AmpR øger virulensen af carbapenem-resistente Klebsiella pneumoniae ved at regulere det indledende trin i kapsel-syntesen

Indledning

Klassisk K. pneumoniae (cKp) og hypervirulent K. pneumoniae (hvKp) er to globale K. pneumoniae-patotyper, der er i omløb i øjeblikket1,2 . I Nordamerika og Europa er de fleste K. pneumoniae-infektioner forårsaget af cKp-isolater, som oftest er opportunistiske patogener, der primært forårsager infektioner i sundhedsvæsenet hos immunsvækkede værter. Det mest problematiske træk ved denne patotype er evnen til at erhverve et stigende antal elementer, der giver antimikrobiel resistens. Carbapenem-resistent K. pneumoniae (CRKP), der er associeret med plasmidkodede carbapenemaser, udgør særlige kliniske udfordringer og giver invasive infektioner med høj dødelighed.3,4

Rapporter fra Taiwan beskrev et unikt klinisk syndrom af samfundserhvervet, vævsinvasiv K. pneumoniae-infektion hos raske personer, der ofte blev præsenteret på flere steder eller efterfølgende spredte sig, herunder pyogene leverabscesser.5,6 hvKp blev betegnet for at skelne denne patotype fra cKp, og forekomsten af infektioner forårsaget af hvKp har været støt stigende i løbet af de sidste tre årtier i lande i Asien og Stillehavet.7-11 hvKp er normalt modtagelig over for antimikrobielle stoffer, men den har vist sig at være resistent, og der blev endda rapporteret om et ekstensivt lægemiddelresistent (XDR) cKp-isolat, som erhvervede en del af et hvKp-virulensplasmid, der forårsagede et dødeligt nosokomielt udbrud.12-15

En egenskab, der oprindeligt blev anset for at være følsom og specifik for hvKp-isolater, var en hypermucovisk fænotype, som blev defineret ved en positiv strengtest.16 Det skabte imidlertid en vis forvirring, da ikke alle hvKp-isolater blev bestemt som værende hypermucovisk, og nogle cKp-isolater besad denne egenskab.17 For nylig er det blevet vist, at flere biomarkører, herunder peg-344, iroB, iucA, plasmidkodet rmpA og rmpA2 og kvantitativ sideroferproduktion, præcist kan forudsige hvKp-isolater; disse biomarkører kunne bruges til at udvikle en diagnostisk test til brug for kliniske laboratorier med henblik på optimal patientbehandling og til brug i epidemiologisk overvågning og forskning.18 I denne undersøgelse identificerede vi imidlertid en ny gruppe af ikke-hypermucoviskøse CRKP-isolater, der mangler de fleste hvKp-specifikke gener. En pan-genomviddeassocieringsundersøgelse (Pan-GWAS), proteomanalyse og virulensprøve i en dyremodel viste, at AmpR øger virulensen hos disse isolater ved at regulere initieringen af kapsel-syntese. Desuden fandt vi også, at ampR båret af K-locus 47 (KL47) stammer i denne undersøgelse ikke var i stand til at øge virulensen af KL1 hypermucoviscous K. pneumoniae.

Materialer og metoder

Kliniske isolater og dataindsamling

Non-repetitive kliniske K. pneumoniae isolater blev indsamlet fra rutinemæssigt påviste og opbevarede prøver fra 5 hospitalers afdeling for laboratoriemedicin i Guangdong og Anhui-provinserne mellem 2018 og 2019. Alle isolater blev opbevaret ved -80°C før brug. Der blev indhentet kliniske oplysninger om patienterne. Artsidentifikation og antimikrobiel følsomhedstest blev udført med VITEK-2 compact-systemet (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Frankrig). Resultaterne blev fortolket i overensstemmelse med de retningslinjer, der er offentliggjort af Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; dokument M100-S26).19 De identificerede arter af alle isolater blev bekræftet ved hjælp af matrixassisteret laserdesorption/ioniseringsmassespektrometri (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Frankrig). CRKP blev defineret som resistent over for imipenem eller meropenem.

