Brainbow
Techniky Brainbow se opírají o rekombinaci Cre-Lox, při níž protein Cre rekombináza řídí inverzi nebo excizi DNA mezi místy loxP. Původní metoda Brainbow zahrnuje jak Brainbow-1, tak Brainbow-2, které využívají různé formy rekombinace cre/lox. Brainbow-3, modifikovaná verze Brainbow-1, byla vyvinuta v roce 2013. U všech podtypů Brainbow je exprese daného XFP stochastickou neboli náhodnou událostí.
Brainbow-1 používá konstrukty DNA s různými geny fluorescenčních proteinů (XFP) oddělené mutantními a kanonickými formami loxP. To vytváří soubor vzájemně se vylučujících možností excize, protože rekombinace zprostředkovaná kre probíhá pouze mezi identickými místy loxP. Poté, co dojde k rekombinaci, je fluorescenční protein, který zůstane přímo za promotorem, jedinečně exprimován. Konstrukt se čtyřmi XFP oddělenými třemi různými místy loxP, třemi excizemi a původním konstruktem tak může produkovat čtyři různé fluorescenční proteiny.
Brainbow-2 využívá Cre excizi a inverzi, aby umožnil více možností exprese v daném konstruktu. V jednom úseku DNA se dvěma opačně orientovanými XFP vyvolá Cre náhodnou inverzní událost, která ponechá jeden fluorescenční protein ve správné orientaci pro expresi. Pokud jsou dvě z těchto inverzních sekvencí zarovnány, jsou možné tři různé inverzní události. Pokud se zohlední i excize, bude pro danou kombinaci excizí a inverzí Cre exprimován jeden ze čtyř fluorescenčních proteinů.
Brainbow-3 zachovává formát loxP Brainbow-1, ale nahrazuje geny RFP, YFP a CFP geny mOrange2, EGFP a mKate2. Geny mO2, EGFP a mK2 byly vybrány jednak proto, že se jejich fluorescenční excitační a emisní spektra minimálně překrývají, jednak proto, že mají minimální sekvenční homologii, což umožňuje navrhnout selektivní protilátky, které lze použít k jejich detekci v imunohistochemických protokolech. Brainbow-3 také řeší problém nerovnoměrného naplnění neuronů XFP tím, že používá farnesylované deriváty XFP, které jsou rovnoměrněji transportovány do neuronálních membrán.
Brainbow se realizuje in vivo křížením dvou transgenních kmenů organismů: jednoho, který exprimuje protein Cre, a druhého, který byl transfekován několika verzemi konstruktu loxP/XFP. Použití více kopií transgenu umožňuje kombinovat XFP způsobem, který může dát jednu z přibližně 100 různých barev. Každý neuron je tedy označen jiným odstínem na základě dané kombinatorické a stochastické exprese fluorescenčních proteinů.
Pro objasnění diferenciálních vzorců exprese XFP do viditelné podoby se mozkové řezy zobrazují pomocí konfokální mikroskopie. Při vystavení fotonu s jeho konkrétní excitační vlnovou délkou vyzařuje každý fluorofor signál, který se shromažďuje do červeného, zeleného nebo modrého kanálu, a výsledná kombinace světla se analyzuje pomocí softwaru pro analýzu dat. Superpozice různě zbarvených neuronů umožňuje vizuálně rozklíčovat komplikované nervové obvody.
Brainbow byl dosud testován převážně na myších; výše popsaná základní technika však byla od nástupu původní metody představené v roce 2007 upravena i pro použití v novějších studiích.
MiceEdit
Myší mozek má 75 000 000 neuronů a je podobnější lidskému mozku než drozofila a další běžně používané organismy pro modelování touto technikou, např. elegans. Myši byly prvními organismy, u nichž byla úspěšně použita metoda neurozobrazování Brainbow. Livet et al. (2007) vyvinuli dvě verze myší Brainbow pomocí Brainbow-1 a Brainbow-2, které jsou popsány výše. Při použití těchto metod k vytvoření kompletní mapy a sledování axonů myšího svalu je nutné shromáždit desítky tisíc snímků a sestavit je do stohů, aby vzniklo kompletní schéma. Poté je možné sledovat každý motorický axon a jeho synaptické kontakty a sestavit tak kompletní konektivitu svalu.
Další příklady neuronů zkoumaných technikou Brainbow u transgenních myší se nacházejí v motorickém nervu inervujícím ušní svaly, v axonových drahách v mozkovém kmeni a v dentátovém gyru hipokampu.
DrosophilaEdit
Složitost mozku drozofily, který se skládá z přibližně 100 000 neuronů, z něj činí vynikajícího kandidáta pro zavedení neurofyziologických a neurovědních technik, jako je Brainbow. Stefanie Hampel a další (2011) ve skutečnosti zkombinovali Brainbow ve spojení s nástroji genetického cílení k identifikaci jednotlivých neuronů v mozku drozofily a různých neuronálních linií. Jedním z nástrojů genetického cílení byl binární expresní systém GAL4/UAS, který řídí expresi UAS-Brainbow a cílí expresi na malé skupiny neuronů. Použití metod „Flip Out“ zvýšilo buněčné rozlišení reportérového konstruktu. Exprese fluorescenčních proteinů, stejně jako u původního Brainbow, závisela na rekombinaci Cre odpovídající odpovídajícím loxovým místům. Hampel et al. (2011) rovněž vyvinuli vlastní variantu Brainbow (dBrainbow), založenou spíše na značení epitopů protilátkami než na endogenní fluorescenci. Dvě kopie jejich konstruktu poskytují šest jasných, oddělitelných barev. To jim spolu se zjednodušením přiřazování barev umožnilo pozorovat trajektorie jednotlivých neuronů na velké vzdálenosti. Konkrétně sledovali motorické neurony od tykadlového laloku až po nervosvalové spoje, což jim umožnilo identifikovat specifické svalové cíle jednotlivých neuronů.
Koneckonců tato technika poskytuje možnost účinně mapovat neuronální obvody u drozofily, takže vědci jsou schopni odhalit více informací o struktuře mozku tohoto bezobratlého a o tom, jak souvisí s jeho následným chováním.
.