Aktuelle anvendelser af antistofmikroarrays

På grund af antistofmikroarrays unikke egenskaber og deres anvendelighed i en række biomedicinske projekter er der blevet udviklet en række forskellige antistofmikroarrays, hvoraf nogle er blevet kommercielt tilgængelige. Heri har vi samlet nogle af de repræsentative undersøgelser i de sidste 7 år (tabel 1) og organiseret vores oversigt i to dele afhængigt af projekternes fokus: grundlæggende biologisk drevne undersøgelser og klinisk forskning. Da det fortsat er praktisk talt umuligt at dække alle de seneste anvendelser af antistofmikroarray’er, fokuserer vi på de anvendelser, som vi har anset for at være af stor interesse, og på resultater af stor klinisk betydning.

Grundforskning

Signalvejrelateret

Ændringer i signalveje er et kendetegn for mange sygdomstilstande, herunder kræft , diabetes og neurodegenerative lidelser . Ved at opbygge antistofarray’er ved hjælp af opfangningsreagenser, der er rettet mod proteiner i den pågældende signalkaskade, har forskerne kunnet undersøge ændringer i proteinprofiler og modifikationer i signalveje i normale biologiske processer og sygdomstilstande. Forskere har anvendt dette koncept på en række biologiske prøvematerialer og præparater, herunder cellelysater , vævsekstrakter og plasma .

Calbindin-D28 k (CB), et vigtigt calciumbindende protein, der fungerer som en calciumbuffer, er fundet at blive udtrykt på lavere niveauer i hjernen hos mus og mennesker med Alzheimers sygdom, men det vides ikke, om disse ændringer bidrager til AD-relateret dysfunktion (AD). Kook et al. genererede en CB-deficient Alzheimers transgene mus (CBKOTg) for at undersøge i CB’s bidrag til signalveje i AD . Ved hjælp af antistofmikroarrays til undersøgelse af hjernevæv fra musen identificerede de betydelige ændringer i celledødssporene, synaptisk transmission og MAPK-signalveje ved CB-deletion. Disse resultater blev verificeret ved immunohistokemi, som viste øgede apoptotiske markører og øget neuronal død, hvilket viser, at antistofmikroarrays kan give nye oplysninger og øge vores forståelse af CB’s rolle og dens betydning i AD-patofysiologi.

Antistofmikroarrays er blevet brugt til at afdække den fysiologiske rolle i højt konserverede proteiner, herunder elongationsfaktor 4. Gao et al. dissekerede mekanismen for kvalitetskontrolfaktoren mitokondriel Elongation factor 4 (mtEF4) i translation ved hjælp af et phospho-explorer antistofmikroarray . Ved at sammenligne cellelysater mellem mtEF4 knock-out og WT-mus testikelvæv fandt de, at foldberigelsen af mTOR var den højeste blandt forskellige signalveje. Forfatterne viste, at med mtEF4-deletion er det vigtigste feedback-signal fra det somatiske cytoplasma mTOR-opregulering. Dette blev ledsaget af en øget cytoplasmatisk translation, hvilket indikerer, at mTOR spiller en afgørende rolle som en downstream-effektor, der kompenserer for mitokondriel translationssvigt . Desuden forbandt undersøgelsen tidligere ubeskrevet cross-talk mellem mtEF4-afhængig kvalitetskontrol i mitokondrierne og mTOR-vejen i cytoplasmaet.

Drugsmekanisme

Med hjælp af antistofmikroarray-analyser kan forskere undersøge lægemiddelmekanismer på en systematisk og effektiv måde. Blandt mange mulige anvendelser er tumorinduceret angiogenese blevet undersøgt, da den spiller en central rolle i kræftfremskridt . P11, en ny peptidligand, der indeholder et PDZ-bindende motiv (Ser-Asp-Val) med høj affinitet til integrin αvβ3, blev identificeret fra et hexapeptidbibliotek (PS-SPCL) ved hjælp af et antistofmikroarray . Den farmakologiske mekanisme af P11 blev belyst ved hjælp af et specifikt designet farmakoproteomisk mikroarray, der indeholder 48 kræftrelaterede antistoffer . Undersøgelsen afslørede, at P11 hæmmer bFGF-induceret proliferation af humane endotelceller fra navlevenen via mitogen-aktiveret proteinkinase og ekstracellulært signalreguleret kinasehæmning. Desuden afslørede mikroarrayet, at P11 forårsagede opregulering af den apoptotiske markør p53, resulterede i apoptoseinduktion via aktivering af caspasesystemet, hvilket indikerer, at P11 kan spille en nøglerolle i forebyggelsen af tumorprogression. Forbindelsen mellem P11 og p53 præsenterer kliniske og grundlæggende kræftforskere vil bidrage til at belyse yderligere spor om P11’s rolle og dets hæmmende mål.

