Cytotoxické a genotoxické účinky acefátu na lidské spermie

Abstrakt

Extenzivní používání organofosforových pesticidů (OP) by mohlo změnit kvalitu spermatu a DNA spermií v různých fázích spermatogeneze. Acefát je vysoce toxický extenzivně používaný OP, a proto jsme se zaměřili na hodnocení účinků acefátu na kvalitu lidského spermatu a integritu DNA spermií. Spermie odebrané zdravým mužům byly vystaveny působení 0, 50, 100 a 200 μg/ml acefátu a inkubovány po dobu 1 h, 2 h a 3 h. Následně byla zkoumána pohyblivost spermií, vitalita, funkční integrita plazmatické membrány, kapacitace spermií a poškození DNA. Výsledek ukázal významný pokles pohyblivosti při dávce 100 μg/ml po 3 h a při dávce 200 μg/ml po 1 h, 2 h a 3 h. Vitalita byla významně snížena při dávce 200 μg/ml po 2 h a 3 h. Funkční integrita byla významně ovlivněna při dávce 100 μg/ml po 3 h a při dávce 200 μg/ml po 2 h a 3 h. Podobně byla významně ovlivněna kapacitace spermií při dávce 200 μg/ml po 1 h, 2 h a 3 h a při dávce 100 μg/ml po 3 h. Poškození DNA bylo významně zvýšeno pouze v dávce 200 μg/ml po 3 h. Studie naznačuje, že expozice acefátu může mít za následek změny struktury a funkce spermií, což přispívá ke zhoršení kvality lidského spermatu vyvolávající neplodnost.

1. Úvod

V posledních několika desetiletích několik studií prokázalo destruktivní reprodukční funkce u zvířat i u lidí v důsledku působení chemických látek vyrobených člověkem a dalších toxických látek . Bohužel poměrně málo studií se systematicky zabývalo vlivem expozice životního prostředí na reprodukční zdraví člověka. Podle nedávných studií trpí každoročně na celém světě neplodností (nepodaří se počít dítě po 12 měsících pravidelného nechráněného pohlavního styku) asi 60-80 milionů párů . Devadesát osm procent případů mužské neplodnosti lze přičíst především nedostatečné kvalitě spermií . Subfertilita však může být považována za idiopatickou a může být důsledkem rizikových faktorů, jako jsou endokrinní disruptory v životním prostředí včetně pesticidů.

Organofosfátové pesticidy jsou estery kyseliny fosforečné a thiofosforečné a jejich toxicita souvisí s jejich schopností inhibovat působení acetylcholinesterázy, což vede k hromadění acetylcholinu v nervových spojích . Mnoho epidemiologických studií rozpoznalo souvislost mezi expozicí organofosfátovým pesticidům (OP) a poruchami reprodukce, jako je neplodnost, vrozené vady, nepříznivé výsledky těhotenství a perinatální úmrtí . Předpokládá se, že organofosfátové pesticidy mění reprodukční funkce tím, že snižují aktivitu mozkové acetylcholinesterázy ovlivňující gonadotropin hypofýzy, což způsobuje neplodnost . Vliv na kvalitu spermatu lze hodnotit pomocí parametrů, jako je koncentrace spermií, procento pohyblivých spermií a procento spermií s normální morfologií spolu s parametry pohybu spermií. Několik studií odhalilo, že muži vystavení OP měli vysoké riziko vzniku abnormálních parametrů spermatu včetně snížené koncentrace spermií, snížené pohyblivosti spermií, sníženého počtu spermií a vyšší aneuploidie pohlavních chromozomů ve spermiích . Studie provedená v Číně s různými OP prokázala jasný vztah mezi přítomností metabolitů insekticidů v moči a koncentrací a pohyblivostí spermií u novomanželů . Studie in vitro provedené s použitím OP poskytly důkazy, že tyto pesticidy mohou poškozovat DNA v lidských spermiích a způsobovat tak genotoxické účinky .

