Alpha-2 adrenerge receptor-agonister blokerer stressinduceret genindførelse af kokainsøgning

Experiment 1: Effekter af Clonidin, Lofexidin og Guanabenz på fodstød-induceret NE-frigivelse

Forsøgspersoner

Forsøgspersonerne var han-lang-Evans rotter (Charles River, Quebec), der vejede 300-350 g ved forsøgets begyndelse. I hele forsøget var dyrene opstaldet i et fugtigheds- og temperaturkontrolleret kolonihaveværelse på en omvendt lys-mørke-skema (lys på 1730-0530 timer) og fik fri adgang til standard laboratorierådemad og vand. De eksperimentelle procedurer fulgte CCAC-retningslinjerne og blev godkendt af dyreforsorgskomitéen, Concordia University.

Kirurgi

Vor operationen blev rotterne bedøvet med natriumpentobarbital (65 mg/kg, i.p.) og fik indsprøjtet atropinsulfat (0,6 mg/ml; 0,2 ml/rotte, SC) og antibiotikum (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/rotte, i.m.). Der blev implanteret føringskanaler (20 gauge; Plastics One) med henblik på efterfølgende indsættelse af dialysesonder; en blev placeret i PFC og en i AMG i modsatte halvkugler. De dyr, der blev anvendt til undersøgelse af virkningerne af guanabenz, fik en enkelt føringskanyle rettet mod PFC. Den hemisfære, hvori de respektive føringskanyler blev implanteret, blev udlignet på tværs af behandlingerne. De anvendte stereotaksiske koordinater (i forhold til bregma og kranieoverfladen) var som følger: AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos og Watson 1997). Ved indsættelse forlænges dialysesondenes skaft 1 mm fra føringskanalerne. De implanterede førerkanaler blev fastgjort til kraniet med skruer af rustfrit stål og tandcement. Føringskanalerne blev lukket med indskruede obduratorer. Alle dyr blev returneret til kolonirummet i en genopretningsperiode på mindst 1 uge før testningen.

Mikrodialyse

Mikrodialyse blev udført i fire sekskantede testkamre (42 × 39 × 33,5 cm) bygget af plexiglas med trælofter og gulve af rustfrit stålstænger. Der blev trukket mørke gardiner for hvert kammer, og belysningen blev leveret i en omvendt cyklus af ovenlyspærer (15 W). Dialysesonden bestod af en 1,8 mm (AMG) eller 3,5 mm (PFC) lang semipermeabel dialysemembran (Spectra/Por; 240 μm o.d., 13000 M.W. cutoff), der var lukket i den ene ende og fastgjort i den anden ende til en 19 mm lang rustfri stålslange af 26 mm tykkelse. En 40-50 cm lang PE-20-slange forbandt den anden ende af den rustfrie stålskaft med en infusionshvirvel, der var anbragt over testkammeret, og som igen var forbundet via PE-20-slangen med en infusionspumpe med variabel hastighed. En slange af smeltet silica med lille diameter gik indvendigt gennem sonden, hvor den ene ende hvilede 0,5 mm fra sondens spids og den anden ende forlod PE-slangen 35 cm under infusionshvirvelen. Den udvendige længde af PE-20-slangen var beskyttet mod beskadigelse af fjederhuse af stål. Sondene var udformet således, at hele længden af den semipermeable membran strakte sig under spidsen af førerkanylen.

Særskilte grupper af dyr blev anvendt til at undersøge virkningerne af hvert af de afprøvede lægemidler. Inden for hver gruppe blev hvert dyr tilfældigt tildelt en behandlingsbetingelse. Dyr, der fik køretøjsinjektioner, blev kørt i hver gruppe, men blev kombineret i en enkelt gruppe til statistisk analyse. De endelige gruppestørrelser (PFC/ AMG) var som følger: vehikel (n = 15/17), clonidin 20 μg/kg (n = 7/6), clonidin 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidin 75 μg/kg (n = 6/6), lofexidin 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640μg/kg (n = 4, PFC). Med undtagelse af de dyr, der fik guanabenz, blev alle forsøgspersoner dialyseret to gange, én gang i PFC og én gang i AMG med et interval på 3-4 uger mellem testene.

