BiomedicalReports

Úvod

Hepatocelulární karcinom (HCC) je primární nádorové onemocnění hepatocytů, které představuje 80 % všech primárních nádorů jater. Celosvětově je HCC řazen mezi čtvrtou nejčastější příčinu úmrtí souvisejících s rakovinou (1). u pacientů s chronickými jaterními onemocněními spojenými s infekcí virem hepatitidy B nebo hepatitidy C často vzniká HCC(2). Došlo ke zdokonalení chirurgických technik a vývoji několika nechirurgických způsobů léčby, nicméně zlepšení extrémně špatné prognózy pacientů s HCC zůstává omezené (3).

Rozsáhlý výzkum apoptózy, známé také jako programovaná buněčná smrt, v posledních desetiletích vyzdvihl tento proces jako vhodnou metodu pro léčbu rakoviny (4,5). Četné léky s apoptotickými účinky jsou však v současné době pro léčbu rakoviny omezeny kvůli vedlejším účinkům. Proto je důležité identifikovat nové a spolehlivé terapeutické látky, které mohou účinně indukovat apoptózu nádorových buněk při léčbě pacientů s HCC.

V poslední době hraje tradiční čínská medicína důležitou roli v léčbě zhoubných nádorů díky svýmvýrazně zlepšujícím účinkům a nižším vedlejším účinkům (6). Gekon, jedna z oblíbených tradičníchčínských léčiv, se v klinické praxi používá jako surové léčivo k léčbě zhoubných nádorů (7-9). Surové peptidy gekona a etanolový extrakt z gekona mohou indukovat apoptózu u lidských buněkHCC a vykazovat protinádorovou aktivitu u myší s ascitem H22,což bylo prokázáno v našich předchozích studiích (10,11). Cílem této studie bylo prozkoumat apoptotický účinek a základní mechanismus směsi gekončích peptidů (GPM) u buněčných linií lidského jaterního karcinomu HepG2 in vitro.

Materiály a metody

Medicínské materiály a činidla

Gekončík japonský byl zakoupen od společnosti BozhouYonggang Medicinal Herbs Factory Co., Ltd. (dále jen „společnost BozhouYonggang“). (Anhui, Čína). Lidská buněčná linie HCC HepG2 byla poskytnuta Medical Science ResearchInstitute of Henan (Henan, Čína).

Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromid (MTT)a Hoechst 33258 byly zakoupeny od firmy Sigma (St. Louis, MΟ, USA).

Kit pro test aktivity kaspáz byl zakoupen od BeyotimeInstitute of Biotechnology (Peking, Čína). Primární protilátka proti faktoru indukujícímu apoptózu (AIF) byla zakoupena od společnosti BosterInc. (Wuhan, Hubei, Čína) a protilátka proti β-aktinu byla zakoupena od společnosti Proteintech (Wuhan, Hubei, Čína). Primární protilátka proti cytochromu c (Cyt c) a sekundární protilátka konjugovaná s myší nebo králičí protilátkou byly zakoupeny od společnosti Zhongshan GoldenBridge Biotechnology Co., Ltd. (Peking, Čína).

Mikroplate reader byl výrobek společnosti BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, USA). Fluorescenční a inverzní mikroskopy BX41 byly výrobkem společnosti Olympus (Tokio,Japonsko).

Příprava GPM

Prášky gekonů (100 g) byly smíchány se 400 ml dvakrát destilované vody a připraveny na homogenát. Po odstředění při 5 600 × g po dobu 5 min byla sraženina sebrána a namočena do 400 ml 55% roztoku ethanolu. Po odstředění při 5 600 × g po dobu 5 min byl získán supernatant, který byl odpařen za sníženého tlaku při 55 °C. Následně byl po lyofilizaci zbytkové kapaliny odebrán žlutý prášek. K přečištění žlutých prášků byla použita gelová filtrační chromatografie (SephadexG-25) a nakonec byl shromážděn GPM.