Lovastatin, et naturprodukt afledt af Aspergillus terreus eller Monascus ruber, er blevet bredt anvendt som et kolesterolsænkende lægemiddel i klinikken. Yang et al. har anvendt et antistofmikroarray indeholdende 656 antistoffer med fokus på forskellige funktionelle celleveje, hvilket tyder på, at lovastatin også har egenskaber mod kræft gennem dårligt definerede mekanismer. Der er et stort behov for at finde effektive kræftbehandlinger og for at forstå deres virkningsmekanismer. Ved hjælp af et mikroarray blev brystkræftceller undersøgt under hypoxiske forhold for at undersøge de molekylære mekanismer, gennem hvilke Lovastin udøver sin virkning. De viste 17 opregulerede proteiner og 20 nedregulerede proteiner for lovastatinbehandlede brystkræftceller sammenlignet med kontrolcellerne, og resultaterne blev efterfølgende valideret ved realtids-PCR . Proteinsignaturen omfattede proteiner, der er involveret i apoptose, celleproliferation og tumormetastase, hvilket forbinder modulering af disse veje med den farmakologiske virkning af lovastin.

Det type 2-diabeteslægemiddel metformin er også foreslået at have kræftbekæmpende egenskaber. Lee et al. undersøgte virkningen af nye metforminderivater ved hjælp af et antistofmikroarray, der er bygget til at studere cellecyklusrelaterede molekyler. Forfatterne viste, at metformin-butyrat (MFB) havde bedre anti-tumoreffekter end metformin-HCl, gennem større neoplastisk aktivitet og bedre effektivitet til at forringe cellecyklusprogressionen i S- og G2/M-faser ud over at synes at have præferentielle cytotoksiske virkninger på stamcellepopulationer af brystkræft . Disse resultater fremhæver, hvordan antistofarrays kan give proteomisk dokumentation til støtte for udvikling af lægemidler med bedre effekt.

For grundlæggende biologisk forskning kan antistofmikroarrays bruges til at påvise signalproteiner og proteiner, der er forbundet med en bestemt fænotype. Arrays med parallel proteindetektion giver mulighed for at undersøge flere signalveje i et enkelt eksperiment, hvilket giver indsigt i nye mekanismer, såsom undersøgelse af sygdomsudvikling, lægemiddelinteraktion og reaktion på infektioner.

Klinisk forskning

Analyse af kliniske prøver på proteinniveau vil muliggøre forbedring af diagnostiske markører og styring af behandlingsmuligheder. Da proteiner er involveret i størstedelen af de cellulære processer, kan proteinanalyse give en biologisk sygdomssignatur og skabe detaljeret indsigt i en celles, et organs eller et systems aktuelle tilstand. Antistofmikroarrays kan give en realtidsguide af de aktuelle ændringer i biologiske processer under sundhed og sygdom. I dette afsnit vil vi give eksempler på, hvordan antistofmikroarrays er blevet anvendt til at undersøge kliniske kohorter, primært ved at analysere serum- og plasmaprøver. Det er ikke muligt at dække alle aspekter af antistofmikroarrays til klinisk forskning, heri fokuserer vi kun på flere af de vigtigste sygdomme, dvs. autoimmune sygdomme, infektionssygdomme, kræft og neurodegenerative sygdomme.

Autoimmune sygdomme

Diagnosen af systemisk lupus erythematosus (SLE) er en udfordring på grund af dens heterogene kliniske præsentation og manglen på robuste biomarkører til at skelne den fra aktiv og inaktiv sygdom samt fra andre autoimmune sygdomme. Lin et al. udførte en DotScan™ antistofmikroarray-screening af perifere mononukleære blodceller fra 60 SLE-patienter med varierende sygdomsaktivitet, 25 patienter med reumatoid arthritis, 28 prøver af andre autoimmune sygdomme og 24 sunde kontroller. Antistofmikroarray-profilerne kunne skelne aktive SLE-patienter fra raske kontroller. Ved at anvende et leukocyt capture array forbedrede man den diskriminerende evne til konventionel SLE-diagnostik ved at verificere serum anti-dsDNA, komplementer C3 og C4, og mikroarrayerne øgede evnen til at skelne mellem semi-aktiv og aktiv SLE, information, som vil bidrage til bedre sygdomsbehandling.

