Adventivrod
Metoder til rodfæstelse af mikroskud
Hvis mikroskud ikke danner rødder i multiplikationsfasen, skal de behandles specielt for at starte og udvikle et adventivt rodsystem. Mikroskuddene kan rodfæstes in vitro og derefter akklimatiseres til det omgivende miljø, eller de kan rodfæstes ex vitro, hvorved rodfæstelse og akklimatisering kombineres.
Lethed og succesrate for rodfæstelse er afgørende for, hvilken metode der anvendes på en bestemt kultursort. Den mest omkostningseffektive metode er at rodfæste mikroskud ex vitro. Ex vitro-rødning sparer en yderligere in vitro-overførsel til rodemedium og fremskynder akklimatiseringen, hvilket gør mikroformering mere effektiv. In vitro-rødning anvendes, hvis der mangler faciliteter til ex vitro-rødning og akklimatisering, hvis succesraten er lav med ex vitro-rødning, og efter laboratorielederens skøn.
In vitro-rødning. Ingredienserne i mediet og inkubationsforholdene er lette at ændre, når in vitro-forholdene anvendes til at fremme rodinitiering og tidlig udvikling. Næringsstofsaltformuleringerne kan forblive de samme, ændres eller reduceres, ofte til halv styrke makrosalte, og den relative fugtighed kan reduceres ved brug af ventilerede låg (figur 5). Inkubationsbetingelserne for lys- og temperaturkulturer kan ændres med henblik på roddannelse. Mange mikroskud inkuberes i mørke i en periode med henblik på rodinitiering og overføres derefter til oplyste forhold.
Figur 5. Kirurgisk mikroporetape giver ventilation til dette kar med skud, der er ved at blive rodfæstet; dette hjælper med at reducere den relative luftfugtighed og forbereder de nye planter til drivhusmiljøet.
Det rodfæstelsesnæringsmedium, som nyklippede mikroskud placeres på, indeholder normalt auxin. Typisk tilsættes mikromolære koncentrationer af IBA og/eller NAA til mediet før autoklavering. Koncentrationen af auxin afhænger af arten og kultivaren. Disse oplysninger er typisk tilgængelige online ved hjælp af en videnskabelig søgemaskine, f.eks. Google Scholar http://scholar.google.com/. Typisk vil navnet på planten, ordene “vitro” og “root” (eller adventiv rod) i søgestrengen give specifikke oplysninger. Hvis der mangler litteratur om en bestemt plante, kan man bruge nære slægtninge i søgningen for at finde ud af, hvordan de reagerede.
Da det er anerkendt, at de samme koncentrationer af auxin, der stimulerer dannelsen af adventiv rod, kan hæmme rodudviklingen, bruger nogle en tilgang med to medier. Når mikroskud af Cotinus coggygria var på et medium indeholdende 10 µM IBA i 5 dage før overførsel til auxinfrit medium, rodede 100 %; hvorimod kun 40 % rodede ved kontinuerlig dyrkning på et medium med 10 µM IBA (Metivier et al., 2007). Padilla og Burgos (2010) dyrkede olivenmikroskud på medier indeholdende op til 4 µM IBA i 2 uger efterfulgt af overførsel til basalmedium uden auxin, hvilket resulterede i 65-93 % rodfæstelse, afhængigt af kultivar.
I nogle tilfælde er IBA-opløsninger blevet påført mikroskud som en basal dip i et minut eller mere. Tsvetkov et al. (2007) opnåede deres bedste roddannelse af Sorbus domestica-mikrosskud, da de blev dyppet i en 14,8 µM IBA-opløsning i 80 s, før de blev placeret på basalmedium.
Mørke under eller før roddannelse kan øge succesen med roddannelse og synkroniciteten af roddannelse mellem mikrosskud. Etiolation, udvikling af skud uden lys, vil øge den cellulære kompetence til adventiv rodning (Murray et al., 1994). Når valnødde-mikroskud blev etioleret, var rodningen bedre med hurtigere fremkomst af rødder end fra grønne skud (Leslie et al., 2010); de etiolerede skud var dog skøre og krævede mere omhyggelig håndtering.
Kulturering af grønne mikroskud på rodemedium i mørke i en relativt kort periode kan i høj grad forbedre rodningen. En periode med mørke i 4-7 dage på et halvt Murashige og Skoog-medium indeholdende 1 µM phloroglucinol og 1,4 µM IBA efterfulgt af inkubation under oplyste forhold resulterede i bedre rodfæstelse af “Delicious”-æble-mikrosskud end hvis de kun blev dyrket i lys eller i mørke i længere perioder (Zimmerman, 1984). Ved dyrkning af mikroskud af ‘MM106’-æblerodstokke på medium med 4 µM IBA i mørke i 0-10 dage blev det ved histologisk undersøgelse opdaget, at rodinduktion fandt sted i løbet af de første 3 dage eller mindre i mørke, og at kegleformede rodprimordier var synlige på dag 7 (Naija et al., 2008). Timing af behandling i mørke er kritisk og skal muligvis bestemmes for hver enkelt afgrøde eller genotype; ikke desto mindre kan det i høj grad forbedre roddannelsen.