Buněčná kultivace a morfologické pozorování

Buňky HepG2 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovanémEagleově médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem, 100 U/mlpenicilinem a streptomycinem při 37 °C ve zvlhčeném inkubátoru s 5%CO2. Kultivační médium bylo vyměňováno každé dva dny a buňky v logaritmické růstové fázi byly použity pro následující experimenty. Buňky HepG2 (3,0×104 buněk/ml) byly inkubovány s různými koncentracemi GPM po dobu 24 hodin. Buňky byly pozorovány a snímky pořízeny pomocí inverzního fázově kontrastního mikroskopu za účelem zjištění morfologických změn.

MTT test

Buňky HepG2 byly nasazeny do 96jamkové destičky v hustotě 6,0×103 buněk/jamku. Do každé jamky byly přidány různé koncentrace GPM a 0,003 mg/ml fluorouracilu (5-Fu).Po inkubaci po dobu 20, 44 a 68 h bylo do každé jamky přidáno 20 µl činidlaMTT (5 mg/l) a inkubováno po dobu dalších 4 hodin. Supernatant byl nahrazen 200 µl dimethylsulfoxidu a absorbance (A) při 490 nm byla změřena pomocí ELX800 UniversalMicroplate reader. Míra inhibice buněčné proliferace (IR) byla následující:

Barvení Hoechstem 33258

Po noční kultivaci v 6jamkové destičce bylyHepG2 buňky ošetřeny různými koncentracemi GPM (0,0,06 nebo 0.08 mg/ml) a 0,003 mg/ml 5-Fu v čerstvém kultivačním médiu při37 °C po dobu 24 h. Buňky byly dvakrát promyty fosfát-bufferedsalinem (PBS) a obarveny barvicím roztokem Hoechst 33258 (10 µg/ml). Po 15 minutách inkubace ve tmě byly buňky dvakrát promyty studeným PBS a vyšetřeny fluorescenčním mikroskopem.

Analýza aktivity kaspázy

Stanovení aktivity kaspázy-3 a kaspázy-9 bylo provedeno pomocí soupravy Caspase Activity Assay podle protokolu výrobce. Po vystavení několika koncentracím GPM (0, 0,06 nebo 0,08 mg/ml) a 0,003 mg/ml 5-Fu po dobu 24 hodin byly buňky sklizeny a resuspendovány v lyzačním pufru. Následně byly buňky 20 min inkubovány v lyzačním pufru a 3 min centrifugovány při 16 000 × g při 4 °C. Supernatanty byly odebrány a hladiny proteinů byly stanoveny Bradfordovou metodou a aktivity kaspázy-3 a kaspázy-9 byly měřeny pomocí reakčního pufru (obsahujícího dithiotreitol) a kaspázových substrátů Ac-DEVD-pNA a Ac-LEHD-pNA. Získané hodnoty při optické hustotě při 405 nm byly vyjádřeny jako:AGPM/ACkontrola.

Western blot analýza

HepG2 buňky byly ošetřeny GPM (0, 0,06 nebo 0,08mg/ml) a 0,003 mg/ml 5-Fu po dobu 24 hodin. Krátce, buňky byly ošetřeny lyzačním pufrem na ledu po dobu 30 min a byly centrifugovány při 13 000 × g po dobu 30 min při 4 °C. Koncentrace bílkovin byla stanovena Bradfordovou metodou. Proteiny byly separovány pomocí 12% SDS-PAGE a přeneseny na PVDF membránu.PVDF membrána byla blokována 5% netučným sušeným mlékem v PBS po dobu 1 h při 37 °C, třikrát promyta fyziologickým roztokem obsahujícím 0,1%Tween-20 (TBST) po dobu 15 min a následovala inkubace s primárními protilátkami: Kaspáza-3 (kat. č. sc-7148; 1:200, polyklonální králičí protilátka proti člověku), kaspáza-9 (kat. č. sc-8355; 1:200, polyklonální králičí protilátka proti člověku), Cyt c (kat. č. sc-7148; 1:200, polyklonální králičí protilátka proti člověku). sc-13156; 1:500, monoklonální myší anti-human), AIF (kat. č. PB0388; 1:200, polyklonální králičí anti-human) a β-aktin (kat. č. 66009-1-Ig;1:5000, monoklonální myší anti-human) přes noc při 4 °C.Následně byly vzorky promývány 30 min pomocí TBST a inkubovány s odpovídajícími sekundárními protilátkami po dobu 1 h. Chemiluminiscence byla detekována pomocí ECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology).

