Adenylylcyklase

• 1 Funktion
• 2 Indledning
  • 2.1 Cyklisk adenosinmonofosfat
  • 2.2 Pyrofosfat
• 3 Adenylylcyklase fra pattedyr
  • 3.1 Type II
    • 3.1.1 Struktur
    • 3.1.2 Overekspressionsforstyrrelser

4 Rv1264 Adenylylcyklase

• 4.1 Struktur
  • 4.1.1 C-Terminalt katalytisk domæne
    • 4.1.1.1.1.1 α1-switch
  • 4.1.2 N-Terminalt regulerende domæne
    • 4.1.2.2.1 αN10-switch
• 4.2 Regulering ved pH
• 4.3 Biologisk rolle

5 3D-strukturer af adenylylcyclase

Funktion

Adenylylcyclase (ADCY, EC-nummer 4.6.1.1.1), også kendt som adenylatcyclase, er et enzym, der katalyserer cykliseringen af til . Den sker i et enkelt, samordnet trin, hvor ilten på ATP’s 3′-hydroxylgruppe nukleofilt angriber alfa-fosfatet og danner en fosfodiesterbinding og spalter en pyrofosfatgruppe. I de fleste aktive steder er der en sur rest i nærheden af 3’OH, som fungerer ved deprotoneringen, og basiske rester ved β-fosforen for at sænke gruppens energi til spaltning. Reaktanten i den reaktion, der katalyseres af adenylylcyklase, er ATP; ATP er det hyppigst forekommende nukleotidtrifosfat i de fleste celler med typiske koncentrationer på mellem 1 og 10 mM. Denne høje intracellulære koncentration gør det muligt for cAMP-koncentrationerne at stige hurtigt som reaktion på et specifikt signal, hvilket er vigtigt i mange signaltransduktions- og metaboliske veje. Hovedproduktet af denne reaktion er cAMP, med et biprodukt af PPi. De cytoplasmatiske regioner af ADCY består af dens N-terminale, C1a, C1b, C2a og C2b. C1a og C2a udgør det katalytiske domæne. Denne side lægger vægt på den mikrobielle adenylylcyklase Rv1264, men pattedyrs adenylylcyklaser er også dækket i mindre detaljer.

Adenylylcyklase-associeret protein (CAP) regulerer aktincytoskelettet og celleadhæsion i alle eukaryoter.

For calmodulin-følsom adenylatcyklase se Anthrax edema factor.

Indledning

Der findes ti isozymer af adenylylcyklaser hos pattedyr, adenylylcyklase type I-X, (ADCY I-X), og mange flere hos andre organismer. Alle pattedyr og de fleste andre adenylylcyklasser tilhører klasse III; de fleste er integrale membranproteiner, og alle producerer cAMP, hvis evne kan aktiveres eller inaktiveres som reaktion på bestemte forhold eller ligander. Alle membranbundne adenylylcyklasser fra pattedyr aktiveres af alfa-underenheder af G-proteiner, men reagerer forskelligt på ligander som f.eks. magnesiumioner, calciumioner og beta-gamma-underenheder af G-proteiner. En af pattedyrenes isozymer og nogle prokaryote former af adenylylcyklase reagerer på miljøforhold, primært pH.

Cyklisk adenosinmonofosfat

I pattedyr fungerer cAMP som et sekundært budbringer, og en af dets funktioner er at kontrollere aktiviteten af proteinkinase A (PKA). Til gengæld har PKA ganske forskellige roller i cellerne, mens de fleste af dem er forbundet med metabolisme, spiller PKA også vigtige roller i transkription, cellecyklus og apoptose. Den endelige skæbne for cAMP er dets omdannelse til AMP ved spaltning af phosphodiesterbindingen af 3′, 5′-cyklisk adenosinmonofosfatphosphodiesterase.

Pyrofosfat

Spaltning af biproduktet af denne reaktion, PPi, af pyrofosfatase giver to molekyler uorganisk fosfat (Pi). ATP-syntase kan reinkorporere dette uorganiske fosfat til adenindiphosphat (ADP) for at fremstille ATP ved hjælp af energi i protonmotivationskraften.

Pattedyrs adenylylcyklase

Der findes ti isozymer af adenylylcyklaser hos pattedyr, adenylylcyklase type I-X, (ADCY I-X); hos pattedyr spiller adenylylcyklase en vigtig rolle i signaltransduktionsveje, hvor cAMP er en sekundær budbringer.