Sondene blev indsat dagen før begyndelsen af mikrodialyseprøvningen. For at forhindre okklusion blev kunstig CSF (145 mM Na+, 2.7 mM K+, 1.22 mM Ca2+, 1.0 mM Mg2+, 150 mM Cl-, 0.2 mM ascorbat, 2 mM Na2HPO4, pH 7.4 ± 0.1) perfunderet natten over med en hastighed på 0.06 μl/min. Dialysatprøvetagning og aktivitetsovervågning begyndte næste morgen. Dialysatstrømningshastigheden blev øget til 0,6 μl/min, og dialysatprøver (∼12 μl/prøve) blev opsamlet hver 20. minut. Prøverne blev indsamlet, indtil der blev opnået en stabil basislinje, defineret som mindst tre på hinanden følgende prøver, hvor dialysat-NE-niveauerne varierede med ±10 %. Efter etablering af stabile NE-basisniveauer fik alle dyr en i.p.-injektion (1 ml/kg) af det relevante lægemiddel eller vehikel, som blev givet 40 min. før en 10 minutters periode med fodchok. Stød blev givet efter en variabel tidsplan med et gennemsnitligt interval på 40 sekunder (10-70 sekunders interval); hvert stød (0,6 mA) var af 0,5 sekunders varighed. Der blev indsamlet prøver i yderligere 120 minutter (6 prøver). Prøverne blev straks analyseret ved hjælp af et af to lignende højtydende væskekromatografisystemer med elektrokemisk detektion (HPLC-EC). Prøverne (10 μl) blev indlæst på omvendtfasekolonner (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) gennem manuelle injektionsporte (Reodyne 7125; 20 μl loop); reduktions- og oxidationsstrømme for NE, dihydroxyphenylacetat (DOPAC), 5-hydoxyindoleeddikesyre (5-HIAA) og homovanillinsyre (HVA) blev målt med to-kanals ESA coulometriske detektorer (Coulochem 5100, med en konditioneringscelle model 5021 og en analysecelle model 5011, Sci. Products & Equipment). Strømmene for NE blev målt uafhængigt af strømmene for DOPAC og HVA ved hjælp af separate kanaler i Coulochem-detektorerne. De mobile faser (natriumacetat 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, 5% acetonitril, justeret til pH 3,7 ved hjælp af iseddike) blev cirkuleret gennem hvert lukket system med en strømningshastighed på 1,4 ml/min ved hjælp af Waters 510 HPLC-pumper. De opnåede toppe for NE, DOPAC og HVA blev integreret og kvantificeret ved hjælp af EZChrom Chromatography Data System (Sci. Products & Equipment). Dialysatprøver fra individuelle rotter blev altid analyseret med det samme HPLC-EC-system, og tildelingen af dyr til hvert system var modbalanceret på tværs af alle behandlingsgrupper. Foder blev fjernet fra kamrene før prøvetagning, men et vanddrikke-rør var tilgængeligt. Ved afslutningen af testen blev bekræftelse af korrekt sondeplacering bestemt ved undersøgelse af 30 μm sektioner skåret gennem stederne for sondeplacering farvet med Cresylviolet.

Forskning 2: Virkninger af clonidin på fodchok- og kokaininduceret genindførelse

Emner

Eksperimentet var 25 han-lang-Evans rotter (Charles River, Quebec) med en vægt på 350-425 g ved forsøgets start. Dyrene blev vedligeholdt som beskrevet i forsøg 1.

Kirurgi

Dyrene blev forberedt til kirurgi som beskrevet i forsøg 1. Et intravenøst kateter (Dow Corning) blev implanteret i højre halspulsåren. En 3 cm lang silastikslange blev indsat i venen (indre diameter 0,30 mm, ydre diameter 0,64 mm) og blev forbundet med varmekrympeslange til en 9 cm lang silastikslange (indre diameter 0,51 mm, ydre diameter 0,94 mm), som blev ført subkutant til toppen af kraniet. Kateteret blev fastgjort til venen med silkesuturer og kom ud i et stik (en modificeret 22 gauge-kanyle; Plastics One, Roanoke, VA), der blev monteret på kraniet med juvelerskruer og tandcement; en plastikkappe blev placeret over kanyleåbningen. Dyrene fik 1-2 uger til at komme sig efter operationen.

