Anakinra, en rekombinant human interleukin-1-receptorantagonist, hæmmer apoptose i eksperimentel akut myokardieinfarkt

Akut myokardieinfarkt (AMI) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. AMI skyldes pludselig opstået iskæmi i myokardiet og efterfølgende nekrose. Overlevende med AMI har fortsat en høj risiko for at dø i årene efter indeksbegivenheden. Da behandlingen af AMI er blevet væsentligt forbedret i de seneste år, er der flere patienter, der overlever AMI. Den mest almindelige komplikation efter AMI er venstre ventrikeldysfunktion og hjertesvigt. Den indledende iskæmiske skade på myokardiet aktiverer en kaskade af hændelser, der i sidste ende fører til negativ kardiel remodellering og hjertesvigt med deraf følgende overdreven morbiditet og mortalitet.1 Den remodelleringsproces, der finder sted i det iskæmiske og ikke-iskæmiske myokardium, formidles af opregulering og nedregulering af forskellige veje, der udløser kardiomyocythypertrofi og apoptose i en delikat balance mellem død og overlevelse.1,2 Interleukin-1 (IL-1) receptorantagonist (IL-1Ra), et medlem af IL-1-familien, er et naturligt forekommende antiinflammatorisk protein, der opfører sig som en akutfasereaktant.3,4 Ligesom andre akutfasereaktanter stiger IL-1Ra-niveauerne under AMI, og dets niveauer korrelerer med prognosen.5,6 Den rolle, som den stigende IL-1Ra spiller under AMI, er uklar, og der er blevet spekuleret i, at dens rolle spænder fra blot en skadesmarkør til en modulator af det inflammatoriske respons til et potentielt cytoprotektivt middel.5,8 For nylig har tvungen ekspression af IL-1Ra i en dyremodel vist sig at være kardioprotektiv med hensyn til reduceret infarktstørrelse og apoptose8 .

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi virkningerne af anakinra, et exogent rekombinant humant IL-1Ra, i 2 eksperimentelle modeller ved hjælp af kirurgisk ligering af venstre koronararterie hos gnavere: en undersøgelse af øjeblikkelig anakinra-administration i musemodellen for at vurdere dens virkninger på apoptose, infarktstørrelse og remodellering og en undersøgelse af forsinket (24 timer) administration af anakinra for at vurdere dens virkninger på apoptose uafhængigt af potentielle infarktbesparende virkninger og på kardiel remodellering i rottemodellen (for også at vurdere potentielle forskelle mellem arter). Derudover blev den antiapoptotiske virkning af anakinra testet in vitro.

Metoder

Kirurgiske procedurer

Alle dyr blev leveret af Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind). Alle dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne for human anvendelse og pleje af forsøgsdyr til biomedicinsk forskning, der er offentliggjort af National Institutes of Health (nr. 85-23, revideret 1996). Voksne hanmus fra Institute of Cancer Research (alder 10 uger; vægt 26-38 g) og voksne Wistar-rotter (alder 10 uger; vægt 350-500 g) fik foretaget en koronar ligatur. De kirurgiske procedurer blev udført på dag 1 af 2 dygtige operatører (F.N.S. og S.S.) som tidligere beskrevet.9,10 Dyrene blev under bedøvelse (pentobarbital 50 til 70 mg/kg) intuberet og anbragt i højre decubitus og gennemgik derefter kirurgisk åbning af brystet og ligation af den proximale venstre koronararterie. Otte mus og otte rotter gennemgik en skindoperation, der omfattede alle trin undtagen koronarligation; halvdelen blev behandlet med daglige anakinra-injektioner (1 mg/kg), og den resterende halvdel blev behandlet med saltvandsinjektioner. Institutional Animal Care and Use Committee of Virginia Commonwealth University godkendte undersøgelsen. Ti mus og 4 rotter døde i den umiddelbare postoperative periode og blev ikke medtaget i nogen af analyserne.

Behandling

Der blev gennemført to delundersøgelser: øjeblikkelig anakinra-administration under iskæmi hos musen og forsinket anakinra-administration 24 timer efter iskæmi hos rotten. I musemodellen blev anakinra 1 mg/kg (svarende til den anbefalede dosis til behandling af reumatoid arthritis) givet intraperitonealt under operationen og derefter dagligt i 6 doser til 20 mus (16 med koronar ligation og 4 sham-opererede). I rottemodellen blev anakinra givet intraperitonealt på dag 2 og derefter dagligt i 5 doser til 8 rotter (4 med koronar ligation og 4 sham-opererede). De resterende 24 mus (20 med koronar ligation og 4 sham-opererede) og 12 rotter (8 med koronar ligation og 4 sham-opererede) fik NaCl 0,9 % (saltvand) injiceret. Der blev anvendt to forskellige gnaverarter for at evaluere potentielle forskelle mellem arterne. Yderligere 28 mus blev underkastet en vurdering af infarktstørrelsen 24 timer efter operationen: 6 saltvandsbehandlede mus og 22 mus, der blev behandlet med stigende doser af anakinra (1 mg/kg , 10 mg/kg og 100 mg/kg ) for at vurdere de potentielle dosisafhængige infarktbesparende virkninger af anakinra. Endelig blev yderligere 6 mus (3 behandlet med anakinra og 3 behandlet med saltvand) euthaniseret 7 dage efter koronar ligation til evaluering af matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) ekspression. I alt 78 mus og 20 rotter blev anvendt i denne undersøgelse.

Infarktstørrelsesvurdering

24 timer efter afslutningen af infarktprotokollen blev hjertet hurtigt fjernet og monteret på et Langendorff-apparat. Koronararterierne blev perfunderet med 0,9 % NaCl indeholdende 2,5 mmol/L CaCl2. Efter at blodet var blevet skyllet ud, blev ≈2 mL 10% Evansblåt farvestof injiceret som en bolus i aorta, indtil det meste af hjertet blev blåt. Hjertet blev perfunderet med saltvand for at skylle den overskydende Evans blue ud. Endelig blev hjertet fjernet, frosset ned og skåret i 8 til 10 tværgående skiver af samme tykkelse (≈1 mm) fra apex til base. Skiverne blev derefter inkuberet i en 10% triphenyltetrazoliumchloridopløsning i en isotonisk fosfatbuffer (pH 7,4) ved stuetemperatur i 30 minutter. Arealerne af infarktvæv, risikozonen og hele venstre ventrikel blev bestemt ved computermorfometri med BIOQUANT-billeddannelsessoftware (BIOQUANT Image Analysis Corp, Nashville, Tenn). Infarktstørrelsen blev udtrykt som en procentdel af det iskæmiske risikoområde, der blev bestemt som en procentdel af venstre ventrikel.

Echokardiografi

Transthorakal ekkokardiografi under let anæstesi (pentobarbital 30 til 50 mg/kg) blev udført lige før operationen og 7 dage efter operationen lige før døden. Doppler ekkokardiografi blev udført med Vevo770-billeddannelsessystemet (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) og en 30 MHz-sonde hos musen; et ekkokardiografisystem udstyret med en 15 MHz fase-array transducer (Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif) blev anvendt hos rotten. Transduceren blev anbragt på venstre forreste side af brystkassen. Hjertet blev først afbildet i 2-dimensional tilstand i kort aksevisning af venstre ventrikel. M-mode-cursoren blev placeret vinkelret på den forreste og bageste væg for at måle venstre ventrikels (LV) endediastoliske og endesystoliske diametre (henholdsvis LVEDD og LVESD). I overensstemmelse med anbefalingerne fra American Society of Echocardiography11 blev der derefter taget M-mode-billeder på niveau med papillarmusklerne under mitralklappens spids. I musen blev der også opnået apikale 4- og 5-kammerbilleder for at måle transmitral flow, venstre ventrikels udstrømningshastigheder og transaortiske flowhastigheder. LV-fraktionel forkortelse (FS) blev beregnet på følgende måde: FS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100. Ejektionsfraktionen blev beregnet med Teichholz-formlen. Transmitral- og venstre ventrikeludstrømningskanal-pulsed Doppler-flowspektrer blev opnået fra det apikale syn. Der blev foretaget måling af flowet i udstrømningskanalen. Isovolumetriske kontraktions- (ICT) og afslapningstider (IRT) og ejektionstid (ET) blev målt. LV-udstrømningskanalens (LVOT) flowhastigheds-tids-integral (AoVTI) blev også målt. Disse data blev anvendt til at beregne Tei-indekset (Tei-indeks=ICT+ IRT/ET)12 og cardiac output (CO=AoVTI×π×(LVOT-diameter/2)2×hjertefrekvens, hvor LVOT blev målt som tværsnitsarealet i det parasternale langaksiale billede). Hos mennesker er et højere Tei-indeks forbundet med både systolisk og diastolisk dysfunktion og dårligere resultater12 . Tildelingen til de forskellige behandlinger var tilfældig, og den undersøger, der udførte og aflæste ekkokardiogrammet, var blindet for behandlingen.

Patologi

Dag 7, efter ekkokardiografi og under anæstesi, blev den abdominale aorta kanaliseret med et polyethylen-kateter, thorax blev åbnet, aorta blev fyldt med fosfatbuffer (0,2 mol/L, pH 7,4) og heparin (100 IE), og højre atrium blev skåret for at muliggøre drænage. Hurtigt efter hinanden blev hjertet standset i diastole, og perfusionen med fosfatbufferet formalin blev påbegyndt. Kun hos rotterne blev der udtaget 1 til 2 mL fuldblod fra hjertet til bestemmelse af cytokinplasma. Venstre ventrikelkammer blev fyldt med fiksationsmiddel til en 10-minutters fiksering. Ved afslutningen af proceduren blev der udtaget tværsnit af den midterste tredjedel af venstre ventrikel, som blev opbevaret i formalin i mindst 48 timer. Apoptose blev defineret ved farvning for terminal deoxynucleotidyl transferase-medieret dUTP nick-end-mærkning (TUNEL; DNA-fragmentering, Oncor, Gaithersburg, Md). Den detaljerede protokol blev offentliggjort andetsteds.13 Periinfarktområdet blev defineret som den zone, der grænser op til infarktet, hvor levedygtigt myokardium var fremherskende.13 Den apoptotiske rate blev udtrykt som antallet af apoptotiske kardiomyocytter på alle kardiomyocytter pr. felt. Costaining for TUNEL og muskelaktin (forfortyndet anti-mus α-sarcomerisk actin-antistof, Invitrogen, San Francisco, Calif) blev udført for at dokumentere celletype. Vi betragtede primært apoptose i kardiomyocytter, men målte også apoptose i granulationsvævet (actin-negative mononukleære celler) i infarktområderne.

Tallet af leukocytter i myokardiet blev målt som antallet af CD45+ celler pr. 1 mm2 (ved hjælp af et anti-mus CD45-antistof, 1:100 fortynding, Southern Biotech, Birmingham, Ala) og sammenlignet mellem anakinra- og saltvandsbehandlede AMI-mus. Den apoptotiske rate i periinfarktområderne blev beregnet i 10 tilfældige felter, som dækker næsten hele det periinfarktområde. De investigatorer, der foretog celletællingen, var uvidende om behandlingstildelingen.

Vi målte myokardfibrose 7 dage efter AMI hos musen for at undersøge, om øjeblikkelig brug af anakinra var forbundet med forringet infarktheling. Hjerteafsnit blev farvet med Massons trichromfarvefarver (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo). Kort fortalt blev sektioner bejdset i Bouins opløsning natten over og vasket i rindende ledningsvand for at fjerne det gule. Sektionerne blev farvet med Mayers hæmatoxylin, Biebrich scarlet-syre-fuchsin, fungerende phosphotungstic/phosphomolybdinsyreopløsning og anilinblå i 5 minutter hver, hvorefter de blev anbragt i 1 % eddikesyre i 2 minutter. Sektionerne blev skyllet, dehydreret i alkohol, renset i xylen og monteret. Cytoplasma og muskelfibre fremstår røde; kollagen og kerner fremstår blå. Fibroseområderne og hele venstre ventrikel blev bestemt ved hjælp af computermorfometri ved hjælp af BIOQUANT-billeddannelsessoftware, og forholdet blev anvendt til at beregne arområdet udtrykt som en procentdel af venstre ventrikel. Forholdet mellem fibrose og levedygtigt myokard i det periinfarkte område (interstitiel fibrose) blev bestemt ved computermorfometri ved hjælp af en ×20-forstørrelse og udtrykt som en procentdel af overfladearealet. Von Kossa farvning (Diagnostic Biosystem, Pleasanton, Calif) blev anvendt til at påvise (præ)nekrotiske myokardiske kalkaflejringer.

Cytokinniveauer

Hele blodet blev udtaget i natriumcitratrør hos 9 rotter (4 behandlet med anakinra og 5 behandlet med normal saltvand) på dødstidspunktet og straks centrifugeret a 1000g ved 4°C i 10 minutter. Supernatanten blev opsamlet og filtreret gennem et 0,22-μm-filter. Prøverne blev herefter opbevaret ved -20 °C og efterfølgende analyseret. Et multiplex cytokin bead array-system (Bio-Plex Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, Calif) blev anvendt i henhold til producentens anvisninger til bestemmelse af cirkulerende niveauer af IL-1β, tumor necrosis factor-α, IL-6 og interferon-γ. Reaktionsblandingen blev aflæst med Bio-Plex proteinarray-læseren, og data blev analyseret med Bio-Plex Manager-softwareprogrammet.

MMP-syntese

MMP-9, eller gelatinase B, blev valgt som prototypisk metalloproteinase, der er opreguleret efter AMI og forbundet med negativ remodellering.14,15 Samlet opløseligt protein blev ekstraheret fra infarkt- og periinfarktmyokardiet 7 dage efter koronar ligation i 6 mus (3 behandlet med anakinra og 3 med saltvand) med en buffer af 20 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA og 1 mmol/L EGTA. Homogenatet blev centrifugeret ved 14 000 g i 10 minutter ved 4 °C i 10 minutter, og supernatanten blev opsamlet. Derefter blev 50 μg protein fra hver prøve separeret ved hjælp af 7,5 % akrylamidgeler, overført til en nitrocellulosemembran og derefter blokeret med 5 % fedtfri tørmælk i Tris-buffered saline Tween-20 (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/L NaCl og 0,1 % Tween 20) i 1 time. Membranen blev derefter inkuberet med gedepolyklonalt primær antistof i en fortynding på 1:1000 for MMP-9 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif) i 16 timer ved 4 °C, inden den blev vasket og inkuberet med anti-rabbit peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:2000; Amersham Biosciences, Inc, Piscataway, NJ) i 1 time. Blotterne blev udviklet med et kemiluminescenssystem. Der var to bånd synlige, svarende til pro-MMP-9 og aktivt MMP-9. Kun det aktive bånd (105 kDa) af MMP-9 blev udvalgt til måling. Den optiske tæthed for hvert bånd blev scannet og kvantificeret med densitometri og udtrykt som forholdet mellem aktivt MMP-9 og β-actin.

Antiapoptotiske virkninger af Anakinra In Vitro

De ventrikulære kardiomyocytter blev isoleret fra rotte med en enzymatisk teknik modificeret som tidligere beskrevet.16 Kort fortalt blev rotten bedøvet med pentobarbitalnatrium (100 mg/kg IP), og hjertet blev hurtigt fjernet fra brystkassen. Inden for 3 minutter blev aortaåbningen kanaliseret til et Langendorff-perfusionssystem, og hjertet blev retrogradueret perfunderet. Den enzymatiske fordøjelse blev påbegyndt ved at tilsætte collagenase type II (0,5 mg/mL hver; Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) og protease type XIV (0,02 mg/mL) til perfusionsbufferen og fortsatte i ≈15 minutter. Derefter blev der tilsat 50 μmol/L Ca2+ til enzymopløsningen for at perfundere hjertet i yderligere 10 til 15 minutter. Det fordøjede ventrikulære væv blev skåret i stykker og forsigtigt aspireret med en overførselspipette for at lette celledissociationen. Cellepellet blev resuspenderet med henblik på en 3-trins Ca2+-gendannelsesprocedure (dvs. 125, 250 og 500 μmol/L Ca2+). De nyligt isolerede kardiomyocytter blev derefter suspenderet i minimalt essentielt medium (katalognummer M1018, pH 7,35 til 7,45, Sigma). Cellerne blev derefter udplottet på 35 mm cellekulturskåle, der blev præcoated med 20 μg/mL muselaminin i fosfatbufferet saltvand med 1 % penicillin-streptomycin i 1 time. Kardiomyocytterne blev dyrket i tilstedeværelse af 5 % CO2 i 1 time i en befugtet inkubator ved 37 °C, hvilket gjorde det muligt for kardiomyocytterne at sætte sig fast på skålens overflade før den eksperimentelle protokol. Kardiomyocytterne blev derefter udsat for simuleret iskæmi i 40 minutter ved at erstatte cellemediet med en “iskæmibuffer”, der indeholdt 118 mmol/L NaCl, 24 mmol/L NaHCO3, 1,0 mmol/L NaH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2-2H2O, 1,2 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L natriumlaktat, 16 mmol/L KCl og 10 mmol/L 2-deoxyglucose (pH justeret til 6,2). Desuden blev cellerne inkuberet under hypoxiske forhold ved 37 °C i hele den simulerede iskæmi-periode ved at justere tregasinkubatoren til 1 % til 2 % O2 og 5 % CO2. Efter 40 minutter blev reperfusion simuleret ved at erstatte den ischæmiske buffer med normalt medium under normoxiske forhold. Samtidig blev anakinra tilsat til pladen i stigende (×100) koncentrationer begyndende med en koncentration på 25×10-16g/mL op til en koncentration på 25×10-6g/mL (n=3 pr. gruppe). En tilsvarende mængde normalt medium blev tilsat til 3 plader som kontrol. Pladerne blev inkuberet i 18 timer. Cardiomyocyt-apoptose blev analyseret ved TUNEL-farvning med et kit købt hos BD Biosciences (San Jose, Californien), der påviser nukleær DNA-fragmentering via et fluorescensassay. Kort sagt, efter 40 minutters simuleret iskæmi og 18 timers reperfusion blev cellerne i 2-kammersglas fikseret med 4 % formaldehyd/fosfatbufferet saltvand ved 4 °C i 25 minutter og underkastet TUNEL-assay i henhold til producentens protokol. Objekttlassene blev derefter kontrafarvet med Vectashield-monteringsmedie med 4,6-diamidino-2-phenylindol (et DNA-interkalerende farvestof til visualisering af kerner i fikserede celler; katalognummer H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, Californien). De farvede celler blev undersøgt under et Olympus IX70 fluorescensmikroskop (Olympus Inc, Center Valley, Pa).

Anakinra Optagelse In Vitro

HL-1 celler, en musekardial muskelcellelinje, der bevarer fænotypiske karakteristika af voksne kardiomyocytter, blev dyrket til konfluens i Claycomb-medium (Sigma Chemical Co) suppleret med 10% FCS (JHR Bioscience, Ltd, Andover, Hampshire, UK) og noradrenalin 0.1 mmol/L (Sigma Chemical Co) på gelatine/fibronectin-belagte 22 mm glascoverlips af 22 mm glas placeret på bunden af 35 mm Petriskåle.17 FITC-konjugeret anakinra (10 μg/mL) blev derefter tilsat til cellerne, og cellerne blev inkuberet ved 37 °C under enten normoxiske eller hypoxiske (2 % ilt) forhold i en Micro galaxy, RS Biotech inkubator i 5 timer. Cellerne blev derefter vasket to gange med Hanks’ saltopløsning indeholdende 10 % FCS. Kerner blev modfarvet med Hoechst, og observationer blev udført med et Leica DM 2000 fluorescensmikroskop (Meyer Instruments Inc, Houston, Tex).

Caspase-1- og -9-aktivitetsassays

Hæmning af anakinra af caspase-1- og -9-aktiviteter blev analyseret ved hjælp af de kommercielle assay-kits (QuantiZyme assay system, Plymouth, Pa) ved hjælp af rekombinant human caspase-1 og YVAD-AMC, en variation af sekvensen YVHD, der findes på pro-Il-1β-spaltningsstedet, som fluorogent substrat for caspase-1 og Ac-LEHD-AMC for caspase-9. Forsøget blev udført ved 22 °C med en fluorometrisk pladelæser (SLT, Fluostar, Tecan US, Research Triangle Park, NC) i kinetisk tilstand med excitations- og emissionsbølgelængder på henholdsvis 390 og 460 nm. Der blev anvendt en startkoncentration på 11,5 μmol/L (svarende til Km for caspase-1) for substratet og derefter øget til 37,5 μmol/L for at teste for kompetitiv og ikke-kompetitiv hæmning.18 For anakinra blev der valgt en startdosis på 100 nmol/L i tilstedeværelse eller fravær af 10 μg/mL polyklonalt anti-IL-1Ra-blokerende antistof (R&D Systems, Minneapolis, Minn) og derefter øget til 300 og 900 nmol/L for at evaluere for en dosis-respons-kurve. Der foretages korrektioner fra blanko, og kurverne tilpasses til et 0,0-intercept, fordi aktiviteten antages at være 0 på tidspunkt 0. Der opnås regressionsafhængigheder (r>0,95) for hvert forsøg ved hver dosis, og koefficienterne sammenlignes mellem de 3 grupper (anakinra, kontrol, anakinra plus blokerende antistof). Eksperimenterne blev udført i triplikater for hver gruppe, og kurverne blev kørt mindst 5 gange for hver prøve. Sandsynlighedsværdien afspejler 1-vejs ANOVA mellem grupperne med 2-sidet post-hoc Dunnett’s test, hvor hver gruppe sammenlignes med anakinra.

Fysisk interaktion og binding mellem anakinra og caspase-1 og -9 blev testet ved hjælp af coimmunopræcipitation. Anakinra (1 μg) blev inkuberet med kommercielt tilgængelig rekombinant human caspase-1 og -9 (1 μg, BIOMOL International, Plymouth Meeting, Pa) i 1 time ved 4 °C. Blandingen blev derefter udfældet ved at tilsætte den til 2 forskellige sæt Sepharose perler koblet med anti-IL-1Ra (Santa Cruz) eller anti-caspase-1 antistof (Santa Cruz). Sefarose-bundne fraktioner blev kogt i SDS-buffer og separeret i SDS-PAGE. De coprecipiterede proteiner i hver indstilling blev derefter immunoblottet og analyseret ved Western Blot. Anti-IL-1Ra og anti-caspase-1 eller -9 antistoffer blev anvendt til at påvise immunoreaktivitet af henholdsvis anakinra og caspase-1 i coprecipitatet. Hvis der ikke var opstået noget coprecipitat, forventedes et enkelt bånd under Western Blot svarende til det opløselige antistof af samme type som det antistof, der var bundet til Sefaroseperlerne (dvs. immunfarvning for IL-1Ra i IL-1Ra-bundet Sefaroseperleudfældningsassayet). Hvis der var sket samudfældning, ville man forvente tilstedeværelsen af et dobbelt bånd for begge opløselige antistoffer i begge fældningsassays (4 bånd i alt). Anakinra og caspase-1 eller -9 blev kørt i Western Blot i yderligere linjer og anvendt som positive kontroller.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med SPSS 11.0-pakken til Windows (SPSS Inc, Chicago, Ill). Kontinuerlige variabler er udtrykt som gennemsnit og SE. Envejs ANOVA blev anvendt til sammenligning af middelværdier mellem flere (>2) grupper med post hoc 2-sidet Dunnett’s test til specifik sammenligning af mellem-subjekt-effekter med kontroller i hver gruppe. T-testen for uparrede data blev kun anvendt til at sammenligne middelværdier mellem to grupper. Random-effects ANOVA for gentagne målinger blev anvendt til at sammenligne ekkokardiografiske parametre før og efter interventionen mellem de 4 forskellige grupper med post hoc 2-sidet Dunnett-test for specifikt at sammenligne mellem-subjekt-effekterne (anakinra- og saltvands-AMI-grupper). Korrelationer mellem 2 kontinuerlige variabler blev vurderet med Pearsons test. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev konstrueret, og log-rank-testen blev anvendt til at vurdere, om der var signifikante forskelle mellem grupperne. Overlevelsesrater blev også sammenlignet ved hjælp af Fisher’s eksakte test. Ujusterede 2-halede sandsynlighedsværdier er rapporteret overalt, med statistisk signifikans sat på 0,05-niveau.

Forfatterne havde fuld adgang til og tager det fulde ansvar for dataintegriteten. Alle forfattere har læst og accepterer manuskriptet som skrevet.

Resultater

Undersøgelsen omfattede vurdering af virkningerne af anakinra in vivo (i koronararterieligationsmodellen hos mus og rotte) og in vitro (i primær rottekardiomyocytkultur, HL-1 kardiomyocytkultur og isoleret caspase-1).

In vivo administration af Anakinra

overlevelse

Otteogtyve otte mus blev aflivet efter 24 timer for at vurdere infarktstørrelsen. Seks mus blev aflivet efter 7 dage med henblik på analyse af MMP-9-ekspression; disse mus blev ikke medtaget i overlevelsesanalysen. 7 dage efter koronararterieligation var 15 af de 16 mus (94 %) behandlet med anakinra i live mod 11 af de 20 mus (55 %) behandlet med saltvand (P = 0,013, Kaplan-Meier log-rank-test; P = 0,021, Fisher’s exact-test). På samme måde var 4 af de 4 rotter (100 %), der blev behandlet med anakinra, i live, mens kun 5 af de 8 rotter (62 %), der blev behandlet med saltvand, var i live. Alle sham-opererede mus (n=8) og rotter (n=8) var i live efter 7 dage.

Infarktstørrelse

Ingen signifikante forskelle i risikoområde og infarktområde (udtrykt som infarktområde pr. risikoområde) blev fundet mellem saltvandsbehandlede mus og mus behandlet med 1- og 10-mg/kg-doser af anakinra; anakinra 100 mg/kg var imidlertid forbundet med en beskeden, men signifikant (13 %) reduktion i infarktstørrelse (P = 0,015 i forhold til saltvand; figur 1).

Apoptose

Anakinra-anvendelse var forbundet med en signifikant reduktion af kardiomyocyt-apoptose i det peri-infarkte myokardie i både den øjeblikkelige og forsinkede behandlingsgruppe (3,1 ± 0,2 % versus 0,5 ± 0,3 %, P<0,001; og 4,2 ± 0,4 % versus 1,1 ± 0,2 %, P<0,001, henholdsvis; Figur 2). Den apoptotiske rate i det peri-infarkte myokardie var direkte korreleret med tegn på negativ remodellering såsom LVEDD (r=0,65, P=0,001), LVESD (r=0,66, P<0,001), FS (r=-0,62, P=0,001), forvægsdiastolisk tykkelse (r=-0,50, P=0,012) og forvægs systolisk tykkelse (r=-0,50, P=0,012). Den apoptotiske rate i det fjerntliggende myokardium var enten ikke påviselig eller meget lav med ingen signifikante forskelle mellem dyr med AMI (0,03 ± 0,03 %) og shamopererede dyr (0,01 ± 0,01 %) og mellem anakinra-behandlede (0,02 ± 0,02 %) og saltvandsbehandlede (0,03 ± 0,03 %) dyr (P>0,05 for alle analyser).

Myokardfibrose og kalciumaflejringer

Ingen forskelle i myokardfibrose (ar-dannelse, udtrykt som procent af venstre ventrikel) blev fundet mellem de anakinra- og saltvandsbehandlede mus (31±2% mod 33±2%; P=0,81; Figur 1). Interstitiel fibrose i periinfarktområdet var minimal hos shamopererede mus (<0,1 %), men mere udbredt hos anakinra- og saltvandsbehandlede mus uden nogen signifikante forskelle mellem grupperne (13±2 % versus 15±3 %; P=0,58; Figur 1). Vi fandt minimale mængder af myokardiale calciumaflejringer ved hjælp af von Kossa-farvning 1 uge efter AMI (<0,1%) uden nogen forskelle mellem anakinra- og saltvandsbehandlede mus.

LV Remodeling og funktion

Preinterventions LVEDD- og LVESD-værdier var ens i alle muse- og rottegrupper. Der blev observeret signifikante stigninger i LVEDD og LVESD og fald i diastolisk tykkelse af forvæggen, systolisk tykkelse af forvæggen og FS hos saltvandsbehandlede mus (i forhold til baseline og sham ) på dag 7 (Figur 3). Sammenlignet med saltvandsbehandlede mus havde anakinra-behandlede AMI-mus signifikant mindre LVEDD- og LVESD-stigninger og FS-fald på dag 7 i forhold til baseline. Faldet i forreste vægs systoliske tykkelse havde også tendens til at være mindre i anakinra-behandlede mus (sammenlignet med saltvandsbehandlede dyr), hvilket viser en beskyttende effekt i periinfarktområdet, mens vi ikke fandt nogen signifikante forskelle i bagvægs diastolisk tykkelse (henholdsvis 0,96 ± 0,08 versus 0,78 ± 0,11; P = 0,86) og bagvægs systolisk tykkelse (henholdsvis 1,32 ± 0,08 versus 1,14 ± 0,12; P = 0,44). Anakinra-behandlede mus havde også kortere isovolumetrisk kontraktionstid (6±4 versus 16±5 ms; P=0,022) og isovolumetrisk afslapningstid (12±5 versus 29±8 ms; P=0,042) værdier og følgelig et lavere Tei-indeks (der afspejler myokardiets ydeevne) (0,28±0,03 versus 0,66±0,07; P=0,044; Figur 3). FS/Tei-indekset, som korrelerer endnu tættere med invasive målinger af dP/dt,19 var også signifikant højere i anakinra-behandlede (0.74±0.06 versus saltvandsbehandlede 0.17±0.02; P=0.008) AMI-mus. Der blev ikke fundet nogen forskelle mellem saltvands- og anakinra-behandlede sham-opererede mus (Figur 3).

En lignende effekt på LVEDD og LVESD blev set i rottemodellen (figur 4). Den gennemsnitlige procentvise stigning i LVEDD og LVESD var signifikant større hos mus end hos rotter uafhængigt af behandlingsarm (P<0,001). Den absolutte reduktion i LVEDD- og LVESD-ændringer med anakinra var signifikant større hos mus end hos rotter (P<0,001); de procentvise reduktioner i LVEDD- og LVESD-ændringer var imidlertid ens hos mus (henholdsvis 56 ± 6 % og 53 ± 5 %) og hos rotter (68 ± 7 % og 47 ± 4 %; henholdsvis P = 0,66 og P = 0,32), hvilket viser lignende virkninger af øjeblikkelig og forsinket anakinra-administration.

Leukocytinfiltration

Der blev ikke fundet nogen forskelle i antallet af leukocytter pr. 1 mm2 myokardie i infarktområdet hos anakinra- og saltvandsbehandlede AMI-dyr (Figur 4). Apoptosefrekvensen i granulationsvævet 1 uge efter AMI var ens hos de anakinra- og saltvandsbehandlede mus (Figur 4). Leukocytter var stort set fraværende i fjerntliggende myokardieområder og hos shamopererede dyr.

Cytokinniveauer

Der blev ikke fundet nogen signifikante forskelle i IL-1β-, IL-6-, tumor necrosis factor-α- og interferon-γ-plasmaniveauer (Figur 4).

MMP-aktivitet

Aktiv MMP-9 var stort set ikke påviselig i sham-opererede dyr, mens den konsekvent blev påvist i mus med AMI 7 dage efter operationen. Der blev ikke fundet nogen forskel i aktive MMP-9-niveauer mellem saltvands- og anakinra-behandlede AMI-mus (Figur 4).

In vitro-administration af Anakinra

Apoptose

Inkubation af kardiomyocytter med anakinra (2.5×10-12 g/mL) på tidspunktet for “simuleret reperfusion” (efter 40 minutters “simuleret iskæmi”) var forbundet med en signifikant 36 % reduktion i apoptose (11,2 ± 0,5 % mod 17,5 ± 0,1 % i kontrol). Stigende (×100) koncentrationer af anakinra op til 25×10-6 g/mL viste ingen yderligere reduktion i apoptose, mens koncentrationer under 25×10-12 g/mL ikke havde nogen effekt på apoptose (figur 5).

Øget cellulær optagelse af anakinra under hypoxi

Sammenlignet med normoxi var optagelsen af anakinra under hypoxi signifikant øget, idet den var tydelig i ≈95% af cellerne under hypoxi (mod 35% under normoxi; P=0,048; Figur 6).

Hæmning af Caspase-1- og -9-aktiviteter

In vitro hæmmer anakinra (100 til 900 nmol/L) signifikant caspase-1- og -9-aktiviteter med ≈50 % (P<0,001 for alle koncentrationsværdier i forhold til kontrol), uden forskelle mellem forskellige koncentrationer. Anakinra opførte sig som en blandet kompetitiv og ikke-kompetitiv enzymhæmmer for caspase-1 (Ki, 0,201 μmol/L; Kic, 0,239 μmol/L; Kuc, 0,231 μmol/L) og for caspase-9 (Ki, 0,31 μmol/L; Kic, 0,34 μmol/L; og Kuc, 0,28 μmol/L). Tilsætning af IL-1Ra-blokerende antistoffer vendte caspase-1- og -9-hæmningen af anakinra (figur 7). Coprecipitationsassayet bekræftede en fysisk interaktion og binding mellem anakinra og caspase-1 og -9 (figur 7).

Diskussion

Denne undersøgelse viser for første gang, at det exogene rekombinante humane IL-1Ra anakinra, der gives inden for de første 24 timer efter AMI, signifikant forbedrer kardiel remodellering ved at reducere kardiomyocyt-apoptose i 2 forskellige dyremodeller af permanent infarktrelateret arterieokklusion, og at anakinra har en direkte antiapoptotisk virkning på kardiomyocytter in vitro.

Biologi af IL-1Ra

IL-1Ra anses for at være en akutfasereaktant.3,4 I øjeblikket er den rolle, som endogent IL-1Ra spiller i inflammation, uklar. IL-1Ra binder sig til IL-1-receptoren og er derfor en kompetitiv hæmmer af IL-1-aktiviteten og opfører sig potentielt som et antiinflammatorisk middel.3 Da IL-1 binder sig til sin receptor med højere affinitet, og der er et overskud af receptorer (reserve-receptor-effekt), synes den endogene agonists rolle imidlertid at være begrænset.3 IL-1Ra-genet er velbevaret i biologien, og der er ikke rapporteret om forskelle mellem arterne. I denne undersøgelse testede vi de 2 mest almindelige gnaverarter og rapporterede lignende virkninger.

IL-1Ra i AMI

IL-1Ra-niveauerne stiger betydeligt efter myokardiskæmi-reperfusion.7 Niveauerne er forhøjede tidligt hos patienter, der præsenteres med ST-segment-elevation AMI,5 og jo større det udsatte myokardieområde er, jo større er stigningen i IL-1Ra-niveauerne.6 I observationsundersøgelser var højere IL-1Ra-niveauer hos patienter med akutte koronarsyndromer desuden forbundet med et ugunstigt udfald.20,21 Det var fortsat uklart, om IL-1Ra repræsenterede en skadesmarkør, et forsøg på kardioprotektion ved hjælp af antiinflammatorisk aktivitet eller en mediator for skade. Overekspression af IL-1Ra i en rottemodel af global iskæmi-reperfusion viste for første gang en kardioprotektiv virkning af IL-1Ra, hvilket resulterede i en ca. 50 % reduktion i kardiomyocytapoptose8 .

Exogent IL-1Ra

En rekombinant human IL-1Ra (anakinra) er kommercielt tilgængelig (produceret af Amgen), godkendt af Food and Drug Administration og anvendes hos et stort antal patienter til behandling af reumatoid arthritis.22-24 IL-1’s rolle i patogenesen af reumatoid arthritis er central. Systemisk administration af anakinra har vist sig at være sikker og effektiv hos patienter med reumatoid arthritis, hvilket har ført til ændring af sygdomsaktiviteten. Et klinisk forsøg med anakinra hos patienter med akutte koronarsyndromer er i gang, men resultaterne foreligger endnu ikke.25 I en nyligt offentliggjort fase II-undersøgelse blev 17 patienter med iskæmisk slagtilfælde behandlet med anakinra givet som en 100 mg bolus efterfulgt af en 72-timers infusion; de øvrige 17 patienter fik tilsvarende placebo.26 Anakinra viste sig ikke at have nogen lægemiddelrelaterede bivirkninger, og i en sekundær analyse blev det konstateret, at det var forbundet med et større antal patienter med minimal eller ingen slagtilfælde-relateret invaliditet. I eksperimentelle slagtilfælde-modeller på dyr var anakinra forbundet med reduceret apoptose, reduceret inflammation og forbedret adfærdsmæssigt resultat.27,28

Virkningsmekanisme

Den nøjagtige mekanisme, hvorved anakinra udøver sine gavnlige virkninger, er ikke helt klar. Den accepterede opfattelse er, at anakinra, der administreres i høje doser, konkurrerer med IL-1 og reducerer IL-1-aktiviteten. Anakinra binder IL-1-receptoren af type I, men forhindrer transduktion af det intracellulære signal ved at forhindre interaktionen mellem IL-1-receptoren og det accessoriske IL-1-protein. IL-1Ra har vist sig at reducere IL-1-afhængig prostaglandin-E2-sekretion, som kan være direkte ansvarlig for celletoksicitet og apoptose.3,29 Det er fortsat uklart, om anakinra interfererer med IL-1, der hovedsageligt stammer fra inflammatoriske celler, eller med IL-1, der frigives lokalt på en parakrin eller autokrin måde, og om det har en direkte virkning på cellen uafhængigt af dets interaktion med IL-1-receptoren. Den intracellulære virkning af IL-1Ra er uafhængig af den intracellulære IL-1-signalvej30 , og der er beskrevet transmembranaktiv transport af IL-1Ra gennem den purinerge P2X7-kanalreceptor.31 De virkninger, der er observeret in vitro, hvor der kun dyrkes kardiomyocytter, tyder på, at virkningerne af anakinra på myokardiet i det mindste delvist er uafhængige af tilstedeværelsen af et inflammatorisk infiltrat. I overensstemmelse hermed fandt vi ingen virkninger af anakinra på cirkulerende cytokinniveauer, myokardialt leukocytinfiltrat eller MMP-9-aktivitet i denne eksperimentelle model. De antiapoptotiske virkninger af IL-1Ra er allerede blevet rapporteret i neuroner og epitelceller.32,33 Disse virkninger er tydelige in vivo og in vitro, hvilket tyder på en parakrin eller autokrin virkning af IL-1Ra.32,33 Her rapporterer vi om cellulær optagelse af anakinra under iskæmi, binding mellem anakinra og caspase-1 og -9 og signifikant hæmning af caspase-1- og -9-aktiviteter af anakinra. De data, der er opnået in vitro, selv om de kun er hypotesegenererende med hensyn til begivenhederne in vivo på grund af modellernes iboende begrænsninger, tyder på en stigende tærskel for hypoxi-induceret apoptose med anakinra.

Vi viser, at tidlig (øjeblikkelig) eller forsinket (24 timer senere) indgivelse af anakinra reducerer apoptose og forhindrer hjertedilatation efter AMI. Ved den dosis, der viste sig at hæmme apoptose og forhindre dilatation (1 mg/kg), havde anakinra ingen effekt på infarktstørrelsen, når det blev givet tidligt, og lignende fordele i remodellering ses med anakinra administreret 24 timer efter AMI, hvilket er i overensstemmelse med en effekt på hjertets remodellering, der er uafhængig af infarktbesparelse. Det er bemærkelsesværdigt, at de gavnlige virkninger af IL-1Ra i dyriske apopleksimodeller også, i det mindste delvist, er tidsuafhængige.34 Som allerede bemærket i apopleksi-litteraturen blev der imidlertid observeret en infarktbesparende virkning med en 100 gange højere dosis anakinra. Hvorvidt den lille, men signifikante reduktion af infarktstørrelsen med højere doser ville udmønte sig i en klinisk relevant fordel med hensyn til hjertesvigt eller overlevelse er ukendt og kræver yderligere afprøvning.

Den optimale varighed af IL-1Ra-behandling efter AMI er ukendt. I en model for karvægsrespons på skade var IL-1Ra givet i 28 dage forbundet med en større effekt sammenlignet med IL-1Ra givet i 14 dage.35 Det skal bemærkes, at der ikke blev fundet nogen rebound-effekter efter ophør af IL-1Ra-behandlingen.35

Rolle for caspaser i iskæmi og hjertesvigt

Caspaser er proteaser, der er involveret i den apoptotiske og inflammatoriske kaskade.36-40 Caspase-3 er en central mediator i den apoptotiske kaskade, hvilket fører til nedstrømsaktivering af sekundære effektorer, der er ansvarlige for DNA-fragmentering og spaltning af cytoskelettets strukturproteiner. Caspase-1, også kendt som det interleukin-1-konverterende enzym, betragtes som en proinflammatorisk caspase, fordi den blandt sine handlinger konverterer pro-IL-1β til IL-1β. Caspase-1 er imidlertid også et af de enzymer, der kløver pro-caspase-3, hvilket fører til dets aktivering.36-40 Faktisk aktiveres caspase-3 generelt fra kløvning af andre caspaser såsom caspase-9, som spiller en central rolle i den mitokondrielle vej, caspase-8, som hovedsagelig er involveret i receptormedieret apoptose, og caspase-1. Eksperimentelle undersøgelser har vist, at hæmning af caspase-1-aktivitet er forbundet med reduceret apoptose og mere gunstig remodellering efter AMI uafhængigt af IL-1-niveauerne.38,39 I betragtning af at IL-1 er substratet for caspase-1, testede vi, om IL-1Ra kunne udøve sine gavnlige virkninger ved direkte intracellulær hæmning af caspase-1.40 I overensstemmelse hermed beskriver vi for første gang, at anakinra binder til caspase-1 in vitro og hæmmer dets aktivitet signifikant. Direkte hæmning af caspase-1 med anakinra kan være ansvarlig, i det mindste delvist, for dets antiinflammatoriske og antiapoptotiske virkninger. Anakinra kan imidlertid have antiapoptotiske virkninger som følge af en indirekte virkning på caspase-1-aktiviteten ved at forhindre translokation af caspase-1 til kernen og dermed hæmme apoptose41 eller gennem hæmning af caspase-9. Caspase-9 er den vigtigste mediator for den mitokondrielle vej, der fører til aktivering af apoptose under hypoxi/ischæmi.37 Om hæmning af caspase-1 eller -9 spiller en større rolle for den fordel, der er observeret med anakinra, skal endnu ikke belyses. Ved den dosis, der blev testet i denne undersøgelse, havde anakinra sandsynligvis lignende hæmmende virkninger på begge caspaser, og crosstalk mellem forskellige caspaser i den apoptotiske kaskade er blevet rapporteret.36-41

Farmakokinetik af Anakinra og dosis-effektrespons

I en fase I-undersøgelse hos 25 raske frivillige var en enkelt dosis anakinra i en dosis svarende til den, der blev anvendt i denne undersøgelse (1 mg/kg), der blev administreret intravenøst, forbundet med et plasmaniveau på 3,1 μg/mL og en halveringstid på 2,64 timer.42 In vivo fandt vi ingen signifikante virkninger på infarktstørrelsen ved anvendelse af anakinra ved en dosis op til 10 gange højere end den anbefalede dosis, men vi fandt en lille, men signifikant reduktion af infarktstørrelsen ved anvendelse af en 100 gange højere dosis. Det er usikkert, om denne infarktbesparende effekt, der er forbundet med en så høj dosis, vil udmønte sig i et gunstigt langtidsresultat, og det kræver yderligere undersøgelser. In vivo var en koncentration >106 lavere end det maksimale plasmaniveau, der blev observeret hos mennesker, forbundet med en betydelig reduktion af apoptose. Lavere doser var ikke effektive, mens højere doser ikke viste nogen additiv virkning. Disse data er i overensstemmelse med den kliniske profil for anakinra, hvor der generelt anvendes en standarddosis på 1 mg/kg, og hvor større doser er forbundet med flere lokale bivirkninger uden væsentlig yderligere klinisk fordel.22-24 I en nylig undersøgelse43 blev anakinra givet i en dosis på 100 mg (groft sagt svarende til 1 mg/kg) anvendt til at hæmme pancreatisk β-celleapoptose, og det blev vist, at det blev godt tolereret og var forbundet med indekser for bedre β-cellefunktion sammenlignet med placebo uden at påvirke insulinfølsomheden.

Iskæmi, apoptose og hjertesvigt efter AMI

Fundet af en sammenhæng mellem apoptose og remodellering understøtter konceptet om apoptose som en central mediator for hjertets remodellering uanset infarktstørrelse.1,37,44 Manglen på forskelle i dets virkninger på apoptose eller remodellering mellem den øjeblikkelige og forsinkede behandlingsstrategi og manglen på virkninger på infarktstørrelse med 1-mg/kg-dosis tyder på, at anakinra specifikt påvirker subakut postinfarktremodellering, hvor apoptose vides at spille en vigtig rolle,1,36,43 uden at påvirke infarktheling, matrixnedbrydning og fibrose eller fremme vægruptur.

Konklusioner

Administration af anakinra inden for 24 timer efter AMI forbedrer postinfarktremodellering, samtidig med at apoptose hæmmes. På trods af begrænsningerne i den foreliggende undersøgelse (såsom en relativt lille stikprøvestørrelse begrænset til mandligt køn, en enkelt tidsbestemmelse af resultater af interesse og brugen af ekkokardiografi, som fortsat er en suboptimal og operatørafhængig metode til vurdering af LV-remodellering og funktion), kan resultaterne af en gavnlig effekt af exogent IL-1Ra (anakinra) givet inden for 24 timer efter AMI åbne et nyt terapeutisk vindue for behandling af iskæmisk skade og remodellering til forebyggelse og behandling af iskæmisk hjertesvigt.

Fodnoter