Mezi široce používanými a toxickými OP na Srí Lance je acefát (O,S-dimethyl acetylfosforamidothioát) insekticid, který se díky svým širokospektrálním insekticidním vlastnostem používá v zemědělství a pro domácí účely. Acefát je systémový insekticid s kontaktním a žaludečním účinkem. Toxický mechanismus acefátu se připisuje nejen inhibici acetylcholinesterázy (AchE), ale také působení jako opožděný neurotoxický činitel . Sing a Jiang uvádějí, že acefát je silně neurotoxická, mutagenní, karcinogenní a cytotoxická sloučenina. Podobně Farag a spol. odhalili, že dávky acefátu 14 a 28 mg/kg/den snižují pohyblivost a počet spermií u dospělých myších samců. Další dvě studie potvrdily, že acefát významně snižuje plodnost, dynamiku spermií, hmotnost pohlavních orgánů a pohlavní hormony u samců potkanů albínů . Proto podobně jako u jiných OP existuje potenciální riziko této sloučeniny pro reprodukční zdraví lidí.

Acefát je hojně používán zemědělci na Srí Lance, kteří jsou v nejlepším reprodukčním věku. V posledních dvou až třech desetiletích se ukázalo, že profesní expozice pesticidům by mohla ovlivnit plodnost mužů , což ukazuje na vysoké riziko expozice těchto mladých pěstitelů. Regulace pesticidů je založena hlavně na zvířecích modelech a údaje o expozici lidí a kvalitě spermatu jsou i nadále řídké a omezené. Proto byla tato studie provedena s cílem prozkoumat účinky acefátu na lidskou mužskou plodnost a integritu DNA spermatických buněk in vitro.

2. Materiály a metody

2.1. Účinky acefátu na plodnost a integritu DNA spermatických buněk in vitro. Testovaný materiál

Neformulovaný acefát (obchodní název: Surrender; molekulární vzorec: C4H10NO3PS; molekulová hmotnost: 183,16 g/mol; čistota: 99,0 %; výrobcem doporučené polní dávkování: 1 g acefátu do 1 l vody) byl získán od společnosti Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Srí Lanka. Vzhledem k tomu, že acefát je snadno rozpustný v Biggers Whitten Whittingham (BWW), byl použit jako kontrola

2.2. Odběr a příprava spermatu

Vzorky spermatu byly odebrány od zdravých mužských dárců (ve věku 20-30 let) z University of Sri Jayewardenepura, Srí Lanka, do sterilní nádobky na vzorky. Před odběrem spermatu byl dárcům předán informační list a formulář souhlasu se žádostí o jejich ochotu zúčastnit se studie. Všechny zúčastněné subjekty byly požádány, aby se 3 až 5 dní před odběrem spermatu zdržely jakékoli sexuální aktivity. Do studie byli vybráni muži (průměrný věk ) s normální koncentrací spermií, pohyblivostí, morfologií, viskozitou, dobou zkapalnění a pH a s absencí nezralých forem a leukocytů. Parametry spermií (pohyblivost, vitalita, test hypoosmotického bobtnání a morfologie) byly hodnoceny v souladu s pokyny Světové zdravotnické organizace . Vzhledem k tomu, že účinky acefátu by se mohly u abnormálních spermií zesílit, je důležité vybrat pro studii dárce s přijatelnou kvalitou spermií.

Etický souhlas (Ethical clearance ref. nnumber: 712/13) byl získán od Ethics Review Committee, Faculty of Medical Sciences, University of Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Srí Lanka.

2.3. Dárci s přijatelnou kvalitou spermií. Stanovení dávkových hladin

Pro stanovení dávkových hladin byla provedena analýza hodnoty LD50 acefátu pro pohyblivost spermií. Proto byl připraven vzorek s 1 mg acefátu v 1 ml BWW, což odpovídá doporučené polní dávce (1 g acefátu do 1 l vody) acefátu. Připravené vzorky byly následně zředěny BWW, aby se získaly různé koncentrace acefátu. Suspenze spermií (stanovené na 50 × 106 spermií/ml) byly umístěny do Eppendorfových zkumavek a byl přidán požadovaný objem buď BWW, nebo testovacího roztoku (konečný objem zkumavky je roven 1 ml). Vzorky byly důkladně promíchány a poté inkubovány 1 h ve zvlhčeném inkubátoru (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokio, Japonsko) při 37 °C a 5 % CO2. Po inkubaci byla stanovena procentuální pohyblivost spermií při každé koncentraci dvěma nezávislými pozorovateli pod mikroskopem Olympus s fázově kontrastní optikou (X 400; Olympus Corporation, Japonsko). Na základě tohoto pilotního průzkumu za účelem stanovení indikací toxických dávek pro vzorky spermatu bylo zjištěno, že hodnota LD50 pro acefát je 200 μg/ml. Proto byly v této studii použity subletální koncentrace nižší než LD50 včetně hodnoty LD50.