Apparatur

De selvadministrationskamre, der blev anvendt i eksperimenterne, var udstyret med et indtrækkeligt håndtag (Med Associates, St Albans, VT) og et ikke-indtrækkeligt “dummy”-håndtag. Begge håndtag var placeret 9 cm over gulvet. En infusionspumpe (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) blev aktiveret af reaktioner på det indtrækkelige, eller “aktive” håndtag. Reaktioner på det kunstige håndtag blev registreret, men resulterede ikke i aktivering af pumpen. Lægemiddelopløsningen blev leveret over en 10-s periode i et volumen på 65 μl. I hele infusionsperioden blev der tændt et hvidt stimuluslys lige over det aktive håndtag, og der blev registreret yderligere reaktioner i dette tidsrum, men de resulterede ikke i en genaktivering af pumpen. Hvert selvadministrationskammer var udstyret til at afgive konstantstrøms, intermitterende, uundgåelige, elektriske fodstød gennem en scrambler til gittergulvet (Grason-Stadler Generator #E1064GS eller Med Associates). Fodchokket blev givet i 15 minutter i henhold til en variabel tidsplan med et gennemsnitligt interval på 40 sekunder (10-70 sekunders interval). Hvert stød (0,6 mA) var af en varighed på 0,5 sekunder. Denne intensitet af fodstød er blevet fundet ved hjælp af vores apparat at være den minimale, der kræves for at inducere pålidelig reinstatement.

Narkotika

Cokain HCl blev opnået fra BDH Chemicals (Toronto, Canada) og blev opløst i fysiologisk saltvand. Clonidin HCl blev købt hos Sigma (St Louis, MO) og blev opløst i fysiologisk saltvand og injiceret i.p. (0, 20 og 40 μg/kg).

Procedure

Fase 1: Træning. Rotter blev trænet til selv at administrere kokain HCl (0,5 mg/kg/infusion, i.v.) efter en fast forhold-1-skema for forstærkning i løbet af en daglig 3-timers selvadministrationssession. Hver dag blev halvdelen af dyrene bragt til operantkamrene til deres selvadministrationssession om morgenen, ca. tre timer efter at lyset var slukket, og halvdelen af dyrene blev bragt til kamrene om eftermiddagen, ca. syv timer efter at lyset var slukket. Den gruppe af dyr, der blev tildelt morgen- og eftermiddagssessionerne, skiftedes dagligt ud, således at alle dyr ved afslutningen af træningen havde modtaget lige mange selvadministrationssessioner på begge tidspunkter. Det var vigtigt, at alle dyr havde samme erfaring med selvadministration tidligt og sent på dagen, da alle dyr i fase 2 modtog udryddelsessessioner om morgenen efterfulgt af en testsession, der typisk fandt sted om eftermiddagen. I begyndelsen af hver session blev der tændt et rødt huslys i 10 sekunder, før det optrækkelige håndtag blev indført i buret. Lyset lige over den aktive håndtag blev tændt i de første 30 sekunder efter præsentationen af håndtaget. Huslyset forblev tændt under hele sessionen. Som tidligere angivet resulterede reaktioner på den aktive håndtag i aktivering af infusionspumpen og belysning af lyset over håndtaget i de 10 sekunder, hvor der blev givet medicin. Yderligere tryk på håndtaget i løbet af lægemiddelafgivelsesperioden blev registreret, men resulterede ikke i en genaktivering af pumpen. Træningsbetingelserne var gældende i 10 til 12 dage. Ved afslutningen af træningen blev dyrene efterladt uforstyrret i kolonirummet i 7 til 13 dage. Derefter fandt udryddelse og test sted. I dette forsøg og i forsøg 3B blev grupper af dyr tildelt forskellige doser af testlægemidlerne. Alle dyr i hver gruppe blev derefter udsat for tre testbetingelser; saltvand, kokain og fodchok.

Fase 2: Udryddelse og testning. Under udslettelse og testning, som fandt sted over fire på hinanden følgende dage, var dyrene opstaldet 24 timer om dagen i selvadministrationskamrene. Mad og vand var frit tilgængeligt for dyrene, undtagen under de daglige ekstinktions- og testsessioner. Dyrene blev bragt til kamrene om aftenen forud for den første dag med ekstinktion og testning. Da der blev kørt to separate grupper af rotter hver dag i træningsfasen, blev den ene gruppe af dyr testet i de første fire dage af fase 2, og den anden gruppe af dyr blev testet i de næste fire dage. Under udryddelse og testning blev alle de betingelser, der var til stede under træningen, opretholdt, bortset fra, at håndtagspres ikke resulterede i kokaininfusioner.

