ADAR

C Enzym-substratgenkendelse

Det vides kun lidt om, hvordan ADAR’er interagerer med deres specifikke substrater, og hvordan de RNA-bindingsdomæner og det katalytiske domæne arbejder sammen under redigeringsreaktionen. I modsætning til C-to-U RNA-redigeringsmaskineriet, der anvender et primært sekvensmotiv tæt på redigeringsstedet som kritisk determinant for substratgenkendelse (Niswender, 1998), mangler ADAR-enzymerne enhver tilsyneladende iboende sekvensspecificitet. Faktisk vil ADAR1 såvel som ADAR2, når de præsenteres for fuldstændigt dobbeltstrengede RNA-molekyler, deaminere næsten promiskuøst op til 50-60 % af alle adenosiner i sekvensen (Nishikura, 2010). Imidlertid øger tilstedeværelsen af loops, mismatches og buler i en RNA-substratstruktur stedsselektiviteten, og som det ses for nogle fysiologiske ADAR-mål, synes den indviklede RNA-foldning af et sådant substrat at begrænse adgangen til binding på RNA’et og produktiv katalyse ofte til et enkelt adenosin (Nishikura, 2010). Derfor kan det meste af målspecificiteten af A-to-I-redigering være bosat i substratets tredimensionelle fold. Nylige NMR-baserede strukturelle undersøgelser af ADAR-proteinets RNA-bindingsdomæner i kompleks med minimale RNA-substrater tyder imidlertid på, at individuelle dsRNA-bindingsdomæner også kan være involveret i sekvensspecifikke kontakter, der kan bidrage til selektivitet for visse RNA-mål i forhold til andre (Stefl et al, 2006, 2011).

En anden egenskab ved ADAR’er, der kan have betydning for substratgenkendelse og interaktion, er erkendelsen af, at for produktiv og højaktiv deaminering danner ADAR-proteinerne en dimer på substratet (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potentielt kan der dannes homo- såvel som heterodimere mellem ADAR-proteiner (Chilibeck et al., 2006) og repræsenterer derfor endnu et lag af regulering, der påvirker den substratspecifikke genkendelse såvel som RNA-redigeringsaktiviteten. Da der til dato ikke er noget kendt redigeringsmål for ADAR3, og dette protein ikke udviser nogen enzymatisk aktivitet i standard deaminaseassays (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), er dets rolle blevet foreslået at være af regulerende karakter gennem heterodimerisering med de andre ADAR’er.

I forbindelse med dannelsen af ADAR-dimere til generel redigeringsaktivitet er det observeret, at visse RNA-redigeringsbegivenheder, der forekommer inden for det samme substrat, udviser positiv eller negativ kobling. For eksempel viser adenosiner, der er direkte naboer til hinanden eller dem, der er placeret på samme side af RNA-duplexstrukturen (ca. 11 nt afstand inden for A-form RNA), ofte kobling ved redigering af ADAR’er, sandsynligvis på grund af deres nærhed til enzymets katalytiske sted i rummet (Koeris et al., 2005; Enstero et al., 2009).

Trods disse indsigter er det stadig ikke muligt i øjeblikket at forudsige et RNA-redigeringssted baseret på RNA-primær sekvens. Dette skyldes hovedsagelig den komplekse karakter af RNA-tertiærstrukturer og deres dynamiske adfærd. Selv når man tager i betragtning, at dsRNA-bindingsdomæner kan være i stand til at skelne mellem visse primære sekvensmotiver frem for andre, kan små ændringer i den omgivende primære sekvens eller sekundære og tertiære struktur modulere eller endog tilsidesætte de sekvensspecifikke kontakter. Som følge heraf har forsøg på at udvikle søgealgoritmer, der kombinerer flere af de molekylære egenskaber (herunder sandsynlighed for baseparring, sekvensmiljø, sekvensbevaring), som vides at påvirke redigeringssandsynligheden eller -aktiviteten med henblik på at forudsige potentielle redigeringssteder, resulteret i lange lister over kandidatpositioner i mRNA’er, men kun få nye, stedsselektive og højniveau-modifikationssteder er blevet valideret som bona fide in vivo-mål (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie og Maas, 2009). Dikotomien mellem påvisningen af tusindvis af sandsynlige redigeringssteder baseret på molekylære træk i pre-mRNA’er og den ringe forekomst af omkodningssteder på højt niveau tyder på, at enten lider forudsigelsesalgoritmerne af en høj falsk positiv rate, og at de fleste af disse kandidatpositioner ikke redigeres af ADAR’er, eller at den eksperimentelle påvisning af RNA-redigering er problemet, og for mange virkelige redigeringssteder testes de forkerte væv (celletypespecifik redigering), eller de testes på det forkerte tidspunkt (reguleret redigering). Alternativt er in vivo-redigeringsniveauerne for de fleste af stederne så små, at de nuværende detektionsmetoder ikke er følsomme nok til at bevise eller afkræfte redigering.