Nogle arter rodfæster bedst, hvis toppen af mikroskuddene er belyst, og den basale del i mediet er i mørke, svarende til den måde, hvorpå makrostiklinger rodfæstes i et drivhusmedium under tåge. Mørkning af mediet kan opnås ved at male ydersiden af kulturkarrene sort til lidt over mediets niveau og dække mediet med sterile polycarbonatgranulatkorn eller et andet lysafvisende stof eller ved at mørklægge selve mediet ved at tilsætte aktivt kul. Undertiden anvendes et drivhusmedium, f.eks. vermiculit, som også udelukker lys, til in vitro-rødning efter at være blevet fugtet med næringsmediet.
Det blev vist, at mørklægning af kun baserne af mikroskuddene øgede roddningen af mandel, fersken og oliven (Rugini, 1988) og æble (Mencuccini og Rugini, 1993) sammenlignet med kontroller, der blev inkuberet enten i mørke eller under lys. I en særskilt undersøgelse rapporterede Mencuccini og Rugini (1993) imidlertid, at mørkfarvning af basalpladen kun havde ringe virkning på roddannelse af mikrosskud af mandel, abrikos, kastanje, jojoba og oliven og var hæmmende for valnød. Derfor kan det være nyttigt at mørklægge basalformen, hvis rodningssuccesen er mindre end ønsket.
Ex vitro-rødning. Hvis roddningsprocenterne er ens, kan ex vitro-roddning være mere effektiv og omkostningseffektiv end in vitro-roddning (Leva, 2011). Omkostningerne er højere, når man roterer in vitro, på grund af ingredienser, forberedelsestid, autoklavering af medier, arbejdskraft til overførsler og flytning af kulturer og inkubationsrum. Flytning til drivhuset er ens mellem in vitro- og ex vitro-rødning, og transplantationstiden kan være den samme eller langsommere, når der er rødder på mikroskuddene (figur 4 og 6). Der opnås større effektivitet ved at rodfæste ex vitro. Det er blevet rapporteret, at rodkvaliteten af valnøddemikroplanter er bedre, når rødderne dannes ex vitro under tåge end in vitro i et geleret medium (Leslie et al., 2010).
Figur 6. (a) og (b) In vitro rodfæstede mikroforplantede kirsebærplanter klar til udplantning i et sphagnumtørv-drivhusmedium før placering under høj relativ luftfugtighed med henblik på akklimatisering. (c) Kirsebærplanter, der udplantes som det første skridt i akklimatiseringen i drivhuset. (d) Valnøddeplanter, der plantes i en flade, inden de anbringes under høj relativ luftfugtighed i et drivhus.
Ex vitro-rødning kan være en forbedring af in vitro-rødning. Selv om in vitro-mikroskud af Gardenia jasminoides rodede på 10 dage, sammenlignet med 14 for ex vitro-mikroskud, overlevede alle ex vitro-rodede mikroskud akklimatisering sammenlignet med 80 % overlevelse for in vitro-rodede mikroskud (Hatzilazarou et al., 2006). Dårligere overlevelse af mikroskud med rødder in vitro sammenlignet med mikroskud med rødder ex vitro blev også rapporteret for valnød (Leslie et al., 2010).
Det kan være nødvendigt at behandle mikroskud med auxin før plantning i rodemedium til ex vitro-rødning. Pistacie-mikroskud, der er behandlet med 2 % IBA i talkum, fik 79 % rødder ex vitro sammenlignet med 48 % rødder for kontrollerne (Benmahioul et al., 2012).
Forbedret ex vitro-rødning kan også opnås med auxin, der anvendes som en flydende dip, der påføres den basale del af mikroskuddene. En 15 minutters puls i 250 µM IBA fik 90 % af træarten Melia azedarach-mikrosskud til at slå rod sammenlignet med ingen roddannelse på kontrolmikrosskud (Husain og Anis, 2009). Et 2 timers dyp i en vandig opløsning med 588 µM IBA fik 90 % af Malus zumi-mikrosskuddene til at slå rod sammenlignet med 20 % rodfæstelse på kontrollerne (Xu et al., 2008).
Måske på grund af en tilbagevenden til juvenilitet kan øget tid til at blive formeret in vitro øge rodfæstelsen af mikrosskuddene. Leva og Petruccelli (2012) testede rodning op til syv subkulturer og fandt, at rodningen var bedst efter den syvende subkultur.
Faciliteter, arten, forsendelsesmetoden, kundens efterspørgsel og ledelsens præferencer dikterer alle, hvordan mikroskud rodfæstes. Arter, der rodfæster meget let eller rodfæster i skudproliferationsfasen, kan hurtigt akklimatiseres til ex vitro-miljøet. Det er de vanskelige arter, der får særlig opmærksomhed med hensyn til belysning, auxin-behandling, rodning in vitro eller ex vitro og andre faktorer. De kloner, der er vanskelige at rodfæste, kræver højere priser af kunderne, fordi rodfæste er en hindring for en effektiv produktion. Rodningen kan forbedres, hvis den betragtes som en proces i flere trin med erhvervelse af kompetence, rodinitiering og efterfølgende rodvækst. Alle disse trin skal overvejes og behandles, især i forbindelse med de mere vanskeligt rodfæstede kloner.