Ammoniumsulfat Proteinudfældning: Nøglen til Salting-Out

Saltudfældning kan være et meget effektivt redskab til at rense proteiner ved udfældning. Ammoniumsulfat er normalt det foretrukne salt, da det er billigt, meget opløseligt i vand og er i stand til at blive meget mere hydreret (interagerer med flere vandmolekyler) end næsten alle andre ioniske opløsningsmidler. I praksis tilsættes ammoniumsulfat enten direkte som et fast stof eller som en (normalt) mættet opløsning for at udfælde de ønskede proteiner.

Ved lave saltkoncentrationer (<0,15 M) har tilsætning af mere salt generelt en tendens til at øge proteiners opløselighed, da ionerne afskærmer proteinmolekylerne fra andre molekylers ladninger; denne tendens kaldes “saltning”. På et tidspunkt bliver ionstyrken for høj og begynder at have en negativ indvirkning på proteinernes opløselighed, hvilket kaldes “salting-out”. Dette sker, fordi det opløste salt konkurrerer med proteinerne om de knappe vandmolekyler, hvilket øger vandets overfladespænding og derfor får proteinet til at folde sig tættere sammen. Reduktionen i proteinets overfladeareal betyder færre protein-vand-interaktioner, hvilket giver mulighed for flere hydrofobiske interaktioner mellem proteinmolekyler, hvilket forårsager aggregering og efterfølgende udfældning.

Proteiner i opløsning kan også fraktioneres ud, da de vil udfælde som funktion af saltkoncentrationen. På denne måde er det muligt at rense specifikke proteiner ved at tilsætte en bestemt mængde ammoniumsulfat for at udfælde ikke ønskelige proteiner, genvinde supernatanten og derefter tilsætte lidt mere ammoniumsulfat for at udfælde det ønskede protein og derefter gemme denne pellet af udfældet protein. Da saltudfældning kun påvirker proteinernes opløselighed og ikke denaturerer dem, kan den genvundne fraktion opbevares i saltopløsningen i længere tid uden at skulle bekymre sig om bakteriel kontaminering, da det høje saltindhold hæmmer enhver mikrobiel vækst eller proteaseaktivitet.

Da ammoniumsulfatudfældning kun reducerer proteinernes opløselighed og ikke denaturerer dem, kan proteinerne koncentreres ved at fjerne den resterende ammoniumsulfatopløsning, hvorefter proteinpelleten kan resolubiliseres i standardbuffere eller en lavere koncentration af ammoniumsulfat. Derefter kan hydrofobe interaktionskromatografi eller gelfiltreringskromatografi anvendes til yderligere rensning af proteinopløsningen. Ammoniumsulfat kan også bruges til at lede nogle proteiner, der er udfoldet af denatureringsmidler som f.eks. urinstof, tilbage til deres korrekte native konformationer ved gradvist at øge koncentrationen af ammoniumsulfat.

Der er nogle bedste fremgangsmåder, der bør overvejes, når man arbejder med ammoniumsulfat, f.eks.:

• Brug en morter og en stødpind til at bryde klumper op og på anden måde male ammoniumsulfatet for at lette tilsætningen og opløsningen.
• Før kun en lille mængde ammoniumsulfat ad gangen, vent på, at det opløses, og rør forsigtigt rundt for at undgå skumdannelse.
• Brug en buffer som f.eks. 50 mM HEPES eller Tris for at minimere ammoniumsulfatets forsurende karakter.
• Brug ammoniumsulfat af analytisk kvalitet, da lavere kvaliteter typisk udviser forurening med tungmetaller.

Processen med saltudfældning er forbundet med nogle ulemper. Saltudfældning af proteiner kræver forudgående kendskab til proteinets opløselighed. Desuden kan eventuelle forurenende stoffer, der er til stede i den oprindelige prøve, stadig være til stede i den fraktion, der indeholder det pågældende protein; denne proces koncentrerer proteinet, men renser det ikke. Desuden kan det være nødvendigt at fjerne saltet fra proteinprøven, og der vil derfor være behov for yderligere behandling i form af enten dialyse eller kromatografi.

Relaterede blogindlæg

• Hvilke proteinudfældningsteknikker anvendes til koncentrering og rensning?
• Planteproteinekstraktion og proteinudfældningsteknikker