Statistická analýza

Experimentální data jsou reprezentována jako průměr ± standardní odchylka. Rozdíly mezi skupinami bylyzkoumány pomocí jednosměrné analýzy rozptylu pomocí systému SPSS 19.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). P<0,05 bylo považováno za statisticky významný rozdíl.

Výsledky

GPM inhibuje proliferaciHepG2 buněk

Vliv GPM na růst HepG2 buněk byl hodnocen pomocí MTT testu. Výsledky ukázaly, že GPM významněinhibuje proliferaci buněk HepG2 v závislosti na dávce a čase (obr. 1). Po ošetření GPM po dobu 24, 48 nebo 72 hodin byly hodnotyIC50 0,154, 0,133 a 0,051 mg/ml.Buňky ošetřené GPM vykazovaly zaoblenou morfologii, smršťování a ztrátu přilnavosti (obr. 2).

Vliv GPM na nukleární morfologii

Apoptotická morfologie buněk byla identifikována pomocí barveníHoechst 33258. Jak ukazuje obr. 3, morfologické změny apoptotických charakteristik, jako je jaderná kondenzace, chromozomální kondenzace a granulární apoptotická tělíska, byly u buněk ošetřených GPM pozorovány také pomocí fluorescenční mikroskopie.

Vliv GPM na aktivitu kaspázy

Jako iniciátory a vykonavatelé buněčné smrti mají cysteinové proteázy důležitou roli v apoptotickém procesu(12). Jak ukazuje obr. 4, působení GPM způsobilo významné zvýšení aktivity kaspázy-3 a kaspázy-9 v závislosti na dávce, což naznačuje apoptotický účinek GPM v buňkách HepG2.

Vliv GPM na hladinu exprese apoptotických proteinů

Jak ukazuje obr. 4, GPM působí na aktivitu kaspázy-3 a kaspázy-9 v závislosti na dávce. 5,western blotting prokázal, že se zvýšilo uvolňování Cyt c aAIF z mitochondrií do cytosolu, zatímco hladiny exprese kaspázy-3 a kaspázy-9 byly léčbou GPM zvýšeny v závislosti na dávce. Změny v proteinech se významně lišily ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 6)(P<0,05).

Diskuse

V posledních desetiletích se výrazně zvýšil výskyt rakoviny, což způsobuje vážné poškození lidského zdraví(13). Ačkoli současnéterapeutické strategie prokázaly zjevnou protinádorovou schopnost,závažným vedlejším účinkům se stále nelze vyhnout. Hledání nových protinádorových látek, které by byly účinnější, ale méně toxické, přitahuje stále větší pozornost (14).Extrakce peptidů z přírodních léčiv pro léčbu rakoviny byla ve světě hojně uváděna a je v léčbě rakoviny slibná. Peptidy by mohly hrát různou roli, například inhibovat proliferaci nádorů, zastavovat buněčný cyklus, potlačovat nádorovou angiogenezi a indukovat apoptózu (15). Gekon je v tradiční čínské medicíně hojně využíván již stovky let. V našich předchozích studiích vykazovaly surové peptidy gekona účinnou protinádorovou aktivitu na myších s H22 a na buněčné linii HepG2 (16,17).Účinky GPM na lidské hepatocyty však dosud nebyly objasněny. Proto bylo cílem této studie dále odhalit základní molekulární mechanismus, kterým GPM indukujeapoptózu u lidské buněčné linie HCC HepG2.

V této studii MTT test odhalil, že GPM může inhibovat růst buněk HepG2 v závislosti na dávce a čase. Další experimenty prokázaly, že tatoinhibice byla způsobena léčbou GPM, která vyvolala na dávce závislou buněčnou smrt s typickými morfologickými změnami. Tyto údaje naznačují, že GPM může být potenciálně účinným prostředkem pro léčbu rakoviny. pomocí barvení Hoechstem 33258 bylo prokázáno, že buněčná smrt vyvolaná GPM v buňkách HepG2, která patří k apoptóze, pro hladiny exprese kaspázy-3 a kaspázy-9 byla po léčbě GPM zvýšena. Analýza Western blotu také ukázala, žeGPM může stimulovat uvolňování Cyt c a AIF zmitochondrií do cytosolu, což naznačuje, že GPM indukovanáapoptóza v buňkách HepG2 je zprostředkována mitochondriální apoptotickou cestou.

