ABTS
17.4 Phenoler
Oxidation af det klassiske Lac-substrat ABTS med laccase fra Tetracystis aeria er udbredt i klorofyceane alger. For eksempel udskiller arter af Moewusinia-arter, herunder Chlamydomonas moewusii og T. aeria, formodede “ægte” Lacs. Phenoliske substrater oxideres af disse enzymer optimalt ved neutral til alkalisk pH. Tetracystis laccase omdanner effektivt andre forbindelser som f.eks. bisphenol A, 17α-ethinylestradiol, nonylphenol og triclosan i tilstedeværelse af ABTS som redoxmediator, mens anthracen, veratrylalkohol og adlerol forbliver uændret. Eventuelle naturlige funktioner af enzymerne, såsom syntese af komplekse polymerer eller afgiftningsprocesser, kan hjælpe algerne med at overleve i ugunstige miljøer. I forurenet overfladevand kan Lac-producerende grønalger bidrage til miljøets nedbrydning af phenolforurenende stoffer.
Putativ Lac (CotA) fra Bacillus pumilus MK001 klonet og udtrykt i E. coli viste sig at være termostabil med en halveringstid på 60 minutter ved 80 °C og viser potentiel bindingsaffinitet med ferulinsyre, koffeinsyre og vanillin .
Phenoler er kendte inhibitorer for cellulase og fermentative mikroorganismer i bioraffineringsprocesser. Tilsætning af Lac fjerner fenolforbindelserne og reducerer efterfølgende forsinkelsesfasen for den fermenterende mikroorganisme. Anvendelsen af Lac mindsker imidlertid glukosefrigivelsen under den enzymatiske hydrolyse. Andelen af lignin og sammensætningen af phenoler er nøgleaktører i inhiberingen af cellulase, når den enzymatiske hydrolyse kombineres med Lac-afgiftning .
En interessant anvendelse inden for miljøbioteknologi er immobilisering af Lac for at fjerne phenolforurenende stoffer via oxidation. Nanopartikler af pyrogen silica har et interessant potentiale som støttemateriale til immobilisering af Lac via sorptionsassisteret immobilisering med henblik på anvendelser som f.eks. eliminering af mikroforurenende stoffer i vandige faser. Immobilisering af Lac fra en Leviathan-slægt, Coriolopsis polygonal, Cerrena unicolor, P. ostreatus og T. versicolor på nanopartikler af pyrogen silica, separat eller i kombination, giver en øget aktivitet over et pH-område mellem 3 og 7. De forskellige Lacs adskiller sig fra hinanden i deres pH-optima og substrataffinitet. Udnyttelsen af deres forskelle gjorde det muligt at formulere en skræddersyet nanobiokatalysator, der er i stand til at oxidere et bredere substratområde end de opløste eller separat immobiliserede enzymer. Nanobiokatalysatoren har potentiale til biokemisk oxidation med henblik på at fjerne flere forurenende stoffer. Det er blevet bekræftet, at ikke-vokationelle nanobiokatalysatorer, der er fremstillet ved Lac-immobilisering på silica-nanopartikler, har et bredt substratspektrum med hensyn til nedbrydning af genstridige forurenende stoffer som f.eks. phenoliske EDC’er (bisphenol A) .Dette understreger potentialet af kompositter af nanopartikler af pyrogen silica/laccase til avanceret biologisk spildevandsrensning.
Lacs er i stand til at katalysere en-elektron oxidation af phenolforbindelser til radikale mellemprodukter, der efterfølgende kan koble sig til hinanden via kovalente bindinger. Disse reaktioner menes at spille en vigtig rolle i humificeringsprocessen og i omdannelsen af forurenende stoffer, der indeholder phenoliske funktionaliteter i miljøet. Der blev udviklet en reaktionsmodel ved integration af metal-HA-bindingsligevægte og kinetiske ligninger, som forudsiger omdannelseshastigheden for triclosan i tilstedeværelse af HA og tosidige metalioner, herunder Ca2+, Mg2+, Cd2+, Co2+, Mn2+, Ba2+ og Zn2+ .