Níže jsou uvedeny vybrané úrovně dávek pro tuto studii: Vysoká dávka: 200 μg/ml (odpovídá hodnotě LD50). Střední dávka: 100 μg/ml. Nízká dávka: 50 μg/ml.

Dále jsme se rozhodli rozšířit časové body z 1 h na 2 h a 3 h, abychom zjistili prodloužené účinky expozice acefátu.

2.4. Délka trvání expozice acefátu: 1 hodina. Inkubace s pesticidy

Čerstvé vzorky spermatu () byly zředěny s BWW, aby se dosáhlo konečné koncentrace spermií 40 × 106 spermií/ml. Následně byly vzorky inkubovány buď s pesticidem o koncentraci 50, 100 a 200 μg/ml, nebo s BWW. Inkubace probíhaly v 1 ml konečného objemu po dobu 1, 2 a 3 h při 37 °C v inkubátoru (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokio, Japonsko) v atmosféře 5 % CO2 a 95 % O2.

2,5. Stanovení pohyblivosti spermií

Celkový počet pohyblivých spermií byl odhadnut (přibližně 100 buněk) dvěma nezávislými pozorovateli pod fázově kontrastní optikou (X 400; Olympus Corporation, Japonsko). Bylo vypočteno procento dopředné pohyblivosti

2,6. Test cytotoxicity

Životaschopnost spermií byla hodnocena pomocí techniky barvení Eosin Y a byly vypočteny mrtvé a živé spermie. Procento životaschopnosti = (celkový počet buněk – počet obarvených/celkový počet buněk) × 100. Celkový počet buněk = 100.

2,7. Stanovení funkční integrity plazmatické membrány spermií

Funkční integrita plazmatické membrány spermií byla hodnocena pomocí testu Hypoosmotic Swelling (HOS) popsaného Jeyendranem a kol. V každém preparátu bylo spočítáno nejméně 100 spermií

2.8. Stanovení kapacity

Alikvot 150 μl média BWW byl umístěn do předehřáté kultivační misky (35 × 10 mm, Corning, New York, USA) a přikryt předehřátým krycím sklíčkem 22 × 22 mm. Do rohu krycího sklíčka byl přidán alikvotní podíl 20 μl vzorku spermatu. Kultivační miska byla umístěna do inverzního mikroskopu (Diaphot, Nikon, Londýn, Spojené království) vybaveného termostatem řízenou skříní s ohřevem vzduchu (Nikon, Londýn, Spojené království), který byl ekvilibrován na 37 °C. Stav kapacitace spermií byl hodnocen na základě hyperaktivace objektivní fotografickou metodou pomocí mikroskopu Olympus IX71 s fázovým kontrastem. Vzhledem k tomu, že hyperaktivace je bičíkový jev, je možné vizuálně posoudit hyperaktivaci na základě pohyblivosti spermií; vzory pohybu bičíků byly hodnoceny pro výčet nehyperaktivovaných a hyperaktivovaných spermií . Pokusy byly prováděny ve dvou opakováních a čtyřikrát nezávisle na sobě opakovány.

2.9. Stanovení poškození DNA u spermií

Na očištěná mikroskopická sklíčka byly připraveny nátěry spermií a procento spermií s normální DNA bylo stanoveno spočítáním 500 spermií pod fluorescenčním mikroskopem (BH-2, Olympus Ltd., Japonsko) s excitací 490 nm. Doba pozorování jednoho pole trvala méně než 40-50 s. Spermie vykazující žlutou až červenou barvu byly hodnoceny jako denaturovaná DNA a spermie vykazující zelenou barvu byly hodnoceny jako normální DNA .

2.10. Statistická analýza

Počty spermií dospělých samců byly normálně rozděleny a byly porovnány mezi skupinami pomocí dvoucestné analýzy rozptylu (ANOVA) s použitím softwarového balíku Minitab (Minitab Co., USA) pro hlavní účinek pesticidů. Tam, kde byl zjištěn významný vliv ošetření, byly rozdíly mezi průměry jednotlivých skupin testovány metodou „Tukey 95 %“. Údaje jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). hodnota byla stanovena na .