Apoptóza je hlavním kontrolním mechanismem, kterýmbuňky odumírají za mnoha podmínek, například při nesprávné opravě poškozeníDNA (18). Tento sebedestruktivní buněčný proces má zásadní význam pro vývoj orgánů, remodelaci tkání, regulaci imunity a několik chorobných stavů (19). Řada protinádorových látek uplatňuje své léčebné účinky indukcíapoptózy (20-24). Mitochondrie mají zásadní úlohu v regulaci buněčné apoptózy a existují určité proteiny, které jsou úzce spojeny s buněčnou apoptózou vintermembráně (25).

Mitochondriální ultrastruktura je během buněčné apoptózy normální, ale její funkce se výrazně změnila. mitochondriální dysfunkce vyvolává otevření pórů mitochondriálního přechodu propustnosti a uvolňuje mitochondriálníapoptogenní proteiny, jako je AIF (26) a Cyt c (27). Za normálních okolností se proteiny AIF a Cyt c nacházejí v mezimembránovém prostoru mitochondrií, zatímco působením různých AIF se z nich uvolňují do cytoplazmy. AIF je nakonec přenesen do jádra, což způsobuje charakteristické změny apoptózy. AIF byl první objevený protein, který zprostředkovává buněčnou smrt nezávislou na kaspáze (28). Cyt c se uvolňuje do cytosolu a indukuje apoptózu závislou na kaspáze, což vede k aktivaci kaspáz a apoptóze (29,30). AIFmůže zvyšovat apoptotické signály tím, že podporuje mitochondriální uvolňování Cyt c. Ačkoli apoptóza vyvolaná AIF není závislá na kaspáze, dochází ke křížovému působení, synergii a dokonce antagonismu mezi AIF, kaspázou a Cyt c. Vzhledem k různým signálům smrtia typům buněk se regulace buněčné apoptózy ve skutečnostiuskutečňuje prostřednictvím různých interakcí a celé signálnísítě, které vyžadují další studium.

Kaspáza, rodina cysteinových proteáz, je nedílnou součástí apoptotické dráhy. Indukceapoptózy je spojena s aktivací kaspázy (31). Kaspáza-3 je v downstreamu celopoptózy a kaspáza-9 je apikální kaspázou v cestě apoptózy iniciované mitochondriemi (32). Aktivace kaspázy-3 koreluje s aktivací kaspázy-9 (33). uvolnění Cyt c spouští aktivaci kaspázy-9 prostřednictvím tvorby apoptosomu. Následná aktivace iniciátorové kaspázy-9 způsobí štěpení efektorové kaspázy-3, která následně aktivuje DNázu a způsobí fragmentaci DNA v jádře (34). Souhrnně lze říci, že kaspáza-3 je exekuční kaspáza, která může být aktivována následující mitochondriální cestou zahrnující aktivaci kaspázy-9 v důsledku uvolnění Cyt c do cytosolu (35), což nakonec způsobí programovanou buněčnou smrt.

Závěrem lze říci, že GPM pravděpodobně vyvolala apoptotickou buněčnou smrt v buňkách HepG2 aktivací mitochondriální apoptotické cesty. Tyto výsledky ukazují, že GPM může být potenciální terapeutickou látkou pro léčbu HCC.

Poděkování

Tato studie byla podpořena grantem z Klíčových programů pro vědecký a technologický rozvoj provincie Henan (č. 142102310031).