Hypermucovisk fænotypisk karakterisering

For at identificere den hypermucoviske fænotype med snoretestet blev isolater inokuleret på agarplader indeholdende 5 % fåreblod og inkuberet ved 37 °C natten over. String-testen blev anset for positiv, når der kunne genereres en tyktflydende streng længere end 5 mm ved at berøre en enkelt koloni med en standard inokulationssløjfe og trække kolonien opad.2

Hele-genom-sekventering (WGS)

Et kulturvolumen på 1 mL (optisk tæthed ved 600 nm på 0,6) blev anvendt til ekstraktion af genomisk DNA (gDNA) (Sangon, Shanghai, Kina). gDNA blev sekventeret på en Illumina HiSeq 2500-sekventeringsmaskine (Illumina, San Diego, CA, USA) ved hjælp af parvis afsluttede 150-bp-reads. Genome assembler blev udført ved hjælp af de novo SPAdes Genome Assembler (version 3.12.0).20 Vi udførte kapseltypning på de assemblerede sekvenser med Kaptive (version 0.5.1).21 Antimikrobielle resistensgener og virulensfaktorer blev identificeret i isolaterne ved at scanne genomets contigs mod ResFinder- og VFDB-databaserne ved hjælp af ABRicate (version 0.8.7). Multilocus-sekvenstypebestemmelse (MLST) og core genome MLST (cgMLST) genotypebestemmelsesanalyse blev udført med Ridom SeqSphere+ (version 5.1.0).22 Kompleks type (CT) blev defineret ved at følge K. pneumoniae cgMLST-skemaet (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). Opbygning af fylogenetiske træer baseret på enkeltnukleotidvarianter (SNV’er) i kernegenomet blev udført ved hjælp af Harvest-suite (version 1.2) med en 1000-bootstrap-test.23 Onlineværktøjet iTOL blev anvendt til at vise, manipulere og annotere det fylogenetiske træ.24 Vi annoterede genomsekvenserne med Prokka (version 1.13.3).25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

Vi brugte pan-genom-pipelinen Roary (version 3.12.0) til at lægge annoterede assemblies i GFF3-format (produceret af Prokka) og beregnede pan-genomet.26 Vi brugte Scoary (version 1.6.16) til at tage filen fra “https://sanger-pathogens.github.io/Roary/”, oprettede en egenskabsfil og beregnede associationerne mellem alle generne i det accessoriske genom og egenskaberne. Vi rapporterede en liste over gener sorteret efter styrke af association med P-værdi < 0,01 justeret med Benjamini-Hochbergs metode til korrektion af flere sammenligninger.27