I en anden undersøgelse konstruerede Carlsson et al. 135 humane rekombinante enkeltkædefragmentvariable (scFv), der er målrettet immunproteiner, for at opbygge et internt antistofmikroarray. I denne undersøgelse undersøgte de patienter med systemisk sklerose (SSc), SLE og 15 raske frivillige. SSc er en autoimmun lidelse, der påvirker forbindelsesvæv, og som kan være en udfordring at diagnosticere forskelligt fra SLE. Arrayet identificerede 40 differentielt udtrykte proteiner, der skaber en kandidatproteomsignatur til afgrænsning af SLE og dens sværhedsgrad fra SSc. Denne proteinsignatur var en bedre sygdomsklassifikation end enkeltstående eller endog kombinationer af konventionelle kliniske parametre, herunder ANA, anti-DNA, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 og CRP, hvilket illustrerer den potentielle anvendelse af antistofmikroarrays til at skabe nye sygdomssignaturer, som vil tilføre klinisk værdi til sygdomsstyring.

Infektionssygdomme

Infektioner aktiverer immunsystemet på forskellig vis, og disse mekanismer kan undersøges ved hjælp af antistofarrays på proteomniveau. Helicobacter pylori er et patogen, der koloniserer ca. halvdelen af verdens befolkning og forårsager kronisk gastritis. Sukri et al. anvendte DotScan™ antistofmikroarray til at bestemme immunsystemets tolerance over for tumorceller i mavekræft ved hjælp af 144 CD-antistoffer til at profilere fordelingen af CD-markører mellem Helicobacter pylori-inficerede og ikke-inficerede adenocarcinomceller i mavesækken. Interessant nok fandt de, at gastrisk adenocarcinomcellelinje AGS, der var inficeret med cagA + H. pylori, viste øget CD27-ekspression, som er afgørende for opretholdelse af T-cellepopulationen, og der blev også påvist øgede CD-markører hos H. pylori-inficerede mavekræftpatienter. Denne undersøgelse tyder ikke kun på immunsystemets tolerance over for mavekræft, men også på de immunresponsvariationer, der udnyttes af forskellige H. pylori-stammer.

Dertil kommer, at antistof arrays kan være nyttige til at spore en fortsat ændring i det fysiologiske miljø, herunder sygdomsstatus og respons på behandlinger og interventioner. Efter levertransplantation blev 94 % af patienterne fundet med hepatitis C-virus (HCV) inducerede histologiske skader, og nogle patienter fik alvorlige sygdomsrecidiv . Der er et presserende behov for prædiktive biomarkører til at identificere tilbagevendende sygdomsgrad. Ved hjælp af et CD-antistofmikroarray blev perifert blod fra patienter defineret som præ-transplantations-, tidlige, midterste og sene transplantationsgrupper undersøgt for at forudsige alvorligheden af HCV-recidiv efter transplantation . Serielle blodprøver fra patienter før og efter levertransplantation muliggjorde sporing af sygdomsmiljøet, med egne interne kontroller. Fem CD-markører (CD27, CD182, CD260, CD41 og CD34) var signifikant forøget i alvorlig recidiv sammenlignet med mild recidiv. Dette resultat viser, at antistof arrays kan hjælpe med at vurdere recidiverende HCV-sygdomens sværhedsgrad efter levertransplantation.

Ellmark et al. udtænkte et enkelt ramme rekombinant antistof (SinFabs) mikroarray indeholdende 127 forskellige antistoffer mod immunregulerende antigener udvalgt fra n-CoDeR-biblioteket på gastrisk adenocarcinom. De viste, at forskellige tumor- såvel som infektionsassocierede proteinekspressionssignaturer, såsom IL-9, IL-11 og MCP-4, kunne identificeres fra plasmaproteomerne og tjene som potentielle biomarkører. Disse resultater kan bidrage til at forbedre forståelsen af H-pylori-induceret kræft og kan bane vejen for raffineret diagnostik i fremtiden.

Bladsystemer baseret på antistof arrays er blevet udført for at undersøge differentielle proteinprofiler i plasma hos børn, der lider af malaria og malaria-relaterede komplikationer . Ud af 1000 screenede proteiner havde 41 proteiner differentieret ekspression mellem malariasmittede børn og samfundskontroller. Yderligere 13 proteiner var forbundet med malaria-sygdommens sværhedsgrad. Disse resultater tyder på, at inflammation og ubalanceret glukosemetabolisme er involveret i alvorlige former for sygdommen, og de største ændringer blev set i to af muskelproteinerne (kulsyreanhydrase 3 og kreatinkinase), hvilket tyder på muskelskader og læsioner hos børn med cerebral malaria. Disse resultater kan bidrage til udviklingen af enkle test til klassificering af malaria-inficerede børn i grupper med større risiko for den alvorlige form af sygdommen.