Slovníček

Zkratky

Zkratky:

GPM	směs gekonových peptidů
Cyt. c	cytochrom c

	Abrams P a Marsh JW: Současný přístup k hepatocelulárnímu karcinomu. Surg Clin North Am. 90:803-816. 2010. zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	But DY, Lai CL a Yuen MF: Naturalhistory of hepatocellular carcinoma-related hepatitis. World JGastroenterol. 14:1652-1656. 2008. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Faivre S, Bouattour M and Raymond E: Nové molekulární terapie hepatocelulárního karcinomu. Liver Int.31(Suppl 1): 151-160. 2011. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kang TH, Bang JY, Kim MH, Kang IC, Kim HMand Jeong HJ: Atractylenolide III, a sesquiterpenoid, inducesapoptosis in human lung carcinoma A549 cells viamitochondria-mediated death pathway. Food Chem Toxicol. 49:514-519.2011. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liao N, Ao M, Zhang P and Yu L: Extractsof Lycoris aurea induce apoptosis in murine sarcoma S180 cells.Molecules. 17:3723-3735. 2012. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wang YX, Gu XX, Geng D, Sun HY, Wang CM,Jiang GX, Hou XN and Ma CH: Differentiation of bel-7402 humanhepatocarcinoma cells induced by aqueous extracts of fresh gecko(AG) and its anti-tumor activity in vivo. J Ethnopharmacol.155:1583–1588. 2014. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Song P: Wang XM a Xie S: Experimentalstudy on mechanisms of lyophilized powder of fresh gekko Chinenisin inhibiting H22 hepatocarcinoma angiogenesis. Zhongguo Zhong XiYi Jie He Za Zhi. 26:58-62. 2006.(Čínsky). PubMed/NCBI
	Yang JX and Wang XM: Progress study andresearch on treating tumor of Gecko. Chinese Journal of Digestion.14:2428-2431. 2006.
	Wu BD: Treatment of 105 cases of esophagustumor by compound recipe of Gecko. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Za Zhi.19:5021999.(In Chinese).
	Song Y, Wang JG, Li RF, Li Y, Cui ZC, DuanLX and Lu F: Gecko crude peptides induce apoptosis in human livercarcinoma cells in vitro and exert antitumor activity in a mouseascites H22 xenograft model. J Biomed Biotechnol. 2012:7435732012.Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Cui CC: Research of antitumor effect ofGecko ethanol extract II. Henan University of Science andTechnology. 2013: (In Chinese).
	Jiang CP, Ding H, Shi DH, Wang YR, Li EGand Wu JH: Pro-apoptotic effects of tectorigenin on humanhepatocellular carcinoma HepG2 cells. World J Gastroenterol.18:1753-1764. 2012. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Olefson S and Moss SF: Obesity and relatedrisk factors in gastric cardia adenocarcinoma. Gastric Cancer.18:23-32. 2015. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wang N, Tan HY, Li L, Yuen MF a Feng Y:Berberine and Coptidis Rhizoma as potential anticanceragents: Nejnovější aktualizace a perspektivy do budoucna. J Ethnopharmacol.176:35-48. 2015. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Costantino VV, Lobos-Gonzalez L, Ibañez J,Fernandez D, Cuello-Carrión FD, Valenzuela MA, Barbieri MA, SeminoSN, Jahn GA, Quest AF a Lopez LA: Dehydroleukodin inhibuje růst nádoru v preklinickém modelu melanomu tím, že indukuje zastavení buněčného cyklu, senescenci a apoptózu. Cancer Lett. 372:10-23. 2016.Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Xu XL, Wang JG, Li RF, Li SP, Qiu XJ andDuan LX: Inhibiční účinek směsi peptidů Gecko na růst buněk lidské linie skvamózního karcinomu jícnu EC109. ZhongguoLin Chuang Yao Li Xue Za Zhi. 29:602-604. 2013.
	Song Y, Wang JG, Cui CC, Qian X, Li RF,Duan LX, Liu L a Xi SM: Apoptotic mechanism of gecko crudepeptides on human liver carcinoma cell line HepG2. Zhong Yao Cai.35:863-866. 2012.(V čínštině). PubMed/NCBI
	Lowe SW a Lin AW: Apoptóza u rakoviny. karcinogeneze. 21:485-495. 2000. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Bhatia D, Mandal A, Nevo E a Bishayee A:Apoptosis-inducing effects of extracts from desert plants in HepG2human hepatocarcinoma cells. Asian Pac J Trop Biomed. 5:87-92.2015. Zobrazit článek : Google Scholar