Proteomanalyse

Et kulturvolumen på 1 mL (optisk tæthed ved 600 nm på 0,6) blev anvendt til proteinekstraktion. Prøven blev soniceret tre gange på is ved hjælp af en højintensiv ultrasonisk processor (Scientz) i lysisbuffer (8 M urea, 1 % proteaseinhibitorcocktail). Det resterende affald blev fjernet ved centrifugering ved 12 000 g ved 4 °C i 10 minutter. Endelig blev supernatanten opsamlet, og proteinkoncentrationen blev bestemt med et BCA-kit i henhold til producentens anvisninger. Til fordøjelsen blev proteinopløsningen reduceret med 5 mM dithiothreitol i 30 min. ved 56 °C og alkyleret med 11 mM iodoacetamid i 15 min. ved stuetemperatur i mørke. Proteinprøven blev derefter fortyndet ved at tilsætte 100 mM TEAB med urea i en koncentration på mindre end 2 M. Endelig blev der tilsat trypsin i forholdet 1:50 trypsin til proteinmasse til den første fordøjelse natten over og et forhold 1:100 trypsin til proteinmasse til en anden 4 timers fordøjelse. De tryptiske peptider blev opløst i 0,1 % myresyre (opløsningsmiddel A) og direkte indlæst på en hjemmelavet analytisk kolonne med omvendt fase (15 cm længde, 75 μm i.d.). Gradienten blev udført som følger: en stigning fra 6 % til 23 % opløsningsmiddel B (0,1 % myresyre i 98 % acetonitril) i løbet af 26 min, en stigning fra 23 % til 35 % opløsningsmiddel B i 8 min, en stigning til 80 % opløsningsmiddel B i 3 min og fastholdelse ved 80 % opløsningsmiddel B i de sidste 3 min ved en konstant strømningshastighed på 400 nL/min på et EASY-nLC 1000 UPLC-system. Peptiderne blev underkastet NSI-kilde efterfulgt af tandem-massespektrometri (MS/MS) i Q ExactiveTM Plus (Thermo), der er online koblet til UPLC-systemet. Den anvendte elektrospray-spænding var 2,0 kV. M/z-scanningsområdet var 350 til 1800 for fuld scanning, og intakte peptider blev detekteret i Orbitrap-systemet med en opløsning på 70 000. Peptiderne blev derefter udvalgt til MS/MS ved hjælp af NCE-indstillingen 28, og fragmenterne blev detekteret i Orbitrap ved en opløsning på 17.500. Den dataafhængige procedure vekslede mellem en MS-scanning efterfulgt af 20 MS/MS-scanninger med 15,0 s dynamisk udelukkelse. Den automatiske forstærkningskontrol (AGC) blev indstillet til 5E4. Den faste første masse blev indstillet til 100 m/z. De resulterende MS/MS-data blev behandlet ved hjælp af MaxQuant-søgemaskinen (v.1.5.2.8). Vi brugte InterProScan (version 5.37-76.0) til at annotere proteindomæner. En korrigeret p-værdi < 0,05 og en foldændring > 1,2 blev betragtet som signifikant.

Konstruktion af ampR-komplementmutanten

K. pneumonia ampR (Supplerende materialer) blev syntetiseret og flankeret med 5ʹXbaI- og 3ʹHindIII-restriktionssteder. Dette fragment blev restriktionsdigeteret og klonet ind i pUC57. Rekombinant DNA blev genvundet i Escherichia coli DH5α med ampicillinselektion. Efter restriktionsfordøjelsen blev ampR-fragmentet ligeret til pBAD33-ekspressionsvektoren (Invitrogen) i henhold til producentens anvisninger. pBAD33-ampR blev anvendt til transformation ved hjælp af elektroporation som standard for laboratorieisolerede E. coli. AmpR-komplementstammerne blev bekræftet ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) (tabel S1). Ekspressionen af ampR blev induceret ved at tilsætte 100 μg/mL arabinose.

Mouse Pulmonary Infection Models

En lungebetændelsesmodel af K. pneumoniae i mus blev anvendt til at teste isolaternes virulens. Seks til otte uger gamle BALB/c-hunmus af hunkøn under specifik patogenfri kvalitet blev indkøbt fra Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. Musene blev bedøvet intraperitonealt med pentobarbital natrium (75 mg/kg) og inokuleret med 1,0 × 107 kolonidannende enheder (CFU) af K. pneumoniae ved ikke-invasiv intratracheal instillation under direkte udsyn. Musenes overlevelse blev observeret i 7 dage efter infektionen. For at vurdere bakteriebyrden i lungerne blev organerne fra inficerede mus homogeniseret og opløst i 1 mL fosfatbufferopløsning (PBS); 50 μL blev inokuleret på agarplader med flydende bouillon (LB), og CFU-tælling blev udført. Til histopatologisk analyse blev segmenter af lungerne fikseret med 10 % neutral formalin, indlejret i paraffin og farvet med hæmatoxylin og eosin til visualisering ved lysmikroskopi. Bakteriel byrde og histopatologisk analyse blev udført efter 24 timers infektion.

Ekstraktion og kvantificering af kapselpolysaccharid

Kapselpolysaccharider blev ekstraheret med Zwittergent 3-14 detergent. Mængden af uronsyre blev derefter målt i henhold til den tidligere beskrevne metode.28 Parallelt hermed blev serielle fortyndinger af bakteriekulturen udplottet for at bestemme antallet af CFU, og koncentrationen af kapselpolysaccharid blev udtrykt i henhold til mængden af glucuronsyre (μg) for 109 CFU/mL af prøven. Hvert forsøg blev udført i tre eksemplarer.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism software version 8 (La Jolla, Californien).