Kræft

Antistofmikroarrays er blevet anvendt til kræftforskning, hovedsagelig til at studere kræftudvikling og kandidatproteiner, der kan tjene som diagnostiske biomarkører . Bugspytkirtelkræft er en aggressiv sygdom med dårlig prognose, og der er et presserende behov for sygdomsspecifikke biomarkører, der giver tidlig og præcis diagnose. Ved hjælp af en internt udviklet rekombinant antistofmikroarray-platform screenede Wingren et al. serum fra 148 patienter med bugspytkirtelkræft, kronisk pankreatitis, autoimmun pankreatitis (AIP) og sunde kontroller. De identificerede et panel af 25 proteinmål, herunder IL-2, IL-11, IL-12 og TNF-, som bidrog til at skelne mellem bugspytkirtelkræft og raske kontroller. Denne 25 proteinsignatur udviser et højt diagnostisk potentiale (AUC på 0,88). Desuden har gruppen for nylig udvidet analysen af deres panel til at omfatte yderligere prøvesæt, herunder lymfekræft , prostatakræft og brystkræft i cellelysater og plasma . Disse resultater er nyttige til støtte for udviklingen af nye og multivariate diagnostiske metoder.

Et af de vigtigste spørgsmål inden for kræftbiologien er at bestemme en tumors invasivitet. En undersøgelse udviklede en skræddersyet en antistofmikroarrayplatform, der indeholder 4096 funktioner til at afhøre plasmaprøver, der spænder over præinvasive og invasive sygdomme fra en musemodel af pancreatisk duktal adenocarcinom (PDA) . De fandt en proteinsignatur, der består af differentiel ekspression af tre proteiner, ERBB2, TNC og ESR1, som kunne bruges til at forbedre AUC fra 0.86 (95% konfidensinterval 0.76-0.96) til 0.97 (95% CI 0.92-1.0), når PDA-markøren CA19-9 inkluderes.

De fleste nydiagnosticerede tilfælde af blærekræft er lavt stadie, lav grad, ikke-muskelinvasiv . Efter standard transurethral resektion går 50-70 % af tumorerne tilbage, men 10-30 % af tumorerne vil dog udvikle sig til muskelinvasiv sygdom . Forståelse af mekanismen for tumorudvikling kan give mere nyttige oplysninger til klinisk brug. Srinivasan et al. undersøgte cellelysater med et antistofmikroarray indeholdende 810 kræftrelaterede antistoffer konstrueret af Hoheisel-laboratoriet . Forfatterne opbyggede en multivariat klassifikator med 20 proteiner, som gjorde det lettere at forudsige tilbagefald med en følsomhed på 80 % og en specificitet på 100 %. Interessant nok fandt de en undertrykkelse af TGF-β-signalvejen i tilbagevendende kræft. Signalfaktorerne IFNG, TNF-α og THBS1 blev udtrykt i mindre grad, og mængden af inhibitoren MAPK3 (også kendt som ERK1) var højere, mens SMAD2, SMAD3 og SMAD4 igen var signifikant underrepræsenteret . Dataene indikerede, at TGF-β-signalvejsinhibitorer kan reducere tilbagefald af blærekræft .

Puig-Costa et al. anvendte antistofmikroarrays til at opdage biomarkører for gastrisk kræft (GC). Især indeholdt antistofmikroarrayet antistoffer, der var rettet mod forskellige velkendte funktionelle proteiner, som spiller en afgørende rolle i kræftprogression, herunder 120 cytokiner, 43 angiogene faktorer, 41 vækstfaktorer, 40 inflammatoriske faktorer og 10 metalloproteinaser. Ingenuity pathway-analyse bekræftede, at nogle biomarkører, såsom ICAM-1 og angiogenin, indikerede et højt inflammatorisk respons hos GC-patienter. Cellulære bevægelser og mål for immuncelletrafikken, såsom monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, viste sig at være overrepræsenteret hos GC-patienter. Den positive prædiktive og negative prædiktive værdi i denne valideringskohorte var henholdsvis 75 % (95 % CI 53-90) og 80 % (95 % CI 56-94). Endelig identificerede antistofmikroarray-analyser af det GC-associerede inflammatoriske proteom et 21-protein-inflammatorisk protein-drevet signatur for mavekræft (INPROGAS), der præcist diskriminerede GC fra ikke-kræftfremkaldende maveslimhinde og kan give nye spor til analyse af kræftfremskridt.