ADCY I-IX har alle en generel struktur; de består af to transmembranregioner (M1, M2), som består af seks membranoverskridende helikser og har til funktion at holde enzymet forankret i membranen, og to cytoplasmatiske regioner (C1, C2), som kan underopdeles yderligere (C1a, C1b, C2a, C2b) og er ansvarlige for al katalytisk aktivitet og regulering af G-proteiner og forskolin. I opløsning kan C1a- og C2a-domænerne danne heterodimere med hinanden, enten i det samme eller forskellige enzymer, eller de kan danne homodimere med deres identiske enheder på forskellige enzymer. C1b-domænet er meget stort (≈15 kDa) med mange reguleringssteder og har en variabel struktur på tværs af isozymer; mens C2b-domænet er næsten ikke-eksisterende i mange isozymer og endnu ikke har været forbundet med en bestemt funktion.

Type II

Struktur

En monomer af C2-domænet af har et indre, hydrofobt, antiparallelt omgivet af flere, amfipatiske , bortset fra et område, som var nødvendigt for at danne en homodimer med et andet C2-domæne. To monomerer af C2-domæner af type II adenylylcyklase bindes sammen i opløsning for at danne en , som er nødvendig for den katalytiske omdannelse af ATP til cAMP og PPi. Når de er bundet, skaber de en dyb spalte, der spænder over midten af deres bindingssted; denne spalte er velegnet til at binde to molekyler i dens ender. Der er stærke hydrogenbindinger mellem forskolins oxygenatomer og den omgivende peptidrygge, og resten af interaktionerne er meget hydrofobiske, da forskolinbindingsstedet indeholder ti alifatiske og aromatiske rester. Denne binding af forskolin skaber en hydrofob binding mellem monomerne, som hver især har to forskellige hydrofobiske overflader, der binder forskolin; og det er denne interaktion, der gør homodimeren stabil. Forskolinen interagerer også med og placerer Asn 1025 korrekt, hvilket er afgørende for den katalytiske aktivitet, og det kan endda interagere direkte med ATP. Dette homodimer-forskolin-kompleks kan yderligere aktiveres som reaktion på et signal via binding til en G-proteins βγ-underenhed . Denne βγ-underenhed binder sig til som udgør en del af en α-helix på det yderste lag af komplekset.

Den af denne homodimer er placeret inden for sprækken og er karakteriseret ved to stærkt konserverede sæt af polære rester (Arg 997 (grøn), Asn 1025 (rød), Ser1028(pink), Arg 1029(orange), Asp 1031(gul) og Ser 1032(lilla))). Et af disse sæt er placeret på hver monomer underenhed, på homodimeren arrangerer de sig på en antiparallel måde, hvor de peger mod hinanden.

Overudtryksforstyrrelser

I hjernen hos pattedyr udføres udførelsen af hukommelsesbaserede funktioner af den præfrontale cortex (PFC). Hyperpolarisationsaktiverede cykliske nukleotid-gated (HCN)-kanaler på neuroner lukker sig for at tillade elektrokemiske signaler at strømme ned ad axonet og ind i en synapse; når HCN-kanalerne er åbne, kan det elektropotentielle signal ikke overføres gennem cellen. Udsættelse af disse kanaler for cAMP får dem til at åbne sig, hvilket stopper signaloverførslen og dermed forringer de højere kognitive tanker. Hos patienter med skizofreni er et cAMP-reguleringsmolekyle, Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1), muteret og kan ikke regulere cAMP-niveauerne; forhøjede cAMP-niveauer kan således forårsage skizofreni. Man mener, at lukning af HCN-kanaler spiller en rolle i andre lidelser, f.eks. ADHD og bipolar lidelse. Det er således rimeligt, at regulering af cAMP-produktionen ved at målrette type II adenylylcyklase, da det findes i hjernen, kan fungere som en behandling af disse lidelser.

Rv1264 Adenylylcyklase

Selv om adenylylcyklase findes overalt i organismer på et universelt niveau, har fjernt beslægtede organismer forskellige modifikationer af enzymet, der hver især er specialiseret til en bestemt opgave i et bestemt miljø. Som tidligere nævnt har mennesker 10 kendte isozymer af adenylylcyclase; hvorimod Escherichia coli kun har ét isoenzym, og Mycobacterium tuberculosis har 15. En særlig interessant adenylylcyklase hos M. tuberculosis, Rv1264, har en N-terminal, som på en måde fungerer som en pH-sensor, idet den regulerer enzymets aktivitet på grundlag af pH-værdien af den omgivende opløsning. Denne adenylylcyklase tilhører som de fleste andre klasse III, adenylylcyklaser i denne klasse har flere domæner, mindst en til katalyse og en anden til regulering.

Struktur

Adenylylcyklasen er et 363 rester langt protein, der består af en katalytisk og en regulatorisk, som indeholder en fleksibel, der forbinder de to. Den aktive struktur er en homodimer, der ligner pattedyrs type II homodimer, hvor en α-helix af den ene monomer (kæde A) er placeret gennem den centrale coiled coil af den anden (kæde B). Denne dimerisering placerer det regulatoriske domæne af kæde A i umiddelbar nærhed af det katalytiske domæne af kæde B og omvendt. Der findes to switchelementer i proteinet, et i det C-terminale domæne (α1-switch) og et andet i linkerregionen (αN10-switch), disse gør det muligt at foretage store konformationsændringer i enzymet som reaktion på relativt små miljøændringer.

C-Terminalt katalytisk domæne

Den katalytiske aktivitet i Rv1264’s udføres af resterne: Asp 222 (rød), Lys 261 (blå), Asp 265 (orange), Arg 298 (pink), Asp 312 (gul), Asn 319 (lilla), Arg 323 (grøn). Alle disse rester skaber et meget polært miljø, som er komplementært i ladning og polaritet i forhold til reaktionens mellemprodukt. Residualer, der styrer ATP’s fosfater, arginin 298 og 323, binder en i det aktive sted. Denne sulfat-ion er placeret i den position, som ATP’s β-fosfat vil indtage under katalysen. Under katalyseprocessen spaltes β-fosfatet fra α-fosfatet; denne reaktion kan gøres mere gunstig ved at sænke energien ved hjælp af komplementære ladningsforbindelser mellem β-fosfatet og argininerne 298 og 323. En anden rest, , binder et molekyle gennem elektrostatiske vekselvirkninger. Den specifikke funktion af denne forbindelse er ukendt, men på grund af dens nærhed til det aktive sted kan den spille en rolle i katalysen.

Aminosyresekventering har vist, at sekvensen mellem Rv1264 adenylylcyklasens katalytiske domæne og pattedyrs adenylylcyklasens katalytiske domæne ikke er velkonserveret, med kun ca. 25 % overensstemmelse med pattedyrs type II adenylylcyklase, der er omtalt ovenfor. De to forskellige isozymer; ligner dog stadig hinanden, idet overlejring af den ene over den anden har et betydeligt overlap, med en root mean square deviation (rmsd) på mindre end 1,76Å mellem 79% af alle . En bemærkelsesværdig forskel i Rv1264 og type II adenylylcyklase-katalytiske domæner er deres relative størrelser; Rv1264 har ingen dimeriseringsarm, og flere af dens loops er blevet forkortet. Dette resulterer i, at Rv1264 adenylylcyklase-katalytisk domæne associerer som en dimer med et mindre grænsefladeområde end pattedyrs type II, med grænsefladeområder på henholdsvis 1900Å2 og 3800Å2. De aktive steder de Rv1264 og pattedyrs type II adenylylcyklaser er endnu mere konserverede; de i det aktive sted har en rmsd på kun 0,69Å, og i det aktive sted har en rmsd på 1,17Å.

Alle ovenstående strukturelle oplysninger for det C-terminale katalytiske domæne gælder kun, når enzymet er i aktiv tilstand. Enzymets inaktive tilstand besidder et afmonteret aktivt sted og dermed ingen katalytisk aktivitet. I forhold til de faste N-terminale domæner kan hvert af de C-terminale monomeriske domæner transponere op til 6 Å og rotere 55o. Denne massive ændring i de C-terminale domæners tertiære struktur afmonterer det aktive sted og flytter de katalytiske rester op til 25 Å væk fra deres katalytisk aktive position. Ikke alene er det aktive sted opløst i det C-terminale domæne, men grænsefladeområdet mellem de to monomerer falder i størrelse fra 1900Å2 til 930Å2.

α1-switch

Den er placeret inden for det C-terminale katalytiske domæne og eksisterer som en kompakt α-helix, når enzymet er i aktiv tilstand,. Ved inaktivering bliver α1-switchens α-helikale konformation ustabil, og den omdanner sig til en tilfældig spole. Da denne switch befinder sig tæt på det aktive sted, forstyrrer en større ændring i strukturen i høj grad det aktive sted og giver enzymet inaktivitet.

Denne struktur er bevaret i pattedyrs adenylylcyklasser, hvor den fungerer som bidragsyder til bindingsstedet for βγ-fosfaterne af ATP-substratet. Den fungerer også i reguleringen af pattedyrs adenylylcyklasser, sammen med en anden α-helix danner den bindingsstedet for Gsα og Giα G-proteinunderenhederne, som regulerer adenylylcyklasernes aktivitet.

N-terminalt reguleringsdomæne

Det N-terminale domæne fungerer i reguleringen; det har en unik mekanisme, der bestemmer, om enzymet vil være aktivt eller ej, baseret på pH-værdien af den omgivende opløsning. Hver monomer i den katalytisk aktive dimer har ti , når de dimeriseres danner de en skiveagtig struktur. Et enkelt molekyle af binder sig i en hydrofob lomme. Funktionen af denne polyethylenglycol synes at være strukturel; men dens specifikke placering og bevægelse mellem aktive og inaktive former af enzymet tyder på, at den også kan fungere ved at detektere hydrofobiske ændringer i miljøet.

αN10-switch

Den er placeret inden for linkerregionen, og dens konformationsændring har en mere drastisk effekt på det samlede enzym end α1-switch gør. Når enzymet er aktivt, består αN10-switchen af en tilfældig spole med en kort α-helix; denne konformation tillader kun en svag interaktion mellem det N-terminale regulatoriske domæne og det C-terminale katalytiske domæne, hvilket gør det muligt for enzymet at udvise katalytisk aktivitet. Denne helix kan strække sig op til 24 Å, hvilket adskiller de monomere C-terminale katalytiske domæner i dimeren. Denne adskillelse af domænerne sænker deres grænsefladeområde og transponerer rester; som beskrevet ovenfor resulterer disse ændringer i en inaktivering af enzymet, og derfor er et vigtigt kendetegn ved enzymets inaktive tilstand en udvidet αN10-switch. Når αN10-switchen udvides, bevæger den sig udad, og pentaethylenglycolet bevæger sig ind i et nyligt dannet hulrum ved αN10-helixen. Dette understøtter yderligere ideen om, at pentaethylenglycol-liganden ikke kun fungerer for strukturen, men også for reguleringen.

Regulering ved pH

I begyndelsen af linkerregionen findes der en rest, , som har en betydelig indflydelse på reguleringen ved pH. Ved basisk pH har denne rest ingen ladning og minimale interaktioner med de to katalytisk vigtige rester, som ligger 14 Å og 21 Å væk fra deres katalytisk aktive positioner. Enzymet er inaktivt i denne tilstand, ikke kun på grund af Lys 261- og Asp 312-resterne, men også fordi andre vigtige strukturelle komponenter i det katalytiske sted er blevet nedbrudt. Ved en sur pH-værdi bliver Rv1264 aktiv (optimal pH~5,8)og har op til en 40-foldig stigning i aktiviteten. Ved denne sure pH bliver His 192 protoneret og positivt ladet; hvilket skaber store strukturelle ændringer i hele proteinet, herunder komprimering af både αN10-switchen og α1-switchen, sammentrækning af α4-helixen, som igen forårsager en translokation af paraethylenglycol-liganden. Den positivt ladede His 192 afstøder elektrostatisk Lys 261- og Asp 312-resterne, hvilket sammen med andre strukturelle ændringer transponerer dem henholdsvis 14 Å og 21 Å til deres katalytisk aktive positioner.

, en rest, der organiserer mange rester, som er vigtige i C-terminal – N-terminal interaktionen gennem hydrogenbindinger, er også vigtig for reguleringen. Når denne rest er muteret, går reguleringen baseret på pH tabt, og enzymet er konstant aktivt.

Mange andre rester bidrager også til reguleringen ved pH; det er de elektrostatiske interaktioner og hydrogenbindingerne i grænsefladen mellem C-terminal – N-terminal domænet, der gør Rv1264 adenylylcyklase følsom over for pH.

Biologisk rolle

M. tuberculosis er en patogen bakterie, og den står derfor over for en række af værtens immunreaktioner, der forsøger at forsøge at slippe af med den. En af værtens forsvarsmekanismer, som M. tuberculosis står over for, er forsuring, som man støder på i phagolysosomer. Evnen til at kunne registrere dette sure miljø og have et passende svar på det kan i høj grad hjælpe M. tuberculosis med at inficere en vært. Når cAMP-niveauerne øges, forsinkes forsuring af andre strukturer, og forhøjede cAMP-niveauer aktiverer cAMP-receptorproteiner, som igen regulerer transkriptionen.

3D-strukturer af adenylylcyklase

3D Adenylylcyklase 3D-strukturer