	Li CJ, Huang SY, Wu MY, Chen YC, Tsang SF,Chyuan JH and Hsu HY: Induction of apoptosis by ethanolic extractof Corchorus olitorius leaf in human hepatocellularcarcinoma (HepG2) cells via a mitochondria-dependent pathway.Molecules. 17:9348-9360. 2012. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yang B, Wang YQ, Cheng RB, Chen JL, ChenJ, Jia LT a Zhang RS: Indukce cytotoxicity a apoptózy u lidských buněk rakoviny žaludku SGC-7901 isovaltrátem acetoxyhydrinisolu z Patrinia heterophylla bunge zahrnuje mitochondriální dráhu a zástavu buněčného cyklu ve fázi G2/M. Asian Pac J Cancer Prev.14:6481-6486. 2013. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kim TM, Shin SK, Kim TW, Youm SY, Kim DJand Ahn B: Elm tree bark extract inhibits HepG2 hepatic cancer cellgrowth via pro-apoptotic activity. J Vet Sci. 13:7-13. 2012.Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Nho KJ, Chun JM and Kim HK: EthanolExtract of Dianthus chinensis L. induces apoptosis in humanhepatocellular carcinoma HepG2 cells in vitro. Evid BasedComplement Alternat Med. 2012:5735272012. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li L, Chen GG, Lu YN, Liu Y, Wu KF, GongXL, Gou ZP, Li MY and Liang NC:Ent-11α-Hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid inhibits growth ofhuman lung cancer A549 cells by arresting cell cycle and triggeringapoptosis. Chin J Cancer Res. 24:109-115. 2012. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Cao MR, Li Q, Liu ZL, Liu HH, Wang W, LiaoXL, Pan YL a Jiang JW: Harmine induces apoptosis in HepG2 cellsvia mitochondrial signaling pathway. Hepatobiliary Pancreat DisInt. 10:599-604. 2011. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I,Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, LoefflerM, et al: Molecular characterization of mitochondrialapoptosis-inducing factor. Nature. 397:441-446. 1999. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R andWang X: Induction of apoptotic program in cell-free extracts:Requirement for dATP and cytochrome c. Cell. 86:147-157. 1996.Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Norberg E, Orrenius S and Zhivotovsky B:Mitochondrial regulation of cell death: Zpracování faktoru indukujícího apoptózu (AIF). Biochem Biophys Res Commun.396:95-100. 2010. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chandra D, Liu JW a Tang DG: Earlymitochondrial activation and cytochrome c up-regulation duringapoptosis. J Biol Chem. 277:50842-50854. 2002. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Zhang P, Xu Y, Li L, Jiang Q, Wang M andJin L: In vitro protective effects of pyrroloquinoline quinone onmethylmercury-induced neurotoxicity. Environ Toxicol Pharmacol.27:103-110. 2009. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li LK, Rola AS, Kaid FA, Ali AM a AlabsiAM: Goniothalamin indukuje zástavu buněčného cyklu a apoptózu u lidského spinocelulárního karcinomu ústní dutiny H400: cesta závislá na kaspáze a zprostředkovaná mitochondriemi se snížením regulace NF-κβ. ArchOral Biol. 64:28-38. 2016. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li Y, Hu J, Huang H and He Y: Effect ofJinlong capsule on proliferation and apoptosis of human pancreaticcancer cells BxPC-3. J Tradit Chin Med. 33:205-210. 2013.Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Du RH, Cui JT, Wang T, Zhang AH and TanRX: Trichothecin induces apoptosis of HepG2 cells via caspase-9mediated activation of the mitochondrial death pathway. Toxicon.59:143-150. 2012. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kang MH a Reynolds CP: Bcl-2 Inhibitors:targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy. ClinCancer Res. 15:1126-1132. 2009. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Jin Q, Nan JX a Lian LH: Antitumoractivity of leaves from potentilla discolor on human hepatocellularcarcinoma cell line HepG-2. Chin J Nat Med. 9:61-64. 2011.