Hydroxylerede polybromerede diphenylethere (OH-PBDE’er) er ofte blevet fundet i den marine biosfære som nye organiske forurenende stoffer. Produktionen af OH-PBDE’er er sandsynligvis et resultat af kobling af bromphenoxiradikaler, der genereres fra den Lac-katalyserede oxidation af 2,4-DBP eller 2,4,6-TBP. Omdannelsen af bromfenoler ved Lac er pH-afhængig og påvirkes også af enzymatisk aktivitet. I betragtning af den store forekomst af 2,4-DBP og 2,4,6-TBP og den fylogenetiske fordeling af Lac i miljøet kan Lac-katalyseret omdannelse af bromophenoler potentielt være en vigtig rute for den naturlige biosyntese af OH-PBDE’er .
Phanerochaete chrysosporium tilhører en gruppe af ligninnedbrydende svampe, der udskiller forskellige oxidoreducerende enzymer, herunder ligninperoxidase (LiP) og manganperoxidase (MnP). Produktionen af Lacs i denne svamp er imidlertid ikke blevet fuldstændig påvist og er fortsat kontroversiel. Samekspression af LacIIIb-genet fra T. versicolor og vpl2-genet fra Pleurotus eryngii samt de endogene gener mnp1 og lipH8 forbedrede samekspressionen af peroxidaser og laccaser op til fem gange i forhold til vildtyperne. Transformantstammer har et bredt spektrum af phenol-/nonphenolbiotransformation og en høj procentdel af affarvning af syntetiske farvestoffer i sammenligning med forældrestammen og er en nem og effektiv coekspression af Lacs og peroxidaser i egnede basidiomycete-arter .
For nylig er Lac blevet anvendt til nanobioteknologi, som er et stigende forskningsområde, og katalyserer elektronoverførselsreaktioner uden yderligere kofaktorer .
Kulstofnanopartikler er lovende kandidater til enzymimmobilisering. Sammenlignet med frie Lac har de immobiliserede enzymer betydeligt reducerede reaktionshastigheder. Diffusionsbegrænsning induceret af aggregering af kulstofnanopartikler kan ikke ignoreres, fordi det kan føre til øget reaktionstid, lav effektivitet og høje økonomiske omkostninger. Desuden forværres dette problem, når der er lave koncentrationer af miljøforurenende stoffer til stede.
Bisphenol A (BPA) er et hormonforstyrrende kemikalie, som er allestedsnærværende i miljøet på grund af dets brede industrielle anvendelse. Ekstracellulær Lac fra den mest dyrkede svamp i verden (dvs. hvid-rød svamp, P. ostreatus) nedbryder effektivt BPA. Eksponering for BPA har ingen skadelige virkninger på denne spiselige svamp.
Fjernelse af BPA ved hjælp af Lac i en kontinuerlig enzymatisk membranreaktor, der blev vurderet i syntetisk og reelt biologisk behandlet spildevand i en reaktorkonfiguration baseret på en omrørt tankreaktor koblet til en keramisk membran, viste næsten fuldstændig fjernelse af BPA. Polymerisation og nedbrydning er sandsynlige mekanismer for BPA-transformation ved hjælp af Lac.
Organismer fra stamme Basidiomycota har et enormt potentiale for bioremediering ved hjælp af deres phenoloxidaser i forbindelse med nedbrydning af phenoler. Lac og tyrosinase findes hovedsagelig i henholdsvis T. versicolor og Agaricus bisporus. Der er opstået nye lovende wildtypeproducenter af enzymer, og der er også konstrueret en række rekombinante stammer, som hovedsagelig er baseret på gær eller Aspergillus-stammer som værter. Konstrukterne gør det muligt at anvende dem til nedbrydning af phenoler, polyfenoler, kresoler, alkylphenoler, naphtholer, bisphenoler og halogenerede (bis)phenoler. Biologiske og fysisk-kemiske metoder kan kombineres for at gøre processerne egnede til industriel brug.
