí dopředné genetické strategie (10). Takahashiho skupina (10) izolovala a analyzovala aktivitu lokomotorů cirkadiánních mutantních kmenů myší. Mutant Clock vykazoval dlouhou periodu, která se po několika dnech v trvalé tmě stala arytmickou. Takahashi a jeho kolegové (10) úspěšně naklonovali odpovědný gen a identifikovali mutaci v oblasti kódující protein genu Clock. Zajímavé je, že protein Clock obsahuje doménu PAS (protein-protein binding domain), která se nachází v genu Drosophila per, a motiv basic helix-loop-helix pro vazbu na DNA. Takahashi a jeho kolegové (10) navíc dokázali přenosem normálního hodinového genu zcela zachránit dlouhou periodu a arytmický fenotyp hodinových mutantních myší.

Ravi Allada a spol. popsali společné molekulární komponenty se zaměřením na Clock, který je zodpovědný za generování cirkadiánního rytmu u mušek i lidí (11). Allada a jeho kolegové (11) provedli screening chemicky mutagenizovaných mušek a hledali mutanty, které mění nebo ruší cirkadiánní rytmicitu lokomoční aktivity, a našli nového arytmického mutanta, původně nazvaného Jrk. Mouchy Jrk exprimují nízké hladiny proteinů periody a bezčasí v důsledku snížené úrovně transkripce. Byl identifikován gen, který vykazuje nápadnou sekvenční konzervaci s genem pro cirkadiánní rytmus savců, Clock; proto Allada et al. (11) přejmenovali tento muší gen na dClock. Stejně jako myší hodiny i drozofilní hodiny obsahují domény basic helix-loop-helix a PAS a také transkripční aktivační doménu.

Nejnovější práce ze savců i mušek naznačují, že evolučně konzervovaní jsou i proteinoví partneři CLOCK (pojmenovaní BMAL) (12, 13). Bylo prokázáno, že dimery CLOCK-BMAL se vážou na promotorovou oblast genů period a timeless a u mušek oba geny transaktivují. Exprese genu PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) navíc potlačuje indukci reportéru zprostředkovanou CLOCK-BMAL. Byl tedy navržen model negativní zpětné vazby (obr. 1).

U savců je SCN v hypotalamu považována za hlavní pacemaker fenoménu cirkadiánního rytmu, jak prokázaly mnohé anatomické a fyziologické studie (14). Nedávno byly zaznamenány tři homology drozofilního genu pro periodu u myši a člověka (15). Navzdory existenci tří savčích homologů periody, které vykazují cirkadiánní oscilaci mRNA v suprachiasmatickém jádru v myším mozku, nebyly zaznamenány žádné funkční důsledky cirkadiánního chování lokomotivy.

Aby se objasnilo, zda se savčí per homolog může podílet na cirkadiánním rytmu lokomočního chování savců, Ishidova skupina naklonovala potkaní per homolog a vytvořila arytmické SCN-lesie potkanů pro sledování cirkadiánních rytmů v periferních tkáních (16).

Pro ověření, zda je rytmická exprese mRNA potkaního PERIODU 2 (RPER2) pozorována i v jiných tkáních než SCN, byla provedena analýza Northern blot na tkáních oka, mozku, srdce, plic sleziny, jater a ledvin. Zajímavé je, že všechny testované tkáně vykazovaly rytmickou expresi mRNA RPER2, i když poměr noc/den byl v každé tkáni jiný. RPER2 se chová jako savčí homolog genu pro periodu u Drosophily (16), protože jeho cirkadiánní exprese byla vysoká v noci v celé řadě tkání, stejně jako je tomu u period u Drosophily.

Protože SCN je u savců považována za pacemaker cirkadiánních hodin, Ishidova skupina (16) testovala, zda je cirkadiánní exprese RPER2 mRNA ve více tkáních ovlivněna lézí SCN. Překvapivě byla rytmická povaha vícenásobné tkáňové exprese RPER2 lézí SCN zcela zrušena. Mnohonásobná tkáňová exprese RPER2 je tedy pod kontrolou SCN. Jedná se o první zprávu, která naznačuje, že vícetkáňový cirkadiánní rytmus je řízen mozkovými hodinami savců, SCN hypotalamu. Údaje také naznačují, že homolog savců per (RPER2) by se mohl podílet na cirkadiánním rytmu lokomočního chování u savců, protože při ztrátě cirkadiánní aktivity lokomočního chování potkanů došlo ke ztrátě cirkadiánní exprese mRNA RPER2 v celém těle. K objasnění takového problému je třeba vytvořit transgenní zvířata se ztrátovou nebo získanou funkční mutací v genu RPER2. Skutečnost, že rytmická exprese mRNA RPER2 v několika tkáních zcela závisí na SCN, naznačuje, že pro koordinované udržování rytmu celého těla jsou zapotřebí určité signály (obr. 2). Studie transplantace SCN rovněž naznačuje význam humorálních faktorů z SCN (17). Tyto humorální faktory z SCN by mohly být důležité pro vytváření cirkadiánní rytmické exprese genu RPER2 v periferních tkáních. Zdá se tedy, stejně jako v případě vývojové biologie, že klíčové molekuly těchto biologických hodin jsou mezi mouchami a savci dobře konzervovány. V blízké budoucnosti lze předpokládat společný mechanismus molekulárních hodin od bakterií (18) až po člověka.

.