3. Výsledky

3.1. Motilita spermií

V porovnání s kontrolou se procento motility významně () snížilo (tabulka 1) u střední dávky (100 μg/ml) o 16 % po 3 hodinách inkubace. Naopak vysoce významné () snížení bylo zaznamenáno u 200 μg/ml po 1 h, 2 h a 3 h inkubace ve srovnání s kontrolou. Dále je zřejmé snížení motility v každé dávce s rostoucí dobou inkubace.

3.2. Cytotoxicita

Procento životaschopnosti se časem snížilo (tabulka 1) u všech ošetřených skupin, ale významné snížení (o 20 %; ) bylo zaznamenáno u 200 μg/ml (vysoká dávka) po 2 h po inkubaci ve srovnání s kontrolami. Vysoce významné () snížení bylo zaznamenáno u vysoké dávky po 3 h inkubace a bylo sníženo o 31 % v porovnání s kontrolou.

3.3. V případě vysoké dávky po 3 h inkubace byl zaznamenán pokles o 31 %. Funkční integrita plazmatické membrány spermií

Tabulka 1 zobrazuje výsledky funkční integrity spermií po 1 h, 2 h a 3 h inkubace. Významné snížení () funkční integrity bylo zaznamenáno u střední dávky o 13.5 % po 3 h a také ve vysoké dávce o 26 % po 2 h inkubace ve srovnání s jejich kontrolami. Vysoce významné () snížení bylo zaznamenáno u vysoké dávky (o 35 %) po 3 h inkubace.

3.4. Kapacita spermií

Snížení počtu kapacitovaných spermií bylo pozorováno u všech ošetřovaných skupin (tabulka 1). Procento kapacitovaných spermií bylo významně sníženo () u dávky 100 μg/ml o 18 % po 3 hodinách inkubace a u vysokých dávek o 32 %, 36 % a 38 % po 1 hodině, 2 hodinách, resp. 3 hodinách inkubace.

3.5. Poškození DNA u spermií

Počet spermií s poškozenou DNA se zvyšoval s rostoucí dávkou a dobou inkubace. Významné () zvýšení poškození DNA však bylo zaznamenáno pouze při vysokém dávkování (o 33 %) po 3 h inkubace. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

4. Diskuse

Insekticidy s obsahem OP jsou na Srí Lance hojně používány s malou nebo žádnou ochranou uživatelů a jedinci jsou tak vystaveni vysokému riziku expozice. Navíc jsou tito zemědělci v nejlepším reprodukčním věku nevyhnutelně exponováni po dlouhou dobu. Cílem této studie bylo prokázat souvislost mezi acefátem, OP s kvalitou spermatu a poškozením DNA ve spermiích během různých inkubačních časů. Výsledky získané z této studie ukázaly, že acefát zhoršuje pohyblivost spermií, jejich životaschopnost, membránovou integritu a kapacitu spermií a vyvolává poškození DNA in vitro. Podobné výsledky byly získány u chlorovaných uhlovodíků , organofosfátů a metabolitů benzenu .

Významné snížení pohyblivosti spermií pozorované u středních (100 μg/ml) i vysokých (200 μg/ml) dávek acefátu by mohlo vést ke zhoršení oplozovací schopnosti spermií . Po 3hodinové expozici nejvyšší dávce bylo procento pohyblivosti spermií sníženo pod hodnoty doporučené WHO. Pohyblivost spermií je považována za jeden z nejcitlivějších detektorů cytotoxických účinků na spermie a snížení oplozovací schopnosti spermií. Změny mitochondriálního membránového potenciálu způsobené různými pesticidy by mohly vést ke snížení pohyblivosti spermií . Pohyblivost spermií závisí také na intenzivní přeměně a energetickém výdeji, které vznikají prostřednictvím oxidačních drah v mitochondriích, a pesticidy by mohly zasahovat do oxidačních drah, což by vedlo ke zpoždění pohyblivosti spermií, případně k buněčné smrti . Kromě toho by metabolity pesticidů mohly zasahovat do mitochondriálních oxidačních reakcí, což by vedlo k produkci nadbytečných reaktivních forem kyslíku (ROS) snižujících produkci ATP, což by mělo za následek zhoršení motility . Uvádí se, že oxidativní stres je hlavním mechanismem toxicity organofosfátů včetně acefátu. Ztráta integrity může vést ke zvýšení propustnosti membrán a ztrátě schopnosti regulovat intracelulární koncentrace iontů, které se podílejí na řízení pohybu spermií . Celkový účinek poškození membrány může být zodpovědný za neustálý pokles pohyblivosti a životaschopnosti spermií po ejakulaci .

