Aggregation af ampholin på heparin og andre sure polysaccharider ved isoelektrisk fokusering

Mekanismen for kompleksdannelse af pI-området 3,5-5 Ampholin til heparin ved isoelektrisk fokusering er blevet undersøgt ved hjælp af farvestofbindingsteknikken ved forskellige pH-værdier i opløsning. Der er ingen signifikant interaktion mellem heparin og Ampholin ved pH 6,7. Svag eller selektiv binding forekommer ved pH 5,1, og meget stærk interaktion ved pH 3,5. I sidstnævnte system synes Ampholinkomponenterne at opføre sig som polykationer på grund af deres ordnede rækkefølge af positive ladninger, hver to methylengrupper fra hinanden, hvilket begunstiger en stærk binding til polyanioner. Desuden synes der at være varierende støkiometrier for den stærke binding mellem heparin og Ampholin, afhængigt af deres relative mængder. Det foreslås, at ved et lavt forhold mellem heparin og Ampholin (Ampholinoverskud) sker aggregeringen vinkelret på heparinkæden, idet ammoniumladningen i slutningen af hvert Ampholinmolekyle neutraliserer én negativ ladning langs heparinmolekylet; ved højere forhold (Heparinoverskud) er det bundne Ampholinsegment orienteret parallelt med heparinmolekylet, således at en Ampholinkomponent i gennemsnit neutraliserer ca. tre negative ladninger. Heparins bånddannelse ved isoelektrisk fokusering i pH-området 3,0-4,5 kan forklares ved aggregering af de forskellige komponenter på heparin i mængder, der afhænger af nettoladningen på Ampholin-arten ved den givne pH-værdi og af de skiftende stoichiometrier som funktion af variationen i forholdet mellem heparin og Ampholin langs pH-gradienten. Der blev også påvist binding af Ampholin til polygalacturonat i overskud af Ampholin i et pH-område, der afhænger af graden af protonering af carboxylgrupperne i dette sure polysaccharid samt af den positive nettoladning af Ampholin. Den aggregation, der blev set ved pH 4,2-4,5, førte til en forudsigelse og efterfølgende påvisning af, at polygalacturonat også ville udvise binding ved isoelektrisk fokusering. Dette understøtter hypotesen om, at aggregering af Ampholin på polyanioner med tilstrækkelig ladningstæthed er et generelt fænomen, som kan føre til ukorrekt bånddannelse af visse polymerer ved passende pH-intervaller i isoelektrisk fokusering. På grundlag af deres adfærd ved isoelektrisk fokusering ved pH 3,0-4,5 synes aggregationsstyrken for de undersøgte polyanioner at være heparin A = heparin B større end polyglutamat større end carboxylreduceret heparin B større end polygalacturonsyre.