I dette og alle efterfølgende genindsættelsesforsøg fik dyrene flere daglige 1-timers udryddelsessessioner adskilt af mellemliggende perioder, hvor håndtaget blev trukket tilbage. På dag 1 fik dyrene fire udryddelsessessioner; på dag 2-4 fik dyrene to til tre udryddelsessessioner, der var tilstrækkelige til at etablere et baseline-reaktionsniveau på 15 eller færre reaktioner i løbet af en time, efterfulgt af en 180 min test session. Varigheden af de mellemliggende perioder blev holdt konstant for hvert forsøg og svarede til den forsinkelse, der var nødvendig for lægemiddelabsorption mellem forbehandlingsinjektionerne og starten af testen. I det foreliggende forsøg var varigheden af de mellemliggende perioder 40 min.

I testen blev separate grupper af dyr forbehandlet med enten 0, 20 eller 40 μg/kg, i.p., clonidin før hver af de tre test for genindførelse (saltvand, kokain og fodchok), givet på på hinanden følgende dage og i en kontrabalanceret rækkefølge. Clonidin blev injiceret 40 min. før løftestangen blev indsat. Til priming-testene med saltvand og kokain fik dyrene en ikke-kontingent, i.p., injektion af saltvand eller kokain (20 mg/kg) 5 min. før indsættelse af løftestangen. Til fodchokforsøgene blev dyrene udsat for 15 minutters kort intermitterende fodchokstress umiddelbart før indsættelse af løftestangen. Test sessionerne varede 3 timer. Kokaindosis og fodchokparametre blev valgt på grundlag af tidligere arbejde fra dette laboratorium (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). Dosiserne af clonidin blev valgt på grundlag af reinstatement-forsøg, som vi har udført med herointrænede rotter (Shaham et al. 2000).

Forskning 3A: Effekter af lofexidin på høje responsrater for saccharose

Da den farmakologiske profil for lofexidin ikke er blevet så godt karakteriseret som den for clonidin, blev der udført et forsøg for at fastslå, om og ved hvilke doser lofexidin inducerer præstationsunderskud. Doserne i testene for reinstatement blev valgt på grundlag af de resultater, der blev opnået i dette forsøg.

Forsøgspersoner

Forsøgspersonerne var 8 han-lang-Evans rotter (Charles River, Quebec) med en vægt på 400-550 g ved forsøgets begyndelse. Rotter blev tidligere brugt i et eksperiment, der havde til formål at studere fodchokinduceret genindførelse af saccharose-søgning (Buczek et al. 1999). Dyrene blev opretholdt under lignende forhold som dem, der er beskrevet i forsøg 1.

Apparatur

Hvert selvadministrationskammer var udstyret med to stationære håndtag, symmetrisk centreret på et sidepanel, 5 cm over gulvet. Reaktioner på det ene håndtag, det “aktive” håndtag, aktiverede en pumpe (Razel Sci. Stamford, CT). Reaktioner på det andet håndtag, det “dummy”-håndtag, blev registreret, men var uden konsekvens. Aktivering af pumpen resulterede i en 20-sekunders levering af 0,18 ml saccharoseopløsning til en beholder til flydende dråber, der var placeret mellem de to håndtag. I hele saccharoseafgivelsesperioden blev der tændt et hvidt stimuluslys lige over det aktive håndtag, og yderligere reaktioner i denne periode blev registreret, men resulterede ikke i reaktivering af pumpen.

Narkotika

Lofexidine HCl blev generøst stillet til rådighed af Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., Storbritannien. Lægemidlet blev opløst i fysiologisk saltvand og injiceret i.p. (0, 80, 120, 160 eller 200 μg/kg).

Procedure

Dyr, der tidligere havde lært at selvadministrere saccharose i en anden undersøgelse (Buczek et al. 1999), fik efterfølgende fem sessioner over fem på hinanden følgende dage, hvor de selvadministrerede en 30 % saccharoseopløsning efter en FR-1-skema. I efterfølgende daglige sessioner blev dyrene injiceret med enten vehikel (0 μg/kg) eller lofexidin (80, 120, 160 eller 200 μg/kg, i.p.) 60 min. før starten af selvadministrationssessionen. Alle dyr fik alle doser lofexidin i en modbalanceret rækkefølge; den højeste dosis lofexidin blev testet to gange. Hver session, hvor dyrene blev behandlet med lofexidin, blev efterfulgt af en saltvandsforbehandlingssession for at minimere muligheden for overførselsvirkninger af lægemidlet.

