Antibiotikafølsomhed hos indikatorbakterier Escherichia coli og Enterocococci spp. isoleret fra ænder i Morogoro Municipality, Tanzania

Metoder

Undersøgelsesområde og prøveudtagning af ænder

Denne tværsnitsundersøgelse blev gennemført i Morogoro Municipality mellem november 2014 og marts 2015, hvor der blev udtaget prøver af 100 moskusænder (Carina moschata) fra 26 baggårdsflokke . Undersøgelsesænder blev tilfældigt udvalgt fra hver flok, hvor 5-10% af flokkens størrelse blev udtaget som prøve . De udtagne fugle omfattede 86 hunner og 14 hanænder. Inden prøvetagningen blev der indsamlet grundlæggende oplysninger om forvaltning, fodring, anvendelse og bortskaffelse af ubrugte antibiotika ved hjælp af et spørgeskema (Additional file 1). De udvalgte ænder blev fastholdt manuelt, og en steril vatpind blev ført ind i kloakken for at indsamle fækal materiale. Prøverne blev opbevaret i en køleboks med ispose og transporteret til laboratoriet på Sokoine University of Agriculture med henblik på analyse. Af hensyn til konsistensen udførte to forskere, der var blevet uddannet af laboratorieteknologerne i prøvetagning med vatpinde fra fugle, prøvetagningen af alle 100 ænder.

Isolering og identifikation af E. coli og Enterococci spp.

Fækale prøver blev udpladeret på MacConkey agar (Oxoid, Basingstoke, UK) og inkuberet i 24 timer under aerobe forhold med henblik på isolering af E. coli . Mistænkelige kolonier blev yderligere identificeret på grundlag af kolonimorfologi, Gramfarve og biokemiske test . Til isolering af Enterococci spp. blev prøverne udpladeret på Slanetz-Bartley agar (Oxoid, Basingstoke, UK) og inkuberet i 48 timer under aerobe forhold og identificeret på grundlag af kolonimorfologi og biokemiske test . Under isolering og identifikation blev E. coli ATCC25922 og Enterococcus faecium ATCC 2912 inkluderet som kontrolstammer.

Antibiotikafølsomhed

Alle E. coli- og Enterococci-isolater blev testet for antibiotikafølsomhed ved hjælp af diskdiffusionsmetoden og fortolket i henhold til CLSI . Der blev foretaget antimikrobiel modtagelighedstestning for nogle antibiotika, som almindeligvis anvendes i humanmedicin i Tanzania. Fire antibiotika til E. coli blev testet i de angivne koncentrationer: ampicillin 10 µg, cefotaxim 30 µg, trimethoprim-sulfamethoxin 25 µg og tetracyclin 30 µg. Enterokokker blev testet mod ampicillin 10 µg, erythromycin 15 µg, rifampin 5 µg, tetracyclin 30 µg og trimethoprim-sulfamethoxin 25 µg. Alle antibiotikadisketterne var fra Oxoid, Basingstoke, UK.

Etiske overvejelser

Godkendelsen til at gennemføre denne undersøgelse blev givet af Morogoro Municipal Livestock Officer, og den etiske godkendelse af undersøgelsen blev givet af de etiske komitéer ved Sokoine University of Agriculture, Tanzania. Der blev indhentet mundtligt samtykke fra hver enkelt landmand inden prøvetagningen.

Resultater

Ud af 100 dyrkede fækale prøver havde 91 % E. coli, hvoraf 64 (70,3 %) viste resistens over for forskellige testede antibiotika (tabel 1). E. coli viste flere antibiotikaresistenser: 28 (30,8 %) isolater mod fire antibiotika, 35 (38,5 %) mod tre antibiotika, 13 (14,3 %) mod to antibiotika og 11 (12,1 %) isolater mod et antibiotikum. Enterococcus blev isoleret fra alle prøverne, og 42 % viste resistens over for forskellige testede antibiotika. Fem procent af Enterococcus-isolaterne var resistente over for alle antibiotika, 13 % over for fire antibiotika, 21 % over for tre antibiotika, 26 % over for to antibiotika og 28 % over for ét antibiotikum, der blev testet. Resultaterne vedrørende andehold og deres mulige adgang til antibiotikarester er opsummeret i tabel 2. Af de 26 interviewede landmænd havde 92,3 % en ekstensiv forvaltning af ænder, hvor de havde adgang til lossepladser. Der blev ikke rapporteret om indgift af veterinærmedicin til ænder, men respondenterne rapporterede, at de behandlede andre dyr ved hjælp af tetracykliner/oxytetracyklin.

Diskussion

Den aktuelle undersøgelse viste, at E. coli-isolationsraten var 91 %, mens alle ænder husede Enterokokker, og at isolaterne havde en høj grad af multiantibiotikaresistens. Denne undersøgelse kastede lys over, at indikatorbakterier fra fritlevende ænder i Tanzania kan anvendes i undersøgelser af antibiotikaresistens. Det tyder på, at problemet med antibiotikaresistens er udbredt, selv blandt bakterieisolater fra dyr, der ikke behandles med antibiotika. Dette har betydning for folkesundheden, da ænder spiser foder omkring husholdningsområder og afgiver deres fækale ekskrementer overalt, og de resistente bakterier kan finde vej ind i fødekæden og påvirke mennesker, eller det resistente gen kan overføres til patogene bakterier.

Den anslåede prævalens af antibiotikaresistens hos E. coli isoleret under denne undersøgelse kan sammenlignes med den resistens, der er rapporteret i Malaysia . I Nigeria er der rapporteret om en lav prævalens på 8,6 %, hvilket sandsynligvis skyldes, at der anvendes forskellige antibiotika som ofloxacin, nalidixinsyre og gentamycin . Den høje prævalens af antibiotikaresistens, der blev observeret i denne undersøgelse, skyldes sandsynligvis, at ænder konstant udsættes for antibiotikarester fra udledninger fra dyr og mennesker på grund af deres udbredte anvendelse. Undersøgelser viser, at antibiotika, der anvendes til dyr, der anvendes som fødevarer, absorberes dårligt i tarmen, og at grundstofferne udskilles i fæces . Dette understøttes af flere undersøgelser, som har rapporteret om høje niveauer af antibiotikarester i spildevand og animalsk affald . Derfor er den normale flora i spildænder konstant udsat for antibiotikarester, hvilket får dem til at udvikle resistens, som det blev observeret i denne undersøgelse.

E. coli-resistensen over for ampicillin var den højeste (81 %) sammenlignet med andre antibiotika, der blev anvendt i undersøgelsen, hvilket svarer til tidligere rapporter i Slovakiet, hvor resistensen var 87,8 %. Generelt viser undersøgelser, at 60-70 % af E. coli-isolaterne har udviklet resistens over for ampicillin . Dette kan skyldes, at der anvendes for meget ampicillin i human praksis, og at dets rester er potentielle kilder til miljøforurening, hvor ænder spiser til foder. For sulphamethoxin blev der registreret en resistens på 76 % som tidligere registreret af Van Tuat . Den antibakterielle resistens for tetracyclin var i denne undersøgelse 59 %, mens den i Slovakiet var 37,5 % og i Nigeria 75 % . Det er interessant, at E. coli også viste antibakteriel resistens over for cefotaxim på 63 %, et antibiotikum, der ikke almindeligvis anvendes til behandling af dyr i Tanzania. Ænder kan få adgang til cefotaximrester på lossepladser, hvor der findes human fækalier og bortskaffede lægemiddelrester (tabel 2). Der er imidlertid observeret høj resistens over for cefotaxim hos bakterier, der er isoleret fra forskellige sundhedsfaciliteters kloakering.

Der blev også observeret flere resistenser hos E. coli over for mere end ét antibiotikum i undersøgelsen. Resultaterne var for høje sammenlignet med den undersøgelse, der blev gennemført i Vietnam, hvor multipel antibiotikaresistens hos E. coli var 16,7 % over for fire antibiotika, over for tre antibiotika 20 % og over for to antibiotika 23,3 % . Denne forekomst af multipel lægemiddelresistens tyder på, at husdyrene spiller en rolle som reservoirer for resistente bakterier i forbindelse med miljøforurening . Det er blevet konstateret, at bakteriepopulationer isoleret fra tarmene hos dyr, der er udsat for antibiotika, havde fem gange større sandsynlighed for at være resistente over for et givet antibiotikum. De ikke-resistente bakterier erhverver normalt de ekstrakromosomale antibiotikaresistensplasmider (R-plasmider) fra de resistente bakterier, når de er i tæt kontakt . Den observerede resistens kan skyldes irrationel brug af antibiotika, som medfører, at der udledes en betydelig mængde restkoncentrationer i miljøet. Andre faktorer, der forårsager udviklingen af resistens, kan være den lette tilgængelighed og den udbredte brug af bredspektret antibiotika til behandling af infektioner, selv i sundhedsfaciliteter. Manglende håndhævelse af regler om antibiotikaanvendelse som led i programmer til infektionsbekæmpelse kan have påvirket resistensmønstret i betydelig grad.

Enterokokokker spp. er naturlige kommensaler i menneskers og dyrs tarme. Alle de undersøgte ænder havde Enterococci spp. i deres tarmindhold, som viste 42 % resistens over for forskellige testede antibiotika. Resultaterne af denne undersøgelse viste dog en høj resistens over for rifampin (62 %), ampicillin (62 %) og tetracyclin (42 %). Multidrugresistens blev også observeret hos mere end 65 % af isolaterne. Som tidligere nævnt kan bakteriernes observerede resistens over for forskellige antibiotika, der er testet uden brug af lægemidlerne hos ænder, skyldes, at rester, der udledes til miljøet, hvor ænder spiser, let kan blive udsat for antibiotika og andre resistente bakterier. Når resistente bakterier er i kontakt med ikke-resistente bakterier, kan der ske en udveksling af genetisk materiale, og det resistente gen kan erhverves. Andre steder har undersøgelser rapporteret, at Enterococci spp. isoleret fra ænder viste resistens over for makrolider og lincosamidantibiotika . Enterococci spp. er dog i sig selv resistente over for flere antibiotikagrupper, herunder cefalosporiner og aminoglykosider. Desuden indeholder mange stammer overførbare genetiske elementer til erhvervelse af resistens over for forskellige antibiotika som f.eks. tetracyklin . Andre undersøgelser af antibiotikaresistens hos Enterococci spp. isoleret fra ænder er blevet udført ved hjælp af antibiotikumet vancomycin . Der foreslås yderligere undersøgelser af Enterococci spp.’s modtagelighed over for vancomycin i fremtiden, da antibiotika i dag er et almindeligt lægemiddel i humanmedicin i Tanzania.

Spørgeskemaundersøgelsen understøtter yderligere laboratorieobservationen af den høje resistensrate hos E. coli og Enterococcus spp. Det blev observeret, at antibiotika anvendes i vid udstrækning til behandling af dyr og mennesker. Uanset at der ikke anvendes veterinærlægemidler i duskfisk, udsættes de i forbindelse med det omfattende forvaltningssystem for spild af affald for antibiotikarester og andre bakterier fra dyr og mennesker, som har været på antibiotika, i miljøet. Dette understøttes af resultaterne af, at de observerede resistenser var mod antibiotika, der almindeligvis anvendes hos mennesker og dyr (tabel 2). Resistensbakterier er blevet isoleret fra en række forskellige kilder, herunder spildevandsudledning og miljøet . Lægemiddelrester og -beholdere blev tilfældigt bortskaffet i husstandenes omgivelser, hvilket kan udsætte ænderne for antibiotika. Derfor kan et intensivt forvaltningssystem for ænder bidrage til at minimere fuglenes unødvendige eksponering for antibiotikarester.

Slutning

Generelt set var den antibiotikaresistens, som E. coli og Enterococcus spp. udviste i denne undersøgelse, høj. Dette viser den rolle, som husdyr og kyllinger, der konstant får antibiotika, spiller som potentielle primære kilder til antibiotikaresistensgener til bakterier, der er isoleret fra ænder. Isolering af multiantibiotikaresistente E. coli og Enterococcus spp. fra ænder tjener som potentielle bærere af antibiotikaresistente stammer til mennesker og udgør et alvorligt problem for folkesundheden.

Begrænsninger

Denne undersøgelse anvendte kun 100 ændeprøver indsamlet fra Morogoro Kommune, hvilket begrænser generaliseringen af resultaterne til at blive brugt som repræsentative for status for antimikrobiel resistens hos E. coli og Enterococcus spp. hos ænder i Tanzania. Antallet af antibiotika, der blev testet, var også begrænset. Testning af bakteriers antibiotikafølsomhed ved hjælp af diskdiffusionstestmetoden kan være ringere end bouillonmikrodilutionsmetoder. Undersøgelsen har heller ikke fastslået resistensgenotyperne hos E. coli og Enterococcus spp. som var resistente over for forskellige typer antibiotika. Tilstedeværelsen af andre dyr på stedet, hvor der blev udtaget prøver fra ænder, virker dog som forvirrende faktorer for de resistensrater, der er observeret i bakterieisolater fra ænder.