[Antigenretrieval: dens betydning og ulemper i immunohistokemi]

Et af de største problemer i immunohistokemi har været at bevare både god morfologi og immunreaktivitet af antigener i vævssnit. Der er blevet udviklet forskellige teknikker til at genfinde antigenernes immunoreaktivitet (afmaskering) efter rutinemæssige vævspræparationer som f.eks. fiksering, dehydrering og indlejring, og de er nu ved at blive anvendt til immunfarvninger i forbindelse med ikke blot cytohistologiske undersøgelser, men også patokliniske diagnoser. I denne rapport blev først og fremmest mekanismerne og betydningen af både fiksering og antigenudtagning undersøgt ud fra et synspunkt om inaktivering af proteiner. For det andet blev der gennemgået nogle praktiske problemer og noter vedrørende to af de mest populære afmaskeringsteknikker, enzymdigestion og varmeinduceret epitope retrieval (HIER), med henblik på at tilpasse teknikkerne præcist i immunohistokemi. Den største artefakt, der fremkaldes af fiksering, er maskering af vævsantigener som følge af krydsbinding mellem aminosyreresterne i proteiner. Det er vigtigt at vælge en passende fikseringsbetingelse for hvert antigen under hensyntagen til dets biokemiske natur og dets modstandsdygtighed over for fiksering. (tabel 2) og at holde fikseringsbetingelserne på et minimum, således at antigenets immunoreaktivitet let kan genfindes ved hjælp af forskellige afmaskeringsteknikker (tabel 3, fig. 1). Antigenretrieval i sig selv er den proces, der forårsager proteindenaturering i væv, ligesom mange andre proteininaktiveringsprocesser (tabel 1). Enzymfordøjelsen kan ætse de maskerende dele af proteinerne omkring et antigen for at afsløre dets epitop. Selv om enzymfordøjelsen er relativt enkel, og behandlingsbetingelserne er lette at kontrollere, er resultaterne ikke nødvendigvis dramatiske og konsekvente, afhængigt af typerne eller mængden af enzymer. Man skal derfor finde sin egen digestionsmanual for at opnå det bedste farvningsresultat for hvert antigen (f.eks. tabel 4). F.eks. gav pepsinfordøjelsen de bedste resultater ved immunfarvning af brom-deoxyuridin (BrdU) og proliferating cell nuclear antigen (PCNA), mens andre enzymer kun havde ringe effekt (tabel 5). Opvarmning kan også spalte polypeptidryggen og afbryde de tværbindinger, der er dannet ved fiksering. Opvarmningsvirkningen på antigenoprettelsen er temperaturafhængig og synes at være proportional med produktet af temperatur og tid. I forbindelse med PCNA-immunfarvning på paraformaldehydfikserede paraffinindlejrede sektioner var opvarmning ved 90 grader C i mindst 3 minutter nødvendig, men efterhånden som opvarmningsbetingelserne blev strengere, steg også de uspecifikke baggrundsfarvninger (tabel 6), hvilket er et af de alvorligste problemer ved antigenudtagning (fig. 2a, c). Et muligt valg for at undgå sådanne uønskede resultater er en kombination af suboptimal opvarmning (ved 80 grader C i 10-15 min) og pepsinfordøjelse (fig. 2b, d). En vigtig teoretisk overvejelse i forbindelse med anvendelse af en så dramatisk denatureringsmetode er, om de maskerede antigenepitoper kan eksponeres tilstrækkeligt uden at give anledning til falsk-positive (eller falsk-negative) resultater med antistoffer, som man tidligere havde tillid til. Det ser ud til, at hvert antigen kræver en “skræddersyet” vævspræparation for optimal bevarelse af dets antigenicitet og præcise lokalisering. I overensstemmelse med udviklingen inden for immunologi, molekylærbiologi, genetik og embryologi bør behovet for multiple immunfarvninger i kombination med andre teknologier som f.eks. in situ-hybridisering øges for at kunne analysere de rumlige og funktionelle relationer mellem forskellige molekyler in situ. Antigenudtagning vil i så fald blive en effektiv strategi.