Forskning 3B: Virkninger af lofexidin på fodstød- og kokaininduceret genindførelse

Emner

Eksperimentet var 49 han-lang-Evans rotter (34 fra Charles River, Quebec; 15 fra Harlan Sprague Dawley, USA), der vejede 350-400 g i begyndelsen af forsøget. Dyrene blev holdt som beskrevet i forsøg 1. Der var ingen åbenlyse forskelle i responsen mellem dyr fra de to leverandører i nogen fase af forsøget.

Procedure

Fase 1: Træning. Dyrene blev trænet til selv at indgive kokain under de betingelser, der er beskrevet i forsøg 2.

Fase 2: Udryddelse og testning. I dette forsøg var de mellemliggende perioder, som beskrevet ovenfor, af en varighed på 60 min. Ved testen blev separate grupper af dyr forbehandlet med enten 0, 50, 100, 150 eller 200 μg/kg, i.p., lofexidin før hver af de tre test for genindførelse (saltvand, kokain og fodchokstress), der blev givet på på hinanden følgende dage og i en kontrabalanceret rækkefølge (se forsøg 2). Lofexidin blev injiceret 60 minutter før indsættelse af løftestangen. Forsøgssessionerne var af 3 timers varighed. Lofexidin-doserne blev valgt på grundlag af de resultater, der blev opnået i eksperiment 3A.

Eksperiment 4: Virkninger af Guanabenz på fodchok- og kokaininduceret genindførelse

Forsøgspersoner

Forsøgspersonerne var 18 han-lang-Evans rotter (Charles River, Quebec), der vejede 350-400 g ved forsøgets begyndelse. Dyrene blev opretholdt som beskrevet i forsøg 1.

Lægemiddel

Guanabenz blev købt fra Sigma (St Louis, MO) og blev opløst i fysiologisk saltvand og injiceret i.p. (0, og 640 μg/kg).

Procedure

Fase 1: Træning. Dyrene blev trænet til selv at indgive kokain under de betingelser, der er beskrevet i forsøg 2.

Fase 2: Udryddelse og testning. I dette forsøg var de mellemliggende perioder, som beskrevet ovenfor, af en varighed på 60 min. Ved testen blev dyrene forbehandlet med 0 eller 640 μg/kg guanabenz, i.p., før hver af de to test for genindførelse (ingen fodchok, fodchok eller saltvand, kokain), der blev givet på på hinanden følgende dage (se forsøg 2). Guanabenz blev injiceret 60 min. før indsættelse af løftestangen. Prøvesessionerne var af 3 timers varighed. Guanabenzdosis blev valgt på grundlag af dens substituerbarhed for 40 μg/kg clonidin i en lægemiddeldiskriminationsprocedure (Bennett og Lal 1982).

Statistiske analyser

Mikrodialysedata blev analyseret ved hjælp af en blandet faktor ANOVA for koncentration af ekstracellulær NE i 20 min dialyseprøver; mellem-subjekt-faktoren var dosis af clonidin (0, 20, 40 μg/kg), lofexidin (0, 75 eller 150 μg/kg) eller guanabenz (0 eller 640 μg/kg), og den gentagne foranstaltning var tid. Signifikante interaktioner mellem tid og dosis blev underkastet envejs ANOVA’er for faktoren dosis på specifikke tidspunkter. Hvor det var relevant, blev der udført post hoc-tests (Fisher’s LSD, p < .05) for at sammenligne vehikel (0 μg/kg) med lægemiddelbetingelser.

De to afhængige mål i testene for genindførelse var antallet af reaktioner på den aktive løftestang (infusioner + time out-reaktioner) og antallet af reaktioner på den inaktive løftestang i løbet af tre timer. Alle adfærdsdata er præsenteret som gennemsnit ± SEM. På grund af den betydelige variabilitet i antallet af reaktioner i de forskellige test for genindførelse blev de ikke-parametriske statistikker for relaterede (Friedman og Wilcoxon) og ikke-relaterede (Kruskal-Wallis og Mann-Whiney) stikprøver anvendt, hvor det var relevant.

For saccharoseundersøgelsen (forsøg 3A) var de afhængige mål antallet af reaktioner på de aktive (forstærkede + timeout-reaktioner) og inaktive håndtag og antallet af opnåede forstærkninger. ANOVA’er med gentagne foranstaltninger blev udført med dosis som den indenfor-subjekt-faktor. Når det var relevant, blev der udført post hoc-tests (Fisher’s LSD, p < .05) for at sammenligne vehikel (0 μg/kg) med lægemiddelbetingelser.