Životaschopnost je podíl živých spermií stanovený na základě hodnocení buněčné a nebo membránové integrity . Test barvení eosinem poskytl informace o strukturální integritě membrány spermií, zatímco test HOS poskytl informace o funkční integritě membrány spermií . Životaschopnost spermií je spojena s neporušenými, funkčními a semipermeabilními plazmatickými membránami . Pesticidy by mohly vyvolat vzestup vápenatých iontů způsobující poškození membrán spermií, a tím ovlivnit jejich životaschopnost dlouho předtím, než se dostanou do oocytu . Změny v plazmatické membráně pozorované v této studii by mohly mít za následek snížení pohyblivosti, životaschopnosti a integrity membrán spermií .

Hyperaktivace je známkou dokončení kapacitace spermií a je nezbytná pro průnik kumulární hmotou a zona pellucida . V této studii bylo prokázáno, že hyperaktivované spermie klesají ve vysoké koncentraci a snižují se s prodlužující se dobou inkubace, což svědčí o zhoršené kapacitaci spermií. Membrána a mitochondrie spermií jsou nezbytné pro napájení hyperaktivace a jakékoli poškození membrány a mitochondrií spermií může vést ke snížení počtu kapacitovaných spermií . Je známo, že OP zhoršuje kapacitaci prostřednictvím inhibice AchE při inkubaci se spermiemi in vitro . Nicméně po přidání dostatečného množství AchE nebo enzymů napodobujících AchE do média byl tento účinek zvrácen , což ukazuje na důležitost aktivity AchE membrány spermií pro zahájení kapacitace.

Předkládaná studie odhaluje významné poškození dvouvláknové DNA při nejvyšší dávce (200 μg/ml) po 3 hodinách inkubace. Integrita DNA spermií je životně důležitá pro přenos genetické informace během reprodukce a jakékoli poškození DNA by mohlo vést k neplodnosti . Báze DNA a fosfodiesterové páteře jsou obzvláště náchylné k poškození vyvolanému oxidačním stresem, protože jejich plazmatické membrány obsahují velké množství polynenasycených mastných kyselin a jejich cytoplazma obsahuje nízké koncentrace enzymů odstraňujících škodliviny . Proto by vysoké hladiny ROS mohly vést k dvouřetězcovým zlomům DNA, které jsou běžně pozorovány ve spermiích neplodných mužů . Bylo zaznamenáno, že acefát výrazně zvyšuje buněčné reaktivní formy kyslíku (ROS), což vede k modifikacím DNA tvorbou chyb v párech bází a řetězových zlomů . Spermie s fragmentovanou DNA jsou méně pohyblivé a méně náchylné k hypoosmotickému bobtnání, což svědčí o nižší funkční integritě membrány spermií a vede tak ke snížení funkce spermií s rostoucím poškozením DNA . Pesticidy vyvolávající poškození DNA v leukocytech by mohly vést také k poškození DNA ve spermiích .

5. Závěry

Předkládaná studie naznačuje možné poškození funkce spermií při expozici acefátu. Vysoká koncentrace acefátu (200 μg/ml, což odpovídá LD50) testovaná v této studii změnila pohyblivost lidských spermií, životaschopnost, funkční integritu plazmatické membrány a kapacitu spermií a vyvolala poškození DNA in vitro. Po zvážení výsledků a přirozených lidských biologických reakcí, jako je odbourávání a clearance chemických látek, lze doporučit, že testované vyšší dávky (200 μg/ml) a vyšší mohou způsobit riziko pro lidské zdraví.

Zkratky

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Hypoosmotický roztok
NaCl:	Chlorid sodný
OP:	Organofosfátový pesticid
ROS:	Reaktivní formy kyslíku.

Etické schválení

Etické schválení bylo získáno od etické kontrolní komise, Faculty of Medical Sciences, University of Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Srí Lanka. Číslo etického schválení je 712/13.

Konflikty zájmů

Autoři neprohlašují žádné konflikty zájmů týkající se publikace tohoto článku.

Poděkování

Velmi si vážíme neocenitelné pomoci, kterou nám poskytla profesorka Neelika Malavige z Katedry mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Sri Jayewardenepura za poskytnutí inkubátoru s oxidem uhličitým a Katedra zoologie Přírodovědecké fakulty Univerzity v Kolombu za poskytnutí chemikálií pro tento projekt.

Poděkování za pomoc při realizaci projektu.