Planternes peroxidaser har et stort potentiale til at blive anvendt til dekontaminering af phenolforurenet spildevand. Anvendelse i stor skala af disse enzymer til rensning af phenolforurening kræver billigt, rigeligt og let tilgængeligt peroxidaseholdigt materiale. Kartoffelpulp, et affaldsprodukt fra stivelsesindustrien, indeholder store mængder aktive peroxidaser, og kartoffelpulpenzymerne bevarer deres aktivitet ved pH 4-8 og er stabile over et bredt temperaturområde. Phenolfjernelseeffektiviteten af kartoffelpulp er over 95 % .
Immobiliseret Lac på nanoporøse siliciumdioxidperler nedbryder mere end 90 % af 2,4-dinitrophenol på kort tid (12 timer). Immobiliseringsprocessen forbedrer Lac’s aktivitet og bæredygtighed med hensyn til nedbrydning af det forurenende stof. Temperaturer over 50 °C reducerer enzymaktiviteten til ca. 60 %. pH og mediatorkoncentrationen kunne dog ikke påvirke enzymaktiviteten. Nedbrydningskinetikken er i overensstemmelse med en Michaelis-Menten-ligning .
Vandige exudater af rajgræs (Lolium perenne) kan nedbryde BPA både i fravær og i tilstedeværelse af naturligt organisk materiale (NOM). I exudater med tilsætning af NOM er nedbrydningsprocessen længere end uden NOM. Peroxidase- og Lac-aktiviteter i exudater tyder på, at disse enzymer er væsentligt involveret i BPA-nedbrydningen.
Organofluorforbindelser er blevet vigtige byggesten til en bred vifte af avancerede materialer, polymerer, agrokemikalier og lægemidler. Konceptet for introduktion af trifluormethylgruppen i ubeskyttede phenoler ved hjælp af en biokatalysator (Lac), tBuOOH og enten Langlois’ reagens eller Barans zinksulfinat blev opnået. Metoden er baseret på rekombination af to radikale arter, nemlig phenolradikalkationen, der genereres direkte af Lac, og CF3-radikalet. Den Lac-katalyserede trifluormethylering foregår under milde forhold og nedbryder trifluormethylsubstituerede phenoler, som ikke var tilgængelige med klassiske metoder .
Lac-producerende ferskvandsascomycet Phoma sp. stamme UHHH 5-1-03 har potentiale til praktisk fjernelse af mikroforurenende stoffer. Bisphenol A (BPA), carbamazepin (CBZ), 17α-ethinylestradiol (EE2), diclofenac (DF), sulfamethoxazol (SMX), teknisk nonylphenol (t-NP) og triclosan (TCS) er substrater med rangordenen: EE2≫BPA>TCS>t-NP>DF>SMX>CBZ. De opnåede metabolitter indikerer hydroxylerings-, cykliserings- og decarboxyleringsreaktioner samt oxidativ kobling, der er typisk for Lac-reaktioner. Observationerne tyder stærkt på, at den ekstracellulære Lac fra Phoma sp. i høj grad bidrager til svampebiotransformation .
Der er blevet lagt øget vægt på nanobiokatalyse. Lac reversibelt immobiliseret på Cu(ΙΙ)- og Mn(ΙΙ)-chelaterede magnetiske mikrosfærer var vellykket i fjernelse af BPA fra vand. I sammenligning med fri Lac er den termiske og opbevaringsmæssige stabilitet af immobiliseret Lac væsentligt forbedret. Mere end 85 % af BPA blev fjernet under optimale betingelser.
Det er imidlertid begrænset, at enzymer i opløsning til vandbehandling ikke kan genbruges, at enzymernes levetid er kort, og at omkostningerne ved engangsbrug er høje. Chen et al. udviklede en ny type biokatalysator ved at immobilisere svampelak på overfladen af gærceller ved hjælp af syntetisk biologiske teknikker. Biokatalysatoren kaldes Surface Display Lac (SDL) og kan genbruges med høj stabilitet, da den bevarede 74 % af den oprindelige aktivitet efter otte gentagne batchreaktioner. SDL’s effektivitet og bevis for konceptet i forbindelse med behandling af forurenende stoffer, der giver anledning til nye problemer, blev påvist med bisphenol A og sulfamethoxazol.