I prostatakræft brugte Schwenk et al. antistofarrays på suspension bead arrays til at sammenligne plasmaniveauer af proteiner mellem forskellige grupper med henblik på at finde yderligere biomarkører ved siden af prostataspecifikt antigen (PSA). Ud over at klassificere patienterne på grundlag af PSA identificerede de nedsatte plasma CNDP1-niveauer, og i en efterfølgende større undersøgelse blev det vist, at dette var forbundet med mere aggressive former af sygdommen. Der blev udviklet et sandwich-immunoassay til validering af disse resultater hos mere end 1200 patienter, og forbindelsen mellem det nedsatte CNDP1-niveau og lymfeknudemetastase blev yderligere belyst . Dette viser en af de meget få undersøgelser, som med succes har valideret en indledende indikation gennem antistofmikroarray-pipeline og udvikling af et målrettet assay. I en efterfølgende undersøgelse af kræftkacheksi blev det konstateret, at plasmaniveauerne af CNDP1 var nedsat hos patienter med kacheksi, hvilket peger på en metabolisk rolle for ændringer i CNDP1-niveauerne .

I en undersøgelse af neuroendokrine tumorer i tyndtarmen undersøgte Darmanis et al. plasmaniveauerne i to uafhængige undersøgelsessæt (77 og 132 prøver) og et målrettet perlearray for 124 unikke proteiner. De kunne opnå en klassifikationsnøjagtighed på op til 85 % ved hjælp af et panel af proteiner og konkluderede med at foreslå nye kandidater til klassificering af tumorerne. Af de kandidater, der var på listen, f.eks. for IGFBP2 og IGF1, udførte gruppen ELISA-analyser for at bekræfte indikationerne. Disse resultater tyder på en metabolisk forbindelse mellem plasmaproteiner og kræft og støtter, at disse mål bør overvejes i fremtidige kræftundersøgelser.

Neurodegenerative sygdomme

Analyse af proteinekspression giver mulighed for at udvide den nuværende viden om neurodegenerativ patofysiologi . De seneste fremskridt inden for proteomikken har givet mulighed for at søge efter nye biomarkører ved hjælp af antistofmikroarrays . Fremskridt i udviklingen af protokoller har gjort det muligt for forskere at undersøge ikke kun blod, men også cerebrospinalvæske (CSF) .

Inden for neuroproteomik har Nilsson-laboratoriet gennemført flere undersøgelser ved hjælp af antistoffer fra Human Protein Atlas sammen med suspension bead array-assays. Ved profilering af CSF fra patienter med multipel sklerose (MS) fandt de GAP43, et cytoplasmatisk protein, der er involveret i dannelse og regenerering af neuroner, og som derfor er en lovende biomarkør for sygdomme i hjernen . For nylig sammenlignede Remnestål et al. proteinniveauer i 441 CSF-prøver indsamlet fra forskellige prøver af neurodegenerative sygdomme samt CSF indsamlet post mortem. Blandt 376 antistoffer blev de synaptiske proteiner GAP43 og NRGN fundet at være associeret med AD-patienter sammenlignet med kontroller.

Med brug af plasmaprøver, CSF og hjernevæv fra patienter, der lider af MS, blev der gennemført en screening i stor skala, der startede med at udnytte 4500 antistoffer på bead arrays . Et sæt proteiner blev fundet at være forbundet med MS-subtyper i CSF og plasma. Ved anvendelse af nogle af kandidatantistofferne mod IRF8, IL7 og METTL14 til immunofluorescensanalyse af hjernevæv blev der også påvist farvning af neuroner i nærheden af MS-læsioner. Dette tyder på, at antistoffer udvalgt fra array-baserede analyser til analyse af kropsvæsker også kan give yderligere beviser på det berørte væv.

Sidst blev perlearrays anvendt til at profilere plasma fra patienter, der lider af amyotrofisk lateralsklerose (ALS) , hvor 367 ALS-patienter og 101 kontroller blev analyseret for 278 proteiner. Undersøgelsen konkluderer med at foreslå neurofilament medium polypeptid (NEFM), solute carrier family 25 (SLC25A20) og regulator of G-protein signalering 18 (RGS18) som værdifulde proteiner, fordi de er involveret i processer relateret til sygdomspatofysiologi, hvilket berettiger yderligere validering i uafhængige prøvesæt.