Analytisk følsomhed, funktionel følsomhed

Et af de grundlæggende kendetegn ved enhver analysemetode er den mindste koncentration, der kan måles pålideligt. Der er blevet anvendt en række termer og begreber til at beskrive den laveste koncentration, som et immunoassay kan rapportere, og denne mangfoldighed af termer kan være virkelig forvirrende. I det følgende diskuteres nogle af disse begreber og deres sammenhæng med besvarelsen af det grundlæggende spørgsmål: Hvad er den laveste koncentration, jeg kan rapportere med dette assay?
Analytisk følsomhed
Den formelle definition af analytisk følsomhed er “den laveste koncentration, der kan skelnes fra baggrundsstøj”. Denne koncentration betegnes korrekt som analysens detektionsgrænse, men den betegnes mest almindeligt som følsomhed. Typisk fastlægges denne værdi ved at analysere gentagelser af en prøve, som man ved ikke indeholder nogen analysand. Derefter anvendes de målte tællinger (CPS) fra disse gentagelser til at beregne et gennemsnit og en standardafvigelse (SD). Den analytiske følsomhed bestemmes som den koncentration, der svarer til det gennemsnitlige antal tællinger fra nulprøven plus 2 SD for immunometriske assays og gennemsnittet minus 2 SD for kompetitive assays. Dette er det, der er offentliggjort i afsnittet “Analytisk følsomhed” i indlægssedlerne til IMMULITE® og IMMULITE® 2000.
I den virkelige verden har analytisk følsomhed en begrænset praktisk værdi. Den virkelige begrænsning er, at for enhver analyse stiger upræcisionen meget hurtigt med faldende koncentration. Dette fænomen er let synligt, når man ser på assayets præcisionsprofil, som er en grafisk repræsentation af, hvordan upræcisionen af et assay ændrer sig med den målte koncentration. (Se figur 1 og 2 for eksempler.)

Figur 1. Repræsentativ DPC-præcisionsprofil.

Figur 2. Repræsentativ DPC-præcisionsprofil. Bemærk, at funktionel følsomhed i området 0,01-0,02 µIU/mL pr. definition kræves af et TSH-assay af “tredje generation”.1,2
Nu ikke kun ved den analytiske følsomhed, men selv ved koncentrationer, der ligger betydeligt over denne, kan upræcisionen være så stor, at resultaterne ikke reproduceres godt nok til at være af reel klinisk nytte. Følgelig repræsenterer den analytiske følsomhed typisk ikke den laveste målbare koncentration, der er klinisk anvendelig.
Denne begrænsning af den analytiske følsomhed har vi altid haft for RIA og IMMULITE, og den gælder for alle metoder fra alle producenter. Da patientprøver typisk ikke køres i gentagelser, er den manglende reproducerbarhed måske ikke umiddelbart synlig i rutineprøver. Resultaternes generelle kvalitet og anvendelighed påvirkes dog. Derfor er den nedre grænse for rapporteringsområdet i IMMULITE- og IMMULITE 2000-softwaren ofte fastsat til en koncentration, der ligger over den analytiske følsomhed. DPC fastsætter rapporteringsgrænserne for hvert enkelt assay til det, der ifølge en omfattende vurdering svarer til det område, hvor assayet har en effektiv og pålidelig ydeevne i forhold til den planlagte kliniske anvendelse.
Begrænsningerne ved analytisk følsomhed til at beskrive den nedre grænse for klinisk effektiv assaypræstation førte til udviklingen af et andet koncept.
Funktionel følsomhed
For omkring ti år siden udviklede en gruppe forskere, der evaluerede TSH-assays, som reaktion på den begrænsede anvendelighed af analytisk følsomhed som et mål for assays ydeevne, et begreb, som de kaldte funktionel følsomhed.1 De definerede det som “den laveste koncentration, ved hvilken et assay kan rapportere klinisk nyttige resultater”. Klinisk anvendelige resultater for TSH blev anset for at være god nøjagtighed med et dag-til-dag CV på ikke mere end 20 %. Selv om dette valg af CV-grænse var noget arbitrært, mente forskerne, at for TSH var et CV på 20 % den største upræcision, der kunne tolereres til kliniske formål.1
Da CV er standardafvigelsen udtrykt som en procentdel af middelværdien, indebærer et CV på 20 %, at SD ville være 20 % af middelværdien. For en prøve med en TSH-koncentration på 0,1 µIU/mL ville f.eks. det interval, der omfatter 95 % af de forventede resultater fra gentagne analyser, være ±40 % (±2 SD) eller 0,06 µIU/mL til 0,14 µIU/mL.
Og selv om det oprindeligt kun blev udviklet til TSH-analyser, er begrebet funktionel følsomhed og brugen af et CV på 20 % som grænse for klinisk anvendelighed blevet bredt anvendt på andre immunoassays. Konceptet er blevet accepteret, fordi det giver laboratoriet en objektiv og klinisk meningsfuld indikation af den praktiske nedre grænse for et assay.
Ved udviklingen af et nyt assay anvender DPC stort set den samme fremgangsmåde og evaluerer både præcision og nøjagtighed for at fastlægge de koncentrationer, ved hvilke grænserne for klinisk anvendelighed sandsynligvis vil blive nået. Softwarens rapporteringsområde er baseret på denne evaluering. Især for konkurrerende assays er der normalt en betydelig forskel mellem den analytiske følsomhed og den nedre rapporteringsgrænse. Rapporteringsområdet, som det er indstillet i IMMULITE- og IMMULITE 2000-softwaren, repræsenterer DPC’s anbefaling af CLIA’88*-“rapporteringsområdet” – som er det koncentrationsområde, over hvilket assayets ydeevne er dokumenteret som værende gyldig.
Verificering af assaypræstationer
For laboratorier, der anvender automatiserede immunoassay-systemer i USA, er den eneste følsomhedsrelaterede præstationskarakteristik, som CLIA’88 kræver, at laboratoriet skal verificere, i øjeblikket den nedre grænse for det rapporterbare område. Nogle laboratorier kan også vælge at vurdere den funktionelle følsomhed af et nyt assay, og historisk set har nogle laboratorier ønsket at verificere den analytiske følsomhed. Hver af disse vurderinger er et forskelligt forsøg med forskellige protokoller og krav. Så det første skridt er at beslutte, hvad der skal verificeres, og derefter anvende den relevante protokol og evaluere dataene i overensstemmelse hermed.
Hvis et laboratorium vælger at evaluere analytisk følsomhed, er målet typisk at verificere den værdi, der er angivet for det pågældende præstationsmål i indlægssedlen. Det er vigtigt, at den prøve, der anvendes til en undersøgelse af analytisk følsomhed, er en ægte nulkoncentrationsprøve med en passende prøvematrix. Enhver anden type prøve kan forvrænge resultaterne. Den sædvanlige protokol omfatter analyse af 20 gentagelser af nulprøven efterfulgt af beregning af middelværdi og SD for CPS-værdien. Den analytiske følsomhed anslås som den koncentration, der svarer til middelværdien af nulprøvens tællinger plus 2 SD for immunometriske (“sandwich”-) analyser som TSH eller minus 2 SD for konkurrerende analyser som T4. Den tekniske tjeneste kan hjælpe med at beregne denne koncentration. Denne protokol giver et første skøn, som normalt er tilstrækkeligt til sammenligning med den analytiske følsomhed, der er anført i indlægssedlen. Det er dog nødvendigt med flere eksperimenter, der omfatter flere kitpartier, for at opnå en robust og præcis vurdering.
Ved vurdering af funktionel følsomhed er målet at bestemme den laveste koncentration, der svarer til et laboratoriespecificeret mål for dag-til-dag (interassay) upræcision, som repræsenterer grænsen for klinisk anvendelighed for et givet assay. Almindeligvis er et CV på 20 % blevet anvendt som mål, baseret på den oprindelige anvendelse af konceptet på TSH. Dette CV er imidlertid ikke altid den mest hensigtsmæssige grænse. For nogle analyser kan et CV på over 20 % være i overensstemmelse med klinisk pålidelige og informative resultater, mens et CV på under 20 % for andre analyser kan udgøre grænsen for klinisk anvendelighed. Ydelsesmålet skal fastsættes for hvert enkelt assay på grundlag af dets planlagte kliniske anvendelse.
Når man har bestemt det daglige CV, der repræsenterer den klinisk nyttige grænse for reproducerbarhed, er det næste skridt at vurdere den koncentration, ved hvilken CV’et kan nå denne grænse. På grundlag af tidligere undersøgelser, data fra indlægssedlen og skøn ud fra assayets præcisionsprofil kan den tekniske tjeneste normalt hjælpe med at identificere et “målområde” af koncentrationer, der ligger inden for den forudbestemte CV-grænse.
Denne undersøgelse bør normalt udføres ved hjælp af flere ufortyndede patientprøver eller puljer af patientprøver med koncentrationer, der spænder over målområdet. Disse prøver kan imidlertid være vanskelige at fremskaffe. Rimelige alternativer omfatter patientprøver, der er fortyndet ned til koncentrationer, der spænder over målområdet, eller kontrolmaterialer i eller tæt på dette område. Hvis der er behov for at fortynde en hvilken som helst type prøve til undersøgelsen, er det afgørende, hvilket fortyndingsmiddel der anvendes. De rutinemæssige prøvefortyndingsmidler er kun beregnet til fortynding af prøver med meget høj koncentration; for nogle assays kan de have en målbar, om end meget lav, tilsyneladende koncentration. Anvendelse af disse fortyndingsmidler kan fordreje undersøgelsens resultater.
Proverne bør analyseres gentagne gange over en række forskellige kørsler, ideelt set over en periode på flere dage eller uger, for at vurdere den daglige præcision. (En enkelt kørsel med 20 replikater giver ikke en valid vurdering af den funktionelle følsomhed). Når dataene er indsamlet, beregnes CV’et for hver testet prøve. Den funktionelle følsomhed er den koncentration, ved hvilken CV’en når den forudbestemte grænse. Denne koncentration kan estimeres ud fra undersøgelsesresultaterne ved interpolation, hvis den ikke tilfældigvis falder sammen med et af de testede niveauer.
Verifikation af den nedre grænse for det indberetningspligtige område er en del af processen til verifikation af hele det indberetningspligtige område. Dette opnås typisk ved at udføre gentagelsesanalyser på en serie af tre til fem prøver med kendte koncentrationer, der spænder over det indberetningspligtige område. Disse prøver kan opnås ved hjælp af en enkelt prøve med en koncentration nær den øvre grænse for intervallet, som derefter fortyndes til yderligere prøver, der dækker hele det indberetningspligtige område. De opnåede resultater vurderes med hensyn til både reproducerbarhed og genfinding af de forventede værdier for at fastslå, at analysens ydeevne opfylder kravene til klinisk anvendelighed i hele det indberetningspligtige område.
Slutning
Så, hvorfor er den nedre grænse for softwarens rapporteringsområde 1,0 µg/dL (13 nmol/L), når der i indlægssedlen står, at følsomheden er 0,3 µg/dL (3,9 nmol/L)? I dette eksempel er assayet et konkurrerende assay, og upræcisionen i assayet overskrider de klinisk anvendelige grænser ved en koncentration langt over den analytiske følsomhed.
Hvis upræcisionen er sådan, at man ikke med sikkerhed kan sige, at resultater på f.eks. 0,4 µg/dL (5 nmol/L) og 0,7 µg/dL (9 nmol/L) faktisk er forskellige, er det så ikke bedre at rapportere begge som ”
I sidste ende er det normalt ikke assayets detektionsgrænse (analytisk følsomhed), men snarere reproducerbarheden af resultaterne, der bestemmer den nedre grænse for klinisk pålidelig assaypræstation i rutinemæssig praksis.

1. Spencer CA. Skjoldbruskkirtelprofilering i 1990’erne: frit T4-estimat eller følsom TSH-måling. J Clin Immunoassay 1989; 12:82-9.
2. Spencer CA, et al. Forskelle mellem laboratorier/intermetoder i funktionel følsomhed af immunometriske analyser af thyrotropin (TSH) og indvirkning på pålideligheden af måling af subnormale koncentrationer af TSH. Clin Chem 1995;41:367-74. Genoptryk (katalognummer ZD060) kan fås ved henvendelse til DPC.
*CLIA’88: den amerikanske lov om forbedring af kliniske laboratorier (Clinical Laboratory Improvement Act).