Resultater

Isolatkarakteristika

Non-repetitive CRKP (n = 135) isolater blev anvendt i denne undersøgelse. Alle isolater var af sekvenstype 11 (ST11) og udtrykte K. pneumoniae carbapenemase (KPC-2), og 1 isolat bar både OXA-23 og KPC-2 (figur S1). Isolaterne blev henført til 16 CT’er ved hjælp af cgMLST-ordningen. De mest almindelige CT’er var CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13) og CT2410 (n = 11), efterfulgt af 11 andre CT’er, der hver blev identificeret i mindre end 10 isolater (figur 1). Alle isolater blev henført til to KL-typer, KL64 (n = 86) og KL47 (n = 49) (figur S2). Der blev ikke fundet nogen hypermucoviskøse isolater. Virulensgenanalysen viste, at ingen isolater, der bar alle biomarkører til differentiering af hvKp- og cKp-isolater, var blevet rapporteret tidligere (Figur 1, Figur S2).18

Figur 1 Fylogenetisk analyse af 135 isolater i denne undersøgelse. De forskellige CT-typeisolaternes grene er vist med farver. De tilsvarende isolater af hver CT-type er CT1291 (P1291-1 til P1291-20), CT1313 (P1313-1 til P1313-33, AH1313-1 til AH1313-2), CT1689 (AH1689-1 til AH1689-8), CT1772 (AH1772-1 til AH1772-4), CT1814 (AH1814-1 til AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (P2405-1 til P2405-9), CT2410 (P2410-1 til P2410-11), CT2418 (P2418-1 til P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (P2445-1 til P2445-6), CT3175 (AH3175-1 til AH3175-2), CT3176 (AH3176-1 til AH3176-14), CT3178 (AH3178-1 til AH3178-4), CT3179 (AH3179-1 til AH3179-2) og CT3195 (AH3195). rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 og iucA blev identificeret til differentiering af hypervirulente K. pneumoniae fra klassiske K. pneumoniae i en tidligere undersøgelse18 .

Klinisk dataanalyse

Der var ingen signifikante forskelle mellem CT’erne med hensyn til demografi, infektionstyper, hovedkomorbiditeter, invasive operationer, Charlson-komorbiditetsindeks og Pitt-bakteriæmi-score, bortset fra centralt venekateter, og alle årsager til dødelighed på hospitalet (P = 0,035 og P = 0,001, Fisher’s eksakte test). Patienter inficeret med CT3176 havde signifikant højere dødelighed (78,6 % vs 37,1 %, P = 0,012; 78,6 % vs 20,0 %, P = 0,001; 78,6 % vs 7,7 %, P = 0,0003; 78,6 % vs 31,0 %, P = 0,004; Fisher’s exact test) sammenlignet med henholdsvis CT1313-, CT1291-, CT1814- og de andre CT-grupper. Udnyttelsen af centrale venekatetre i CT1814 var signifikant højere end i CT1313 og CT1291 (84,6 % vs 51,4 %, P = 0,049; 84,6 % vs 35,0 %, P = 0,011, Fisher’s exact test) (Tabel 1).

Tabel 1 Demografiske oplysninger, komorbiditeter, Invasive procedurer og dødelighed hos patienter med carbapenemresistente Klebsiella pneumoniae-infektioner

Pan-GWAS-analyse

For at identificere det genetiske grundlag for CT3176 udførte vi en Pan-GWAS-analyse mellem CT3176- og ikke-CT3176-grupperne. Vi identificerede 39 gener med kendte funktioner, der er forbundet med CT3176 (P < 0,01 justeret med Benjamini-Hochbergs metode) (Figur 2), herunder virulensfaktorer, kapsel-syntesegener, antimikrobielle resistensgener og multidrug efflux-transportører. Blandt dem havde ampR den største association med CT3176. Vi bemærkede imidlertid, at andre CT’er, såsom CT3178 og nogle CT1689-isolater (AH1689-2 og AH1689-6), også bar ampR-genet (figur 1). Alle isolater, der bærer ampR-genet, tilhører KL47.

Figur 2 Pan-GWAS-analyse mellem CT3176- og ikke-CT3176-grupperne. Pangenome og associationer blev beregnet med Roary og Scoary. Et plotkort blev genereret med ggplot2.

Proteomanalyse

Tre ampR+- (AH3176-1, AH3178-1 og AH1689-2) og tre ampR- (AH1689-3, AH1689-4 og AH1689-5) isolater blev udvalgt til proteomanalyse. Der blev identificeret i alt 3093 proteiner i begge grupper på grundlag af 36 727 unikke peptider. Endelig identificerede vi 24 differentielt udtrykte proteiner (DEP’er). Blandt dem blev 15 opreguleret og 9 nedreguleret i ampR+-isolaterne sammenlignet med ampR-isolaterne (figur 3A-C, tabel S2). WcaJ havde den højeste foldændring og blev derfor fremhævet.

Figur 3 Proteomanalyse og kapselfarvning. (A) Volcano plot, der viser sammenligningen af kvantitativ proteinekspression mellem ampR+ (AH1689-2, AH3176-1 og AH3178-1) og ampR- (AH1689-3, AH1689-4 og AH1689-5) Klebsiella pneumoniae-isolater. (B, C) Differentielt udtrykte proteiner med en foldændring over 1,2 er markeret med farve.

Virulens i dyremodeller og kvantificering af kapsel

Med henblik på at identificere ampR’s rolle i virulensen af ikke-hypermucoviskøse CRKP-isolater udvalgte vi tre isolater (AH3176-1, AH1689-2 og AH1689-3) og testede virulensen i en musemodel. AH3176-1 og AH1689-2 var to ampR+-isolater, mens AH1689-3 var et ampR-isolat (figur 1). Desuden udvalgte vi også to hypermucoviscøse stammer GM2 og GM6 fra vores samling for at teste virulensen. Både GM2 og GM6 hører til KL1, hvoraf GM6 bærer ampR-genet, mens GM2 ikke gør det. AmpR-sekvensen af den ikke-hypermucoviscøse KL47-stamme var imidlertid forskellig fra den hypermucoviscøse KL1-stamme, og derfor blev de i denne undersøgelse benævnt henholdsvis ampRKL1 og ampRKL47.

Som vist i figur 4A havde AH3176-1 og AH1689-3:ampRKL47 plus arabinose en overlevelse på 0 % med et inokulum på 1 × 107 kolonidannende enheder (CFU) ved 4 d efter infektion, mens 20 % overlevelse med AH1689-2, 40 % overlevelse med AH1689-3:ampRKL47 uden arabinose, 60 % overlevelse med AH1689-3:pBAD33 og ATCC70721 og 80 % overlevelse med AH1698-3 blev observeret 7 d efter infektion. Overlevelsesraten var signifikant nedsat efter komplementering med ampRKL47-genet i AH1689-3 (n = 10; P = 0,033, log-rank Mantel-Cox-test), hvilket tyder på den vigtige rolle, som ampR spiller for virulens. Infektion af mus med AH3176-1 resulterede i ca. 10-100 gange højere CFU i lungerne sammenlignet med andre isolater (Figur 4B). Patologien i lungerne viste varierende grader af alveolær vægfortykkelse, lymfocytinfiltration og intravaskulær blødning i infektionsgruppen. Blandt dem var de lungepatologiske ændringer forårsaget af AH3176-1 de mest alvorlige, der præsenterede sig som omfattende lungekonsolidering og intraalveolær blødning (figur 4D-F).

Figur 4 Virulenspotentiale af ikke-hypermucoviscøse Klebsiella pneumoniae-isolater i en lungeinfektionsmodel hos mus. (A) Effekten af 1 × 107 kolonidannende enheder (CFU) af AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 og AH1689-3 ampRKL47-komplementmutant på overlevelsen blev vurderet. (B) 24 timer efter infektion (hpi) blev lungerne af inficerede mus høstet, og den bakterielle byrde blev bestemt ved CFU-tælling (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, envejs ANOVA). Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. (C) Uroninsyreproduktion af forskellige stammer. Der blev udført en uparret tosidet Student’s t-test. Hvert datapunkt blev gentaget tre gange (n = 3). Data præsenteres som gennemsnit ± s.e.m. *P < 0,05, ns = ingen signifikans. Lungerne af mus uden infektion (D) eller inficeret med ATCC700721 (E) og AH3176-1 (F) blev opsamlet og farvet med hæmatoxylin og eosin. Alle billeder er ved ×40 forstørrelse. Skalaer: 250 μM.

Som vist i figur 5A var overlevelsesraten for mus, der var inficeret med GM6, signifikant lavere end for GM2 og ATCC700721. Der blev observeret et fald i overlevelsesraten efter komplementering af ampRKL1 i GM2. Desuden var bakteriel belastning i lungerne hos mus, der var inficeret med GM6, betydeligt højere end hos GM2 og ATCC700721 (figur 5B); HE-farvning viste, at GM6-infektion forårsagede omfattende konsolidering af lungerne og intraalveolær blødning (figur 5E-G). Overlevelsesraten blev dog ikke påvirket, hvis ampRKL47 blev indført i GM2 (figur 5C).

Figur 5 Virulenspotentiale af hypermucoviscøse Klebsiella pneumoniae-isolater i en model for lungeinfektion hos mus. (A) Effekten af 1 × 106 kolonidannende enheder (CFU) af GM2, GM6 og GM2 ampRKL1-komplementmutant GM2 på overlevelse blev vurderet (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, log-rank Mantel-Cox-test),). (B) 24 timer efter infektion (hpi) blev lungerne af inficerede mus høstet, og den bakterielle byrde blev bestemt ved CFU-tælling (n = 10; **P < 0.01, envejs ANOVA). Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. (C) Effekten af 1 × 106 CFU af GM2 og GM2 ampRKL47 komplementmutant på overlevelse blev vurderet. (D) Uroninsyreproduktion af forskellige stammer. Der blev udført en uparret tosidet Student’s t-test. Hvert datapunkt blev gentaget tre gange (n = 3). Data præsenteres som middelværdi ± s.e.m. *P < 0,05, ns = ingen signifikans. Lungerne af mus uden infektion (E) eller inficeret med GM2 (F) og GM6 (G) blev opsamlet og farvet med hæmatoxylin og eosin. Alle billeder er ved ×40 forstørrelse. Skalaer: 250 μM.

Da kapslen er den vigtigste virulensfaktor for K. pneumonia, og WcaJ, som blev fremhævet i henhold til proteomanalyseresultatet regulerer det indledende trin af kapsel-syntesen, undersøgte vi mængderne af kapselpolysaccharidproduktion. Resultatet viste, at de ampR-komplementære stammer AH1689-3:ampRKL47 og GM2:ampRKL1 plus arabinose producerede betydeligt mere kapselpolysaccharid (uronsyre) end henholdsvis AH1689-3 og GM2 (Figur 4C, Figur 5D).

Diskussion

MLST har været den mest almindeligt anvendte teknik til at definere K. pneumoniae-populationer. Med hurtig og økonomisk overkommelig WGS er det muligt at sammenligne hele genomer til isolattypning i stedet for blot nogle få loci, som det er tilfældet i traditionel MLST. Ved genotypning med cgMLST anvendes tusindvis af alleler i hele genomet, hvilket giver en højere grad af isolatdiskriminering. I denne undersøgelse brugte vi cgMLST til at klassificere 135 kliniske CRKP-isolater og fandt forskelle mellem CT-typer baseret på kliniske oplysninger. På grund af det begrænsede antal tilfælde var vi ikke i stand til at opnå en sammenhæng mellem CT-typer og det kliniske resultat. Forskellene i mortalitetsrater gav os dog mulighed for at undersøge isolaterne tilhørende CT3176 yderligere. GWAS-analyse viste, at ampR-genet var signifikant associeret med CT3176-isolaterne.

Fremtidige undersøgelser har vist, at AmpC β-lactamase-regulatoren AmpR, et medlem af LysR-familien af transkriptionsfaktorer, også styrer flere virulensmekanismer i Pseudomonas aeruginosa.29,30 Til dato har kun én artikel rapporteret AmpR’s rolle i reguleringen af virulensen af K. pneumoniae. Et klonalt isolat af K. pneumoniae viste, at kun få kendte virulensgener var ansvarlige for alvorlige infektioner. AmpR i disse isolater var involveret i opregulering af kapsel-syntese, moduleret biofilmdannelse og type 3 fimbrial-genekspression samt kolonisering af murins mave-tarmkanal.31 Virulensniveauet af disse isolater er dog fortsat uklart på grund af manglende data om letale infektionsmodeller. I denne undersøgelse brugte vi en lungebetændelsesmodel til at bekræfte den øgede virulens af disse ampR-bærende isolater. Dette ville forklare, hvorfor patienter, der er inficeret med disse isolater, havde en høj dødelighed.

Tidligere var det almindeligt, at K. pneumoniae af ST11-typen var resistent over for carbapenemer, men ikke hypervirulent. I 2017 blev der imidlertid rapporteret om et udbrud af hospitalsinfektioner forårsaget af ST11 carbapenemresistente hypervirulente K. pneumoniae-isolater af ST11-typen. Disse isolaters hypervirulensfænotype skyldtes erhvervelse af et ca. 170 kbp pLVPK-lignende virulensplasmid af klassiske CRKP-isolater tilhørende ST11 og serotype K47.15 I modsætning til ovenstående rapport blev der ikke fundet nogen virulensplasmider i ST11 CRKP-isolater med øget virulens i denne undersøgelse, hvilket tyder på, at virulensforøgelsen ikke skyldtes den klassiske mekanisme.32 I modsætning til virulensplasmidet, som indeholder flere virulensfaktorer, kan AmpR øge virulensen uafhængigt af hinanden. Dette blev bekræftet ved virulensprøvning af ampR-komplementstammen.

WcaJ er det enzym, der indleder colansyresyntesen og indlæser det første sukker (glukose-1-P) på lipidbæreren undecaprenylphosphat. WcaJ’s potentielle rolle i K. pneumoniaes virulens blev for nylig defineret.33 Resultaterne af proteomanalyse tyder på, at AmpR øger virulensen af K. pneumoniae ved at regulere det indledende trin af kapsel-syntesen. Som regulator skal AmpR binde sig til genpromotoren for at udøve sin regulerende rolle. Hidtil er mange kapseltyper blevet identificeret i K. pneumoniae,34 og fraværet af AmpR-bindingssteder i nogle kapseltyper kan forklare, hvorfor virulensen af KL1-isolater ikke kan forstærkes af den AmpR, der findes i KL47-isolater.

Nyt bevismateriale har antydet, at hypermucoviscositet og hypervirulens er forskellige fænotyper, der ikke bør anvendes synonymt. Desuden er det vigtigt at fastslå, at en negativ string-test ikke er tilstrækkelig til at afgøre, om et isolat er hypervirulent.35 Et vigtigt resultat af vores arbejde var, at vi identificerede ikke-hypermucoviscous ST11 CRKP-subklon med øget virulens.

Den største begrænsning i denne undersøgelse er, at der kun er et lille antal tilfælde; derfor er vi ikke i stand til at undersøge forholdet mellem de kliniske resultater og ikke-hypermucoviscous hypervirulent CRKP-infektion. Vi var heller ikke i stand til at konstruere ampR knockout-stamme, og dette kan forklares ved, at genomisk analyse viste, at ampR putativt var placeret på plasmid (Figur S3). Da stammer med den ikke-hypermucoviskøse fænotype næppe skelnes i klinikken, er der et presserende behov for fortsat overvågning og undersøgelse af disse nye stammer.