Antimikrobielle peptider: Deres rolle som infektions-selektive sporstoffer til molekylær billeddannelse

Abstract

Antimikrobielle peptider (AMP’er) er en heterogen klasse af forbindelser, der findes i en række organismer, herunder mennesker, og indtil nu er hundredvis af disse strukturer blevet isoleret og karakteriseret. De kan beskrives som naturlige mikrobicider, der er selektivt cytotoksiske over for bakterier, mens de udviser minimal cytotoksicitet over for værtsorganismens pattedyrceller. De virker ved deres relativt stærke elektrostatiske tiltrækning af de negativt ladede bakterieceller og en relativt svag interaktion med de eukaryote værtsceller. Disse peptiders evne til at ophobe sig på infektionsstederne kombineret med den minimale cytotoksicitet hos værten motiverede denne gennemgang til at fremhæve AMP’ernes rolle og nytteværdi i forbindelse med PET med vægt på deres virkningsmekanisme og de forskellige interaktioner med bakteriecellen. Disse detaljer er nøgleoplysninger for deres selektive egenskaber. Vi beskriver også strategien, designet og udnyttelsen af disse peptider som potentielle radiofarmaceutiske stoffer, da deres kombination med nuklearmedicinske modaliteter såsom SPECT eller PET vil muliggøre ikke-invasive helkropsundersøgelser til påvisning af skjult infektion, der f.eks. forårsager feber af ukendt oprindelse.

1. Indledning

Sammenlignet med andre konventionelle teknologier kan tomografisk billeddannelse evaluere sygdomsprocesser dybt inde i kroppen, ikke-invasivt og relativt hurtigt. Det er derfor ikke overraskende, at molekylær billeddannelse i høj grad har udvidet undersøgelsen af forskellige sygdomsprocesser og er blevet et vigtigt redskab inden for onkologi, både i forbindelse med forskning og patientbehandling . En anden stor fordel ved billeddannelse er dens evne til at give en holistisk, tredimensionel vurdering af hele organet eller kroppen, som er mindre tilbøjelig til at blive begrænset af prøveudtagningsfejl, og som derfor er i god overensstemmelse med den samlede sygdomsproces. Mens de fortsatte fremskridt inden for molekylær billeddannelse har givet uovertrufne muligheder for mere raffinerede metoder til overvågning af sygdomme, er værktøjerne til evaluering af infektion og inflammation fortsat begrænsede. To billeddannelsesmetoder, der i øjeblikket er meget udbredt i klinikken, omfatter højopløsnings-computertomografi (CT), der måler anatomiske (og dermed sene) ændringer, eller 18F-mærket 2-fluoro-deoxy-D-glucose (18F-FDG)-positronemissionstomografi (PET), som er en generel markør for metabolisk aktivitet. Da 18F-FDG også ophobes på infektions- og betændelsessteder på grund af den forhøjede glukosemetabolisme på disse steder , er det således uspecifikt for infektion. Derfor er det blevet stadig vigtigere at udvikle mere specifikke og selektive billeddannelsesmidler til afbildning af infektioner. Direkte ex vivo-mærkning af leukocytter anses for at være “guldstandarden” for PET-billeddannelse af infektioner. Desværre er denne proces meget besværlig og tidskrævende og kræver håndtering af blodprodukter . Alternativt kan man opnå indirekte mærkning af leukocytter ved hjælp af radiomærkede molekyler, f.eks. kemotaktiske peptider eller cytokiner, som binder sig til receptorer på leukocytterne . Desværre har de biologiske virkninger af nogle af de forbindelser, der er rettet mod leukocytreceptorer, begrænset deres kliniske anvendelse som infektionsspecifikke molekylære billeddannelsesmidler . Selv om de mest almindeligt mærkede leukocytter, neutrofiler og lymfocytter, er ret selektive for infektion, er der tilfælde, hvor de ikke kan påvise en infektion eller ophobes på ikke-inficerede steder. Hvis infektionen ikke udløser et immunrespons, vil de mærkede leukocytter ikke ophobes på de inficerede lokaliteter, hvilket kan være tilfældet hos personer med stærkt nedsat immunforsvar eller i tilfælde af infektion med visse patogener som Mycobacterium tuberculosis eller Pneumocystis carinii. Nogle ikke-infektiøse immuntilstande som f.eks. reumatoid arthritis kan også fremkalde et immunforsvar og akkumulere sporstoffet. Ved hjælp af forskellige sporstoffer er det muligt at anvende forskellige målrettede strategier til at afbilde infektion ved hjælp af PET.

Sporstoffer, der interagerer direkte med de patogene mikrober, der er ansvarlige for infektionen, er i sagens natur meget specifikke for infektion og bør i modsætning til mærkede leukocytter ikke akkumuleres i sterile inflammationer. Disse typer sporstoffer omfatter radiomærkede antibiotika og antimikrobielle peptider. Technetium-99m-mærket ciprofloxacin (-ciprofloxacin) har været den mest studerede antibiotika-baserede sporstof til SPECT-infektionsafbildning, der er rettet mod DNA-gyrase, et enzym, der findes i alle bakterier, der deler sig, og som ikke menes at akkumulere i døde bakterier eller sterile inflammationer. Der er opstået visse problemer i forbindelse med brugen af denne tracer til SPECT-infektionsafbildning med hensyn til dårlig radiokemisk renhed og stabilitet . For nylig er det blevet rapporteret, at lokalisering ved inficerede foci primært sker gennem øget ekstravasation og stase. Denne proces finder også sted på ikke-inficerede steder med øget vaskulær permeabilitet, og -ciprofloxacin kan ophobes på steder med steril inflammation, hvorved dets specificitet for infektion mindskes .

Antimikrobielle peptider (AMP) har tiltrukket sig interesse som potentielle målretningsvektorer til udvikling af PET-tracere designet til påvisning af infektion. Disse peptider findes i en lang række organismer, herunder mennesker, og indtil videre er hundredvis af dem blevet isoleret og karakteriseret. Man mener, at disse peptider fungerer som bredspektrede mikrobicider og indgår i det medfødte immunsystem hos mange eukaryoter, herunder mennesker. Uanset deres oprindelse har de mange fælles egenskaber, f.eks. at de har en positiv nettoladning, er amfipatiske og i de fleste tilfælde er membranaktive . På grund af deres rolle i kroppen som et naturligt mikrobicid er disse antimikrobielle peptider selektivt cytotoksiske over for bakterier, mens de udviser minimal cytotoksicitet over for celler i værtsorganismen. Man mener, at peptidernes kationiske nettonatur resulterer i en relativt stærk elektrostatisk tiltrækning til negativt ladede bakterieceller og en relativt svag tiltrækning til eukaryote værtsceller, som normalt er mindre negativt ladede end prokaryoter, og det menes at være grundlaget for denne celletypediskrimination . Disse peptiders evne til at ophobe sig på infektionssteder kombineret med deres næsten ubetydelige cytotoksicitet eller tiltrækning af værtsceller gør disse peptider attraktive som målende vektorer til PET-billeddannelse af infektion .

2. Oversigt over antimikrobielle peptider

Antimikrobielle peptider er evolutionært bevarede biomolekyler, som indgår i forsvarsmekanismerne i mange organismer , lige fra prokaryoter til flercellede dyr som f.eks. mennesker . De udgør en del af den første forsvarslinje mod patogene mikrober hos højere dyr og hos mange lavere livsformer; de er den eneste form for forsvar mod patogene og saprofytiske mikrober . Disse peptiders selektive cytotoksicitet, hvor de angriber de patogene mikrober og lader værtscellerne være uskadte, skyldes de grundlæggende forskelle i værtscellernes sammensætning og struktur i forhold til de patogene bakteriers og gærs bakteriers sammensætning og struktur. Selv om nogle AMP’er udviser immunmodulerende virkninger og/eller kemotaktisk adfærd, er et fælles træk ved disse antimikrobielle peptider, at de er amfipatiske, men har en samlet positiv ladning . Ca. 1500 antimikrobielle peptider er blevet karakteriseret i en lang række organismer, og klassificeringen af disse peptider kan være kompliceret på grund af den store grad af sekvensforskellighed mellem de forskellige peptider. Man har dog forsøgt at foretage en klassificering på grundlag af aminosyresammensætning og sekundære strukturer.

Der er identificeret tre store grupper (tabel 1), nemlig α-helikale peptider, cysteinholdige β-ark-peptider og fleksible peptider, der er rige på specifikke aminosyrer som prolin, tryptofan, histidin, arginin og glycin .

2.1. α-helikale antimikrobielle peptider

Omkring 30 til 50 % af alle antimikrobielle peptider, der hidtil er identificeret og undersøgt, indeholder overvejende α-helikale strukturer. Dette kan skyldes den relative lethed, hvormed disse peptider syntetiseres kemisk, hvilket giver mulighed for omfattende karakterisering i laboratoriet. Disse peptider består normalt af 12-40 aminosyrerester og indeholder en overflod af helixstabiliserende rester såsom alanin, leucin og lysin, men aldrig cystein. I vandige opløsninger er disse peptider ofte ustrukturerede, men antager deres amfipatiske α-helikale konformationer, når de er associeret med en cellemembran eller i et membranmimiterende miljø. Ofte er disse peptider ikke strengt α-helixer og kan indeholde et indre knæk.

2.2. β-bladet antimikrobielle peptider

Den anden hovedgruppe af antimikrobielle peptider er de peptider, der typisk indeholder to til ti cysteinrester, der danner en til fem disulfidbindinger mellem kæderne. Denne bindingsinteraktion gør det muligt for disse peptider at antage β-ark-konformationen. De fleste β-bladede antimikrobielle peptider er en del af defensinfamilien, og disse peptider er evolutionært bevaret på tværs af planter, svampe, insekter, bløddyr og hvirveldyr. Defensiner består typisk af to til tre antiparallelle β-blade, der stabiliseres af tre til fire intramolekylære disulfidbindinger; i nogle tilfælde findes der dog et α-helikalt eller ustruktureret segment ved N- eller C-terminus. I modsætning til de α-helikale antimikrobielle peptider, som er ustrukturerede i vandige opløsninger, bevarer defensinerne en kompakt globulær struktur under sådanne forhold . Ud over den overordnede lighed i sekundærstrukturen har de fleste α-defensiner fra pattedyr yderligere to fælles træk, nemlig en fremspringende løkke som følge af en bevaret arginin/glutamatsaltbro og en β-bule forårsaget af et bevaret glycin-X-cystein-motiv (X: en hvilken som helst aminosyre) mellem den første og anden cysteinrest .

2.3. Fleksible antimikrobielle peptider, der er rige på specifikke aminosyrer

Et mindretal af antimikrobielle peptider indeholder en høj andel af visse aminosyrer som f.eks. prolin, tryptofan, histidin, arginin og glycin. Repræsentative medlemmer af denne klasse omfatter det tryptofanrige bovine indolicidin og det svinske tritrpticin, de histidinrige humane histatiner og det arginin- og prolinrige svine-PR-39. På grund af deres usædvanlige aminosyresammensætninger har disse peptider meget variable sekundære strukturer. Indolicidin med 13 aminosyrer (ILPWWKWPWPWWWPWRR) antager f.eks. en stort set udvidet konformation i tilstedeværelse af zwitterioniske miceller bestående af stoffer som dodecyl-phosphocholin eller anionisk natrium-dodecylsulfat .

3. Mekanismer for cellespecificitet og selektivitet af antimikrobielle peptider

Inherente forskelle i mikrobiens og værtscellens membransammensætning og -arkitektur fremmer selektiviteten af de antimikrobielle peptider. Regulering af peptidernes ekspression eller lokalisering menes også at kunne forhindre uønskede interaktioner med sårbare værtsceller.

3.1. Målspecificitet og selektiv celletoksicitet

En biologisk membran kan opfattes som en simpel væskemosaik bestående af fosfolipider, der er gennemsat med proteiner. I forskellige organismer kan glycerider og steroler også bidrage til den biokemiske arkitektur og overfladetopologi i sådanne membraner. Der er imidlertid grundlæggende forskelle mellem mikrobielle og animalske cellemembraner, som gør det muligt for antimikrobielle peptider at skelne mellem disse celler og selektivt angribe den ene frem for den anden, som skitseret i figur 1 .

Figur 1

Membranmålretning af antimikrobielle peptider og grundlaget for deres selektivitet (tilpasset fra ).

3.2. Membransammensætning, ladning og hydrofobicitet

Kernekomponenten i næsten alle naturlige biomembraner er fosfolipid-dobbeltlaget. Disse dobbeltlag er amfipatiske, hvilket betyder, at de har både hydrofobiske og hydrofiliske områder. Eukaryote og prokaryote cellemembraner adskiller sig imidlertid væsentligt fra hinanden med hensyn til den nøjagtige sammensætning og celleenergien (figur 2). Phosphatidylcholin (PC) og dets analogt sphingomyelin (SM) samt phosphatidylethanolamin (PE) har ingen ladning under fysiologiske forhold . Kolesterol og andre steroler såsom ergosterol, som findes i rigelige mængder i eukaryote membraner, men meget sjældent i prokaryote membraner, er generelt også neutralt ladede (figur 2) . Hydroxylerede phospholipider som f.eks. phosphatidylglycerol (PG), cardiolipin (CL) og phosphatidylserin (PS) har en negativ nettoladning under fysiologiske forhold. Det kan ses, hvordan membranens ladning hovedsagelig skyldes forholdet og placeringen af de forskellige fosfolipider, idet cellemembraner, der hovedsagelig består af PG, CL og PS, som det er tilfældet i de fleste patogene bakterier, er meget elektronegative, mens de membraner, der er rige på PC, PE eller SP, har en tendens til at have en neutral nettoladning, som det er tilfældet i pattedyrcellemembraner .

Figur 2

Sammenlignende lipidarkitektur af mikrobielle og humane cytoplasmiske membraner. Cytoplasmiske membraner fra bakterielle (Escherichia coli, Staphylococcus aureus eller Bacillus subtilis) og svampepatogener (Candida albicans) sammenlignes med den menneskelige erytrocyts relative sammensætning og fordeling mellem indre og ydre membranbladene. Membranbestanddele fra anionisk (venstre) til neutral (højre) er CL, PG, PE, PC, PC, SM og steroler (kolesterol eller ergosterol, ST). Bemærk, at den markante forskel mellem mikrobielle patogener og menneskelige erythrocytter ligger i fosfolipidsammensætningen og asymmetrien. Disse forskelle menes at være årsag til den selektive antimikrobielle peptidaffinitet for mikrobielle celler i forhold til værtsceller i det omfang, den findes for et givet antimikrobielt peptid. Nøgler: åben, E. coli; vandret skravering, S. aureus; skraveret, B. subtilis; ternet, C. albicans; fast, human erythrocyt (tilpasset fra ).

3.3. Membranasymmetri

Og selv om cellemembraner hverken er symmetriske eller statiske, kan forskelle mellem pattedyrs og mikrobielle fosfolipidbilayers tjene som potentielle mål for antimikrobielle peptider. I nogle celler som f.eks. kvægets erythrocytter er kun 2 % af det samlede PE-indhold placeret på den ydre membranfolie . Forskelle i membransymmetri, mætning af fosfolipidbilayers og sammensætningsstøkiometri vil påvirke membranens fluiditet og faseovergang. På tilsvarende måde kan ladningen af de indre og ydre folier i det cellulære bilag også være forskellig .

3.4. Mikrobielle ligander og receptorer som mål for antimikrobielle peptider

Forekomster har vist, at D- og L-aminosyreversioner af antimikrobielle peptider udviser samme bindingsaffinitet til målceller, hvilket tyder på, at stereospecifikke receptorer ikke er involveret i målretning af patogene celler . Flere undersøgelser synes imidlertid at modbevise dette og tyder på, at visse proteiner i den mikrobielle cellemembran kan fungere som bindingsmål for visse klasser af antimikrobielle peptider, f.eks. histatiner. Dette ville understøtte, at histadiner er involveret i lokale forsvarsmekanismer over for bestemte typer patogener og er blevet genfundet i tand- og hudsår. Nogle forskere postulerer også, at anioniske komponenter i cellemembraner, f.eks. CL, PG eller lipopolysaccharid (LPS), kan fungere som pseudoreceptorer, der muliggør den indledende interaktion mellem det antimikrobielle peptid og det mikrobielle cellemål . Antimikrobielle receptorer kan derfor være en alternativ vej for AMP-interaktion med den bakterielle cellekuvert.

3.5. Transmembranpotentiale

Transmembranpotentialet er endnu en måde, hvorpå mikrobielle celler og pattedyrceller varierer, og det er i den ladningsadskillelse, der findes mellem de indre og ydre lag af cytoplasmamembranen. En elektrokemisk gradient, der skyldes de forskellige hastigheder eller protonudveksling på tværs af cellemembranen, betegnes transmembranpotentialet (Δψ). En normal pattedyrcelle har et Δψ på mellem -90 og -110 mV. Patogene bakterier udviser imidlertid generelt Δψ i intervallet -130 til -150 mV. Denne betydelige forskel i elektrokemisk potentiale kan være en anden faktor, der gør det muligt for antimikrobielle peptider at skelne mellem værts- og målceller .

4. Selektiv toksicitet baseret på antimikrobielt peptiddesign

I det vandige intercellulære miljø menes mange antimikrobielle peptider at antage udvidede eller ustrukturerede konformationer, selv om dette måske ikke er tilfældet, hvis der er intramolekylære bindinger til stede, som vil sikre en specifik konformation i en række forskellige miljøer på grund af den inducerede stivhed. Når det antimikrobielle peptid binder sig til cellemembranen hos en patogen mikrobe, kan det undergå en betydelig konformationsændring og antage en specifik konformation, f.eks. en α-helix. Undersøgelser tyder på, at dynamiske og/eller iboende konformationer af antimikrobielle peptider har en indvirkning på deres selektive cytotoksicitet . Desuden kan antimikrobielle peptider gennemgå konformationsovergang, selvassociation eller oligomerisering i målpatogenmembranen, men ikke i værtscellemembranen for at øge den cellespecifikke toksicitet . Zhang og medarbejdere anvendte syntetiske testpeptider, der var ensartet kationiske, men varierede i konformation og omfattede forlængede, cykliske, α-helikale og β-arkstrukturer. Det blev fastslået, at alle testpeptider var i stand til at interagere med og trænge ind i lipidmonolag bestående af PG, et negativt ladet fosfolipid. Det var dog kun de α-helikale og forlængede peptider, der var i stand til at interagere med den mere neutralt ladede PC-membran. I samme undersøgelse blev det også konstateret, at β-bladpeptider var i stand til at translokere fosfolipider fra det indre til det ydre blad ved koncentrationer, der var lavere end dem, der var nødvendige for at permeabilisere membranen. På samme måde viste Kol og medarbejdere, at peptider med en tilsvarende konformation, men rige på histidin og lysin og uden tryptofan, også var i stand til at inducere betydelige niveauer af fosfolipidtranslokation. Det kan ud fra disse undersøgelser konkluderes, at antimikrobielle peptider ikke blot interagerer med fosfolipidmembraner af kun specifik sammensætning og symmetri, men at de også er i stand til at påvirke remodellering af membranerne i specifikke celler.

4.1. In vivo præferentiel affinitet for mikrobielle versus pattedyrceller

Welling og kolleger gennemførte et in vivo-forsøg, hvor de testede bindingsaffiniteten af et radiomærket fragment af det kationiske ubiquicidin antimikrobielle peptid -UBI 29-41 for mikrobielle celler sammenlignet med værtsceller. I undersøgelsen blev dyrene inficeret med Candida albicans, Klebsiella pneumonia eller Staphylococcus aureus. Sterile inflammationer blev også fremkaldt i dyrenes lårmuskler ved injektion af varmedræbte mikroorganismer eller renset LPS, som tjente som kontrol. De radiomærkede peptider akkumuleres i betydeligt omfang på de inficerede steder i forhold til sterile eller ikke-infektiøst betændte dele af kroppen. Dette in vivo-forsøg viste, at peptiderne kunne skelne mellem værts- og mikrobielle celler og også akkumuleres på de inficerede steder. Ved scintigrafiske målinger blev det fastslået, at de radiomærkede peptider akkumuleres i inficerede væv med en hurtig hastighed, og at der var op til en femdobbelt stigning i akkumuleringshastigheden i inficerede væv i forhold til ikke-inficerede væv. Denne hurtige lokalisering blev fortolket som om, at peptiderne havde en højere eller præferentiel affinitet for målcellens overflade i forhold til værtscellens overflade.

4.2. Lokalisering af cytotoksiske antimikrobielle peptider begrænser eksponering af sårbare værtsvæv

Det er muligt, at værtscellens cytotoksicitet er reduceret i mange flercellede organismer på grund af deres lokalisering til væv, der ikke er sårbare over for deres cytotoksiske virkninger. Hos de fleste dyr udskilles disse peptider af cellerne på relativt inaktive og robuste overflader som f.eks. tarmens eller lungernes epithelier eller hos padder på huden. På disse steder er der størst sandsynlighed for, at de hyppigst interagerer med potentielt skadelige mikrober, og ekspressionen af de fleste af de antimikrobielle peptider er enten konstitutiv eller hurtigt inducerbar, så de kan indgå i det første forsvar mod patogener . En anden måde at beskytte følsomme værtsvæv mod antimikrobielle peptider på er ved at indkapsle dem i granulerne i de fagocyterende leukocytter, som opsluger patogenerne og udsætter dem for dødelige koncentrationer af antimikrobielle peptider og oxidationsmidler. Defensin-klassen af antimikrobielle peptider anvendes på denne måde, da de er nogle af de mest giftige og mindst selektive af de antimikrobielle peptider, der produceres af værten. Det let sure mikromiljø i det modne phagolysosom er også det mest effektive miljø for defensinerne, da de udviser maksimal cytotoksicitet under disse forhold.

5. Mekanismer for antimikrobielle peptiders virkning

De generelt bevarede strukturer af antimikrobielle peptider på tværs af en lang række organismer giver nogle fingerpeg om deres virkningsmekanismer. De er næsten udelukkende amfipatiske og kationiske under fysiologiske forhold, og dette menes at bidrage til deres målcelleselektivitet. Det ideelle antimikrobielle peptid bør have en lav cytotoksicitet for værtsceller, men være giftigt for en lang række patogene mikrober. De antimikrobielle determinanter bør være let tilgængelige og bør ikke være tilbøjelige til at ændre sig eller blive ændret. Generelt har antimikrobielle peptider amfipatiske strukturer, der gør det muligt for dem at interagere med fosfolipidmembraner, strukturer, der er essentielle for alle patogener . Parametre som konformation (), hydrofobicitet (), hydrofobt moment (), ladning (), polær vinkel () og amfipathicitet () er alle vigtige for antimikrobielle peptiders funktion. Desuden er alle disse determinanter indbyrdes forbundne, og ændring af en af disse egenskaber vil føre til ændring af de andre .

5.1. Konformation ()

Og selv om antimikrobielle peptider kan findes i en lang række værtsorganismer og har forskellige aminosyresekvenser, kan de inddeles i nogle få diskrete grupper på grundlag af deres sekundære struktur. De to største grupper omfatter peptider, der besidder en β-ark- eller α-helikal sekundærstruktur. Størstedelen af de resterende antimikrobielle peptider er peptider, der har en usædvanlig høj andel af en eller flere aminosyrer som f.eks. tryptofan eller prolin og arginin. De α-helikale peptider findes hyppigt i insekters og paddernes intercellulære væske og antager generelt en ustruktureret eller udvidet konformation i vandig opløsning, idet de først antager deres helikale struktur ved interaktion med en fosfolipidmembran . Årsagen hertil er, at den intramolekylære hydrogenbinding, der er nødvendig for en α-helisk konformation, forstyrres i et polært opløsningsmiddel som vand. I en membran er de polære hydrogenbindingsgrupper beskyttet mod det lipofile (apolære) membranmiljø gennem α-helisk dannelse. Helixkonformationen eksponerer også de apolære sidekæder for det neutrale lipidmiljø inde i membranen. Selv om den primære struktur af β-bladklassen af antimikrobielle peptider viser en vis grad af ulighed i aminosyresekvensen, har de alle fælles træk med hensyn til den amfipatiske struktur, idet de besidder særskilte hydrofile og hydrofobiske domæner .

5.2. Ladning ()

De fleste af de antimikrobielle peptider er generelt kationiske og har ladninger fra +2 til +9, og mange af dem har stærkt definerede negativt ladede domæner. Denne positive ladning er vigtig for den indledende tiltrækning til og interaktion med de anioniske cellemembraner hos bakterier og andre patogene mikroorganismer. På samme måde tiltrækker værtens relativt mindre anioniske membraner ikke elektrostatisk de antimikrobielle peptider og kan give peptiderne en vis selektivitet i forhold til målcellen. Patogene bakterier er generelt rige på sure fosfolipider som f.eks. CL, PG og PS. Desuden giver teichoinsyrerne og teichuronsyrerne i cellevæggene hos Gram-positive bakterier og LPS hos Gram-negative bakterier yderligere elektronegativ ladning til bakteriens celleoverflade. Det er blevet fastslået, at bakteriers Δψ typisk er 50 % højere end pattedyrcellers, og det er blevet foreslået, at antimikrobielle peptider kan koncentreres på overfladen af patogene mikrober på en elektroforetisk måde . Selv om mange undersøgelser har været i stand til at korrelere kationiciteten af antimikrobielle peptider med deres antimikrobielle aktivitet, er der ikke tale om et strengt lineært forhold. Dathe og medarbejdere påviste i undersøgelser med analoger af magainin, at en forøgelse af kationiciteten fra +3 til +5 resulterede i en forøgelse af den antibakterielle aktivitet mod både Gram-positive og Gram-negative arter. De bemærkede dog, at der var en grænse for kationiciteten, hvorefter enhver forøgelse af den positive ladning ikke længere øger den antibakterielle aktivitet. Man mener, at dette fald i den antibakterielle aktivitet kan skyldes, at peptiderne binder sig så stærkt til den negativt ladede fosfolipidhovedgruppe, at translokation af peptidet ind i cellen var umulig .

5.3. Amphipathicitet () og hydrofobisk moment ()

Amphipathicitet er et næsten universelt træk blandt antimikrobielle peptider og opnås gennem en række forskellige peptidstrukturer. Den amfipatiske α-helix er en af de mest almindelige og enkleste af disse egenskaber. Ved at veksle mellem anioniske og kationiske aminosyrerester i hver tredje til fjerde position er peptidet i stand til at antage en sekundær struktur, der giver mulighed for optimal elektrostatisk interaktion med amfipatiske fosfolipidmembraner (figur 3). Denne egenskab gør det muligt for peptidet at udøve cytotoksisk aktivitet over for ikke kun negativt ladede cellemembraner, men også over for dem med en neutral ladning eller amfipatisk natur .

Figur 3

Statistisk analyse af restfordelingen i de 20-residue N-terminale α-helikale AMP’er med N-terminal strækning fra naturlige kilder. Der er vist en grafisk repræsentation af hyppigheden af forskellige typer af rester på hver position på en projektion af et helikalt hjul. Den ujævne fordeling af hydrofobiske og ladede peptider bidrager til peptidets amfipatiske natur (tilpasset fra Tossi et al. ).

Et peptids amfipatiske karakter kan beskrives ved dets hydrofobiske moment (), der kan beregnes som den vektorielle sum af individuelle aminosyrehydrofobiciteter, normaliseret til en ideel helix. En stigning i det hydrofobiske moment korrelerer med en øget permeabilisering af målcellemembranen. Dette er især vigtigt i interaktioner med lipidmembraner, der er neutralt ladede, hvor det er usandsynligt, at ladningsfaktorer vil medføre den nødvendige tiltrækning til og interaktion med målcellemembranen . Ligesom de α-helikale antimikrobielle peptider udviser β-ark-værtsforsvarspeptiderne også amfipathicitet. Dette viser sig som et varierende antal β-strenge, der er organiseret til at danne hydrofobiske og hydrofiliske overflader. β-strengene, som ofte er antiparallelle, stabiliseres af disulfidbindinger med regelmæssige mellemrum eller af en cyklisering af peptidryggen. Denne intramolekylære binding gør det muligt for β-bladede antimikrobielle peptider at opretholde en stiv konformation selv i vandig ekstracellulær væske og letter også multimerisering, da de hydrofobiske overflader vil samle sig for at undgå at blive udsat for det vandige miljø. Selv om de nøjagtige mekanismer, hvormed amfipatiske antimikrobielle peptider forårsager membranopløsning i målcellens membran, ikke er fastlagt på nuværende tidspunkt, hovedsagelig fordi den nøjagtige konformation af peptiderne i membranerne ikke er kendt, har undersøgelser vist, at adskilt amfipathicitet i både α-helikale og β-bladede antimikrobielle peptider har en dybtgående effekt på peptidopløsning af naturlige biomembraner .

5.4. Hydrofobicitet ()

Et peptids hydrofobicitet kan defineres som den procentdel af hydrofobiske aminosyrerester, der udgør dets primære struktur. For de fleste antimikrobielle peptider er hydrofobiciteten omkring 50 % og er afgørende for peptidets funktion, da den gør det muligt for peptidet at interagere med og trænge ind i fosfolipid-dobbeltlaget. Selv om en vis grad af hydrofobicitet er afgørende for, at det antimikrobielle peptid kan fungere, vil en for høj hydrofobicitet øge dets sandsynlighed for at ødelægge værtens celler og reducere dets specificitet over for mikrobielle celler . Wieprecht og medarbejdere har undersøgt forholdet mellem peptiders hydrofobicitet og deres evne til at permeabilisere biomembraner. Ved hjælp af magaininanaloger som antimikrobielle modelpeptider var de i stand til at holde faktorer som hydrofobt moment, helicitet og ladning næsten konstante, samtidig med at de fremstillede analoger med variabel hydrofobicitet. Deres eksperimenter viste, at hydrofobicitet havde lille eller ingen effekt på peptidets evne til at binde til eller permeabilisere membranen, når det udelukkende bestod af PG. I membraner bestående af et 3 : 1 forhold mellem PC : PG havde peptiderne med den højeste hydrofobicitet imidlertid en ca. 60 gange større permeabiliserende evne end det mindst hydrofobiske peptid, og i membraner bestående udelukkende af PC var der en 300 gange større forskel.

5.5. Polarvinkel ()

En peptidets polarvinkel henviser til den relative andel af polære til upolære facetter af peptidet, der er konformeret til en amfipatisk helix. Et spiralformet peptid, hvor den ene facet udelukkende består af polære aminosyrerester og den anden facet udelukkende består af upolære rester, vil have en polær vinkel på 180°. Mindre adskillelse mellem domænerne eller en overvægt af hydrofobiske rester ville føre til en lavere polær vinkel. Uematsu og Matsuzakis undersøgelser af både syntetiske og naturligt forekommende peptider har vist, at en lavere polvinkel og dermed en mere hydrofob facet er mere befordrende for permeabilisering af membranen. Polarvinklen er også blevet korreleret med stabiliteten af peptidinducerede porer i biomembraner. De viste også, at antimikrobielle peptider med mindre polære vinkler var i stand til at fremkalde en højere grad af membranpermeabilisering og translokation med højere hastighed end peptider med større polære vinkler. De porer, der blev dannet af peptider med mindre polære vinkler, var imidlertid mindre stabile end de porer, der blev dannet af peptider med større polære vinkler. Hydrofobiske og hydrofiliske egenskaber ved antimikrobielle peptider kan ses at spille afgørende roller i interaktionerne med og permeabiliseringen af phospholipidcellemembraner .

5.6. Fælles strukturelle træk ved antimikrobielle peptider

Selv om der findes en lang række forskellige antimikrobielle peptider i naturen, er der konstateret bevarelse af centrale træk og sekundære strukturer. Ekstreme egenskaber som f.eks. amfipathicitet, ladning, hydrofobt moment eller polær vinkel er ikke gavnlige, da de har en tendens til at kompromittere enten antimikrobiel aktivitet eller føre til øget cytotoksicitet af værtsceller. Den mindste ladning, som peptiderne må have for at udøve nogen form for antimikrobiel aktivitet, synes at være +2. Denne mindste kationicitet er vigtig, fordi den muliggør den indledende elektrostatiske tiltrækning til bakteriemembranen, som er negativt ladet. Det giver også mulighed for at fortrænge andre kationer, der eventuelt allerede er bundet til målcellens membran, og for at translokere dem ind i det indre af membranens dobbeltlag. På samme måde bør peptidets hydrofobicitet være moderat, da meget hydrofobiske antimikrobielle peptider vil være rettet mod membraner med en neutral nettoladning, som f.eks. værtscellerne, hvilket vil føre til en nedsat målselektivitet og skade på værtsorganismen. Det ses, at selektiv målretning af patogene mikrober i vid udstrækning skyldes en balance mellem de antimikrobielle peptiders elektronegativitet og hydrofobicitet .

6. Initiale interaktioner med målcellens membran

Den indledende interaktion mellem det antimikrobielle peptid og cellens fosfolipidmembran er vigtig, da den bestemmer målcellens selektivitet og også påvirker eventuelle efterfølgende interaktioner med målcellen. De indledende interaktioner er i høj grad bestemt af fysiske og kemiske egenskaber ved både det antimikrobielle peptid og målcellens membran.

6.1. Elektrostatiske interaktioner

Elektrostatiske interaktioner menes i vid udstrækning at være ansvarlige for den indledende målretning af den mikrobielle celle. En undersøgelse foretaget af Matsuzaki korrelerede antimikrobielle peptiders kationicitet med membranbindingsevnen, og det forhold, at kationicitet er et bevaret træk ved næsten alle antimikrobielle peptider i en lang række organismer, understøtter yderligere dette argument. Elektrostatiske kræfter virker over en lang rækkevidde, og de mange lysin- og argininrester i antimikrobielle peptider, som tiltrækkes af biomembranernes negativt ladede fosfatgrupper, giver yderligere troværdighed til teorien om, at disse interaktioner er ansvarlige for den indledende tiltrækning til målcellemembranen . I Gram-negative bakterier antages det, at de antimikrobielle peptider fortrænger de kationer, der normalt er forbundet med LPS, da antimikrobielle peptider har en bindingsaffinitet for LPS, der er ca. tre størrelsesordener større end de tosidige kationer, der normalt er forbundet med dette stof. Bakteriestammer, hvor LPS er stærkt substitueret med 4-amino-4-deoxy-L-arabinose eller er stærkt acyleret, udviser større modstandsdygtighed over for positivt ladede antimikrobielle peptider, hvilket giver yderligere troværdighed til teorien om, at elektrostatisk ladning er vigtig for interaktionen med målcellemembranen . Gram-positive bakterier mangler en LPS eller ydre cellemembran, men de har en tyk cellevæg bestående af teichuron- eller teichoinsyrepolymerer. Disse meget anioniske strukturer er ideelle mål for de kationiske antimikrobielle peptider. Stammer af Staphylococcus aureus, hvor teichoinsyrerne er blevet modificeret, hvilket resulterer i øget anionisk ladning, er mere modtagelige for kationiske antimikrobielle peptider . Det forhold, at de fleste bakterier har en stærk elektrokemisk gradient (Δψ) i forhold til pattedyrceller, menes også at øge målselektiviteten af antimikrobielle peptider .

6.2. Receptor-Ligand-interaktioner med membranen

Somlige undersøgelser har vist, at både naturligt forekommende og syntetiske peptider interagerer lige godt med membranen, uanset om der anvendes D-aminosyrer eller L-aminosyrer . Dette kunne tyde på, at interaktioner med biomembraner ikke er afhængige af receptor-ligand-mekanismer; andre undersøgelser har imidlertid vist, at dette måske ikke er tilfældet med alle antimikrobielle peptider. Nisin, et naturligt forekommende, cyklisk peptid med kraftig antimikrobiel virkning, har vist sig at binde specifikt til bakteriemembranbundet lipid II . På samme måde har tachyplesin vist sig at have en specifik affinitet for LPS. Dataene fra disse undersøgelser tyder på, at receptormedieret binding er vigtig for celletargeting i et lille antal antimikrobielle peptider.

7. Begivenheder efter den indledende membranbinding

Den eksperimentelle bestemmelse af peptiders indledende tiltrækning af og interaktion med cellemembraner er normalt enklere end bestemmelsen af de efterfølgende interaktioner. En række forskellige metoder såsom cirkulær dichroisme , røntgenkrystallografi, kernemagnetisk resonans , omvendt fase-højtydende væskekromatografi og overfladeplasmonresonans , blandt andre teknikker, er blevet anvendt til at belyse peptid-membran-interaktioner. Det anføres imidlertid, at den antimikrobielle virkning og mekanismerne er ekstremt følsomme over for forhold som pH, osmotisk styrke, opløsningens viskositet og temperatur, så alle data, der opnås ved hjælp af ovennævnte teknikker, skal ses i lyset af disse forhold . Efter den indledende membranbinding trænger antimikrobielle peptider gennem den ydre fosfolipidmembran, en fase, der kaldes tærskelkoncentration, og derved kan de udøve deres cytotoksiske virkninger i cellens indre. For at peptiderne kan trænge ind i cellen, kræves der et minimumsantal eller en tærskelkoncentration af antimikrobielle peptider for at akkumulere sig på lipidemembranens overflade. Denne begivenhed kan påvirkes af andre faktorer end koncentrationen, f.eks. peptidernes evne til at multimerisere og også af selve fosfolipidmembranens egenskaber, f.eks. dens lipidsammensætning, hovedgruppestørrelse og væskefylde . Bilagets transmembranpotentiale kan også påvirke den måde, hvorpå peptidet kommer ind i membranen, da et meget negativt transmembranpotentiale vil lette poredannelsen ved at trække det positivt ladede peptid ind i membranen .

8. Ændringer i peptidkonformationen ved interaktion med membranen

Mange antimikrobielle peptider, især dem med α-helikale sekundærstrukturer, undergår en betydelig konformationsomlægning, når de kommer ind i det upolære miljø i den indre membran. De α-helikale antimikrobielle peptider er normalt uordnede i det ekstracellulære miljø, idet de udviser tilfældige spole- eller forlængede strukturer, men tilpasser sig hurtigt til en struktureret α-helix, når de er associeret med biomembranen . Nogle antimikrobielle peptider kan kun undergå denne konformationsændring i forbindelse med en negativt ladet dobbeltlagsmembran. Dette kan skyldes den måde, lipiderne er anbragt i sådanne membraner, idet fosfolipidhovedgrupperne fremkalder optimal periodicitet af de kationiske aminosyrerester i peptidet, hvilket igen fremmer korrekt konformation til den helikale sekundærstruktur . Det er blevet foreslået, at denne egenskab sikrer, at de antimikrobielle peptider kun “aktiveres” til den cytotoksiske form i tilstedeværelsen af målcellens membran, i dette tilfælde en negativt ladet bakterie, og ikke vilkårligt vil skade værtsceller uden for målgruppen . De intramolekylære disulfidbindinger, der findes i β-bladpeptider, sikrer, at de bevarer deres sekundære struktur selv i vandige miljøer, og de undergår derfor ikke de drastiske konformationsomlægninger, der ses i α-helikale peptider, selv om kvaternære peptidstrukturer kan dissocieres, når de kommer ind i membranen, og dette kan lette selektiv toksicitet . Efter den indledende interaktion med cellemembranen kan mange peptider undergå selvassociation, som i kombination med lipid-peptid-interaktioner kan føre til dannelse af komplekse strukturer, der bidrager til peptidets cytotoksiske virkninger. Det antimikrobielle peptidets aminosyresekvens og konformation i monomerform vil diktere dets evne til at danne disse strukturer. I amfipatiske peptider er de hydrofobiske domæner i stand til at interagere med den upolære hydrofobiske kerne i lipiddobbeltlaget og derved drive peptidet dybere ind i membranen. Alternativt kan de også interagere med de hydrofobiske facetter af andre peptider, hvilket fremmer multimerisering i et forsøg på at undgå eksponering af disse facetter for vandigt miljø. Denne type multimerisering og interaktion med lipiddobbeltlagets indre kan resultere i, at der dannes peptidforede porer eller kanaler i biomembranen, hvilket resulterer i tab af integritet og permeabilisering. Da biomembraner er meget variable i sammensætning og struktur, er det muligt, at et peptid kan opføre sig på en række forskellige måder, når det er forbundet med forskellige cellemembraner . Der er blevet foreslået flere modeller til at beskrive den poredannelse, der er observeret i membraner, der har været udsat for antimikrobielle peptider.

8.1. Tønde-stavemodellen

Denne mekanisme til dannelse af membranporer har fået sit navn, fordi transmembranpeptiderne eller peptidkomplekserne, der beklæder kanalen, er placeret i en tøndeformet ring, hvor peptiderne danner transmembranstave. Amphipatiske peptider er orienteret således, at de hydrofobiske domæner interagerer med de upolære kulbrintehaler, der er placeret i lipidemembranens indre, mens de hydrofiliske domæner er orienteret således, at de vender mod porens vandige kanal og danner dens foring . I første omgang akkumuleres monomerpeptiderne ved celleoverfladen og undergår en konformationsomlægning, når de kommer i kontakt med membranen (figur 4). Man mener, at dette tvinger fosfolipidhovedgrupperne til side og fremkalder en udtynding af membranen. Dette gør det muligt for den hydrofobiske del af peptidet at trænge ind i membranens upolære indre, mens de kationiske aminosyrer i det antimikrobielle peptid interagerer med de negativt ladede hovedgrupper. Når tærskelkoncentrationen af peptiderne er nået, kan peptidmonomerne aggregere og danne multimere, hvilket yderligere tvinger peptiderne ind i membranens hydrofobiske centrum, da aggregationen forhindrer de hydrofile dele af peptidet i at blive eksponeret for de hydrofobiske dele af den indre membran (figur 4(a)). Efterhånden som et stadig større antal peptidmonomerer aggregeres, udvides porerne i membranen .

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 4

Oversigt over mulig interaktionsmekanisme efter peptidinteraktion med bakteriecellemembranen , dvs. (a) tønde-stavemodel (poredannelse), (b) toroidal model (poredannelse) og (c) tæppemodel (membranopløsning). Rødt farvede peptidområder: hydrofile; blå farvede peptidområder: hydrofobiske.

8.2. Den toroidale poremekanisme eller ormehulsmekanismen

Denne mekanisme for poredannelse er blevet godt undersøgt ved hjælp af de α-helikale magaininpeptider. Ved kontakt med den ladede cellemembran antager de desorganiserede peptider den α-helikale struktur. I første omgang orienterer helikserne sig selv, så de er parallelle med membranens overflade. De polære fosfolipidhovedgrupper forskydes, og membranens overflade svækkes, hvilket resulterer i en positiv krumningsspænding i membranen. Som følge af denne belastning og udtynding destabiliseres membranen og bliver mere modtagelig over for yderligere peptidinteraktioner. Når en tærskelkoncentration af peptider er nået, omorienterer peptiderne sig, så de står vinkelret på membranen og begynder at multimerisere sig, således at de hydrofile dele af peptiderne ikke er i kontakt med de hydrofobiske dele af membranen (figur 4(b)). Den nyligt dannede toroidale pore er ustabil, og ved opløsningen tvinges nogle af peptiderne ind i cellemembranens indre blad. Man mener derfor, at opløsningen af disse forbigående porer er vigtig, da den gør det muligt for peptiderne at translokalisere sig ind i det intracellulære rum, hvor de kan virke på andre mål.

8.3. Tæppemodellen

Tæppemodellen for membranpermeabilisering er baseret på diffus virkning af mange monomerpeptider på den cellulære membran. Når der er tilstrækkeligt høje koncentrationer af visse antimikrobielle peptider til stede på cellemembranen, fortrænges nogle af membranens fosfolipider, hvilket resulterer i ændringer i membranens fluiditet eller medfører svagheder i membranens barriereegenskaber. Den kumulative virkning af disse forskydninger er, at membranen bliver svækket og mister sin integritet. Som tidligere antydet er den indledende tiltrækning af de antimikrobielle peptider til membranen elektrostatiske tiltrækningskræfter. Der dannes ingen specifikke kanaler eller porer, og det antages, at permeabilisering og tab af membranintegritet skyldes de ugunstige energimæssige egenskaber, som spredningen af fosfolipiderne medfører (figur 4(c)) .

9. Bakterieinfektioners indvirkning på menneskers sundhed og traditionelle metoder til infektionsdiagnostik

Det anslås, at op til 85 % af de kritisk syge patienter på hospitalet har feber, men ikke udviser andre ydre tegn på infektion. Da langvarige feberepisoder kan være dødelige, er det vigtigt, at en eventuel underliggende infektion påvises så hurtigt som muligt, således at den korrekte behandling kan iværksættes . Traditionelle metoder til diagnosticering kan omfatte undersøgelse af vævsbiopsier og forsøg på at dyrke patogener, hvilket ofte er en upræcis og tidskrævende opgave, som kan forsinke behandlingens iværksættelse. Der anvendes også diagnostiske billeddiagnostiske procedurer, som kan omfatte computertomografi (CT) eller magnetisk resonansbilleddannelse (MRI). Disse teknikker er dog generelt ikke i stand til at påvise infektioner på et tidligt stadium, da de kræver morfologiske ændringer i vævene, hvilket normalt er et træk, der er forbundet med avancerede infektioner . Desuden er de generelt fokuseret på bestemte dele af kroppen, hvilket betyder, at det er muligt, at man overser infektionen, eller at man ikke opdager infektionens virkelige omfang. Gallium-radiolabelede antistoffer eller -immunoglobuliner eller komplekser som f.eks. 67/68Ga-citrat kan anvendes til at fremhæve områder, hvor der foregår leukocyt-trafikering ved hjælp af SPECT- eller PET-scanning. Disse teknologier er imidlertid ikke i stand til definitivt at skelne mellem inficeret væv og væv, der er betændt, men sterilt, da der i begge tilfælde forekommer leukocyt-trafikering . I betragtning af den høje specifikke affinitet af naturligt forekommende antimikrobielle peptider for patogene bakterier eller svampe i modsætning til værtsorganismens celler, blev det overvejet, at de kunne anvendes til at hjælpe med opløsningen af diagnostiske billeddannelsesprocesser.

9.1. Anvendelse af antimikrobielle peptider som radiofarmaka

I princippet bør et radiofarmaka, der anvendes til billeddannelse af infektioner, give mulighed for hurtig påvisning af bakterier og hurtig fjernelse fra de ikke-inficerede steder. Det skal også udvise en høj og specifik optagelse på det inficerede sted med minimal akkumulering i sterilt eller ikke-målvæv. Stoffet skal også have lav toksicitet og må ikke fremkalde et immunrespons. Meget vigtigt er det, at det skal kunne skelne mellem en steril og en inficeret betændelse . Da antimikrobielle peptider generelt udviser et bredt aktivitetsspektrum mod en lang række patogene gær og bakterier, er de ideelle målmolekyler for infektioner, hvor det formodede patogen ikke er blevet identificeret. Desuden kræver deres virkemåde, at de fysisk forbinder sig med patogenet, og derfor vil de være i stand til at bringe en gamma- eller positronemitterende kilde, f.eks. technetium-99m (99mTc) eller gallium-67 (67Ga), til det nøjagtige sted, hvor infektionen er opstået. Deres manglende affinitet for værtsorganismens celler betyder også, at de ikke vil ophobes i sterilt betændt væv. Radiomærkede antimikrobielle peptider er også attraktive, fordi de hurtigt fjernes fra kredsløbssystemet og udskilles af kroppen. Desuden er de også i stand til at trænge ind i det ekstravaskulære væv og dermed ophobes på inficerede steder i løbet af meget kort tid. Ideelt set bør radiomærkningsproceduren for et målmolekyle gøre det muligt at fastgøre et radionuklid til molekylet, uden at det påvirker dets målretningsevne eller molekylets farmakokinetik negativt. Mærkningsmetoderne kan enten være direkte eller indirekte som følger:(i)Ved direkte mærkning (figur 5(a)) inkorporeres radionuklidet i målmolekylet via en kovalent binding. I tilfælde af peptidmålmolekyler kan der dannes en kovalent binding mellem radionuklidet og en passende fri amidrest af Lys og Arg . Anvendelse af tyrosinrester kan medføre problemer i forbindelse med mærkning, herunder uspecifik eller dårlig binding, kompleksets ustabilitet in vivo og uønskede ændringer af peptidstrukturen, som f.eks. spaltning af interne disulfidbindinger, hvilket kan ændre dets funktion .(ii) En indirekte mærkningsstrategi kan anvendes ved at tilsætte kelatdannende stoffer til målmolekylet (figur 5(b)) . Bifunktionelle chelater er blevet anvendt til at mærke peptidbærermolekyler med radionuklider. Chelatdannelsesmidlet kan være præbelastet med radionuklidet, inden det bindes til bærermolekylet, eller det kan først bindes til bærermolekylet og derefter udsættes for nuklidet med henblik på chelatdannelse i en proces, der kaldes post-mærkning. Eftermærkning har den fordel, at bærermolekylet kan opbevares i lang tid, indtil der er behov for det, og at radionuklidet, som undergår henfald, kan tilsættes kort tid før indgivelsen af det radioaktive lægemiddel. Dette er en fordel for markedsføringen af bærermolekylet og gør teknologien lettere at anvende på hospitaler og klinikker .

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 5

Ansatser inden for radiomærkning af peptider. Den direkte metode (a), hvor radionukliderne er kovalent bundet til peptidet, og den indirekte metode (b), hvor radionukliderne er bundet til målpeptiderne ved hjælp af bifunktionelle chelatorer .

9.2. Ubiquicidin er et eksempel på en metode til antimikrobielle peptider fremstillet af radiofarmaka

Det antimikrobielle peptid ubiquicidin (UBI) med 59 aminosyrerester er et 6,7 kDa peptid, som først blev opdaget i cytosoliske ekstrakter af murine makrofager (figur 6). Det blev påvist, at dette peptid udviser antimikrobielle virkninger mod Salmonella typhimurium og Listeria monocytogenes. Det blev efterfølgende fundet i en lang række andre organismer, herunder mennesker . Da det forekommer naturligt i mennesket, er ubiquicidin ikke en immunogen enhed, hvilket gør det velegnet til administration som et diagnostisk værktøj. Det har også en høj affinitet for bakterieceller, men er ikke rettet mod pattedyrceller, hvilket gør det ikke giftigt for patienten og selektivt, idet det er usandsynligt, at det ophobes på sterile betændelsessteder . Der er foretaget adskillige undersøgelser af fragmenter af ubiquicidin både in vitro og in vivo for at vurdere dets evne til at binde til bakterieceller.

Figur 6

Primær struktur af ubiquicidin som oprindeligt rapporteret af Hiemstra og kolleger .

Welling og medarbejdere evaluerede hele det mærkede ubiquicidin og forskellige radiomærkede fragmenter af peptidet, herunder UBI1-18 (KVHGSLARAGKVRGQTPK), UBI29-41 (TGRAKRRMQYNRR), UBI18-29 (KVAKQQEKKKKKT), UBI18-35 (KVAKQEKKKKKKKTGRAKRR), UBI31-38 (RAKRRMQY) og UBI22-35 (QEKKKKKKKTGRAKRR) for deres evne til at binde sig til bakterieceller og/eller humane leukocytter in vitro. De fandt, at ubiquicidinpeptidfragmenterne UBI 18-35, UBI 31-38, UBI 22-35 og UBI 29-41 viste betydeligt højere bindingsaffinitet for bakteriecellerne end for de humane leukocytter. De in vivo-resultater, der blev opnået ved scintigrafi af eksperimentelt inficerede mus efter intravenøs indgift af de forskellige radiomærkede peptider, viste, at UBI18-35- og UBI29-41-peptiderne syntes at være de mest lovende kandidater. Efter en postadministrationsperiode på 2 timer og 24 timer var bindingsforholdet mellem leukocytter og bakterier 1 : 36, 1 : 166, og 1 : 73, 1 : 220 for henholdsvis UBI18-35 og UBI29-41. Forskerne konkluderede, at UBI29-41 og UBI18-35 var de optimale peptider til at skelne infektioner fra sterile inflammationer.

9.3. Kliniske forsøg på mennesker med -Ubiquicidin 29-41 som billeddannelsesmiddel for infektioner

Akhtar og medarbejdere undersøgte effektiviteten af -UBI 29-41 som billeddannelsesmiddel for infektioner hos atten patienter med mistanke om infektioner i proteser eller bløddele. Ved hjælp af scintigrafi til overvågning af det radiomærkede peptid var forskerne i stand til at overvåge forholdet mellem mål og ikke-mål (T/NT) for billeddannelsesmidlet. Infektionen hos patienterne blev bekræftet ved dyrkning af bakterier fra det inficerede sted, eller, hvor dette ikke var muligt, ved en fuldstændig blodundersøgelse. Undersøgelsen viste, at alle patienterne tolererede det radiomærkede peptid godt, der blev ikke konstateret væsentlige ændringer i deres vitale tegn, og der blev ikke set nogen relaterede bivirkninger efter indgivelsen af -UBI 29-41. T/NT-forholdet blev bestemt ved 30, 60 og 120 minutter, hvor 30-minutters scanningen viste den højeste gennemsnitlige T/NT-værdi. Den forreste helkropsscanning (figur 7) gav oplysninger om tracerens biodistribution og dens eliminationsveje i kroppen. Det kan ses, at sporstoffet hovedsageligt elimineres via urinsystemet, og der blev også konstateret en vis perfusionsafhængig leveraktivitet. Det blