Bisulfitové sekvenování

Bisulfitové sekvenování používá běžné sekvenační metody na genomové DNA ošetřené bisulfitem ke stanovení stavu metylace na dinukleotidech CpG. K dotazování na metylaci v konkrétních lokusech nebo na úrovni celého genomu se používají i jiné nesekvenační strategie. Všechny strategie předpokládají, že bisulfitem indukovaná přeměna nemetylovaných cytosinů na uracil je úplná, a to slouží jako základ všech následných technik. V ideálním případě by použitá metoda určovala stav metylace zvlášť pro každou alelu. Mezi alternativní metody k bisulfitovému sekvenování patří kombinovaná bisulfitová restrikční analýza a imunoprecipitace metylované DNA (MeDIP).

Metody analýzy DNA ošetřené bisulfitem se neustále vyvíjejí. Pro shrnutí těchto rychle se vyvíjejících metodik bylo napsáno mnoho přehledových článků.

Metodiky lze obecně rozdělit na strategie založené na metylačně specifické PCR (MSP) (obr. 4) a strategie využívající polymerázovou řetězovou reakci (PCR) prováděnou za nemetylačně specifických podmínek (obr. 3). Metody založené na mikročipech využívají také PCR založenou na nemetylačně specifických podmínkách.

Metody založené na nemetylačně specifické PCREdit

Obrázek 3: Metody analýzy metylace DNA nezaložené na metylačně specifické PCR. Po bisulfitové konverzi se genomová DNA amplifikuje pomocí PCR, která nerozlišuje mezi metylovanými a nemetylovanými sekvencemi. Četné dostupné metody se pak používají k rozlišení na základě změn v amplikonu v důsledku bisulfitové konverze.

Přímé sekvenováníEdit

První popsaná metoda analýzy metylace pomocí DNA ošetřené bisulfitem využívala PCR a standardní dideoxynukleotidové sekvenování DNA k přímému určení nukleotidů odolných vůči bisulfitové konverzi. Primery jsou navrženy tak, aby byly specifické pro vlákno i pro bisulfit (tj. primery obsahující cytosiny, které nejsou CpG, takže nejsou komplementární k DNA neošetřené bisulfitem), které obklopují (ale nezahrnují) zájmové místo metylace. Proto bude amplifikovat jak metylované, tak nemetylované sekvence, na rozdíl od metylačně specifické PCR. Všechna místa nemetylovaných cytosinů se zobrazí jako thyminy ve výsledné amplifikované sekvenci smysluplného řetězce a jako adeniny v amplifikovaném protismyslném řetězci. Začleněním vysoce výkonných sekvenačních adaptérů do primerů PCR lze produkty PCR sekvenovat pomocí masivně paralelního sekvenování. Alternativně a pracně lze produkt PCR klonovat a sekvenovat. K vylepšení produktu pro sekvenování lze použít metody vnořené PCR.

Všechny následné techniky analýzy metylace DNA s použitím DNA ošetřené bisulfitem vycházejí z této zprávy Frommera a kol (obrázek 2). Ačkoli většina ostatních modalit není skutečnými technikami založenými na sekvenování, termín „bisulfitové sekvenování“ se často používá k popisu technik analýzy metylace DNA s bisulfitovou konverzí obecně.

PyrosekvenováníEdit

Pyrosekvenování bylo také použito k analýze DNA ošetřené bisulfitem bez použití metylačně specifické PCR. Po amplifikaci zájmové oblasti pomocí PCR se pyrosekvenování používá ke stanovení bisulfitem konvertované sekvence specifických míst CpG v dané oblasti. Poměr C-T v jednotlivých místech lze stanovit kvantitativně na základě množství inkorporace C a T během prodloužení sekvence. Hlavním omezením této metody je cena technologie. Pyrosekvenování však dobře umožňuje rozšíření na vysoce výkonné screeningové metody.

Další vylepšení této techniky nedávno popsali Wong a spol. a používají alelově specifické primery, které do sekvence sekvenačního primeru začleňují jednonukleotidové polymorfismy, čímž umožňují oddělenou analýzu mateřských a otcovských alel. Tato technika je zvláště užitečná pro analýzu genomického imprintingu.

Metylačně citlivá jednovláknová konformační analýza (MS-SSCA)Edit

Tato metoda vychází z metody jednovláknové konformační polymorfní analýzy (SSCA) vyvinuté pro analýzu jednovláknových polymorfismů (SNP). SSCA rozlišuje jednořetězcové fragmenty DNA stejné velikosti, ale odlišné sekvence na základě rozdílné migrace v nedenaturující elektroforéze. V MS-SSCA se toho využívá k rozlišení bisulfitem ošetřených, PCR-amplifikovaných oblastí obsahujících zájmová místa CpG. Ačkoli SSCA postrádá citlivost, pokud je přítomen pouze jediný nukleotidový rozdíl, bisulfitová úprava často provádí řadu konverzí C na T ve většině zájmových oblastí a výsledná citlivost se blíží 100 %. MS-SSCA rovněž umožňuje semikvantitativní analýzu stupně metylace DNA na základě poměru intenzit pásů. Tato metoda je však určena k posouzení všech míst CpG jako celku v zájmové oblasti, nikoli jednotlivých míst metylace.

Analýza tání s vysokým rozlišením (HRM)Edit

Další metodou k rozlišení konvertované a nekonvertované bisulfitem upravené DNA je použití analýzy tání s vysokým rozlišením (HRM), kvantitativní techniky založené na PCR, která byla původně určena k rozlišení SNP. Amplikony PCR se analyzují přímo pomocí teplotního náběhu a následného uvolňování interkalujícího fluorescenčního barviva během tání. Stupeň metylace, reprezentovaný obsahem C-T v amplikonu, určuje rychlost tání a následné uvolnění barviva. Tato metoda umožňuje přímou kvantifikaci v testu s jednou zkumavkou, ale hodnotí metylaci v amplifikované oblasti jako celku, nikoli v konkrétních místech CpG.

Metylačně citlivé prodloužení jednonukleotidového primeru (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE využívá metodu prodloužení primeru původně navrženou pro analýzu jednonukleotidových polymorfismů. DNA se převede na bisulfit a primery specifické pro bisulfit se žíhají na sekvenci až do páru bází bezprostředně před CpG, který je předmětem zájmu. Primer se nechá prodloužit o jeden pár bází do C (nebo T) pomocí dideoxynukleotidů ukončujících polymerázu DNA a poměr C a T se stanoví kvantitativně.

K určení tohoto poměru C:T lze použít řadu metod. Zpočátku se MS-SnuPE spoléhala na radioaktivní ddNTP jako reportér prodloužení primeru. Lze také použít metody založené na fluorescenci nebo pyrosekvenování. K rozlišení dvou polymorfních produktů prodloužení primeru však lze použít analýzu hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí s matricí a ionizací v čase letu (MALDI-TOF), která je v podstatě založena na DOBRÉM testu určeném pro genotypování SNP. K rozlišení produktů prodloužení primerů byla rovněž použita iontově párová vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi (IP-RP-HPLC).

Base-specific cleavage/MALDI-TOFEdit

Nedávno popsaná metoda Ehricha a kol. dále využívá výhod bisulfitových konverzí přidáním base-specific cleavage kroku k rozšíření informací získaných ze změn nukleotidů. Tím, že se nejprve použije in vitro transkripce zájmové oblasti do RNA (přidáním promotorového místa RNA polymerázy k PCR primeru v počáteční amplifikaci), lze použít RNázu A ke štěpení RNA transkriptu na místech specifických pro bázi. Protože RNáza A štěpí RNA specificky na cytosinových a uracilových ribonukleotidech, dosáhne se specifičnosti báze přidáním dTTP odolného vůči štěpení, je-li požadováno štěpení specifické pro cytosin (C), a přidáním dCTP, je-li požadováno štěpení specifické pro uracil (U). Odštěpené fragmenty lze poté analyzovat pomocí MALDI-TOF. Bisulfitová úprava vede buď k zavedení/odstranění štěpných míst konverzí C na U, nebo k posunu hmotnosti fragmentu konverzí G na A v amplifikovaném reverzním řetězci. C-specifické štěpení bude specificky stříhat všechna metylovaná místa CpG. Analýzou velikosti výsledných fragmentů je možné určit specifický vzorec metylace míst CpG v DNA v rámci oblasti, spíše než určit rozsah metylace oblasti jako celku. Tato metoda prokázala účinnost při vysokokapacitním screeningu, který umožňuje provádět dotazování četných míst CpG ve více tkáních nákladově efektivním způsobem.

Methylačně specifická PCR (MSP)Edit

Obrázek 4: Methylačně specifická PCR je citlivá metoda pro diskriminační amplifikaci a detekci metylované oblasti zájmu pomocí metylovaných specifických primerů na bisulfitem konvertované genomové DNA. Takové primery se annealují pouze na sekvence, které jsou metylované, a tudíž obsahují 5-metylcytosiny, které jsou odolné vůči přeměně bisulfitem. Alternativním způsobem lze použít nemetylované specifické primery.

Tato alternativní metoda metylační analýzy rovněž používá bisulfitem upravenou DNA, ale vyhýbá se nutnosti sekvenovat zájmovou oblast. Místo toho jsou páry primerů samy navrženy tak, aby byly „metylovaně specifické“ tím, že obsahují sekvence doplňující pouze nepřeměněné 5-metylcytosiny, nebo naopak „nemetylovaně specifické“, doplňující thyminy přeměněné z nemetylovaných cytosinů. Metylace je určena schopností specifického primeru dosáhnout amplifikace. Tato metoda je zvláště užitečná pro vyšetřování CpG ostrovů s pravděpodobně vysokou hustotou metylace, protože zvýšený počet CpG párů v primeru zvyšuje specifičnost testu. Umístění CpG páru na 3′-konec primeru rovněž zvyšuje citlivost. První zpráva o použití MSP popisuje dostatečnou citlivost pro detekci metylace 0,1 % alel. Obecně se MSP a jemu příbuzné protokoly považují za nejcitlivější při dotazování na stav metylace v určitém lokusu.

Metoda MethyLight vychází z MSP, ale poskytuje kvantitativní analýzu pomocí kvantitativní PCR. Používají se primery specifické pro metylaci a rovněž se používá fluorescenční reportérová sonda specifická pro metylaci, která se annealizuje na amplifikovanou oblast. Alternativně lze navrhnout primery nebo sondu bez metylační specifity, pokud je třeba rozlišovat mezi páry CpG v rámci příslušných sekvencí. Kvantifikace se provádí ve vztahu k metylované referenční DNA. Modifikace tohoto protokolu pro zvýšení specifity PCR pro úspěšně bisulfitem konvertovanou DNA (ConLight-MSP) používá další sondu do bisulfitem nekonvertované DNA pro kvantifikaci této nespecifické amplifikace.

Další metodika využívající MSP-amplifikovanou DNA analyzuje produkty pomocí analýzy křivky tání (Mc-MSP). Tato metoda amplifikuje bisulfitem konvertovanou DNA pomocí metylovaných specifických i nemetylovaných primerů a určuje kvantitativní poměr obou produktů porovnáním rozdílných píků vzniklých při analýze křivky tání. Byla zavedena metoda analýzy tání s vysokým rozlišením, která využívá jak kvantitativní PCR, tak analýzu tání, zejména pro citlivou detekci nízkoúrovňové metylace

Metody založené na mikročipechEdit

Mikročipové metody jsou logickým rozšířením dostupných technologií pro analýzu bisulfitem upravené DNA, které umožňují analýzu metylace v celém genomu. Oligonukleotidové mikročipy jsou navrženy pomocí párů oligonukleotidových hybridizačních sond zaměřených na zájmová místa CpG. Jedna je komplementární k nezměněné metylované sekvenci a druhá je komplementární k nemetylované sekvenci převedené z C na U. Sondy jsou také specifické pro bisulfit, aby se zabránilo vazbě na DNA neúplně převedenou bisulfitem. Jedním z takových testů je Illumina Methylation Assay, který používá technologii bisulfitového sekvenování na úrovni mikročipů k získání údajů o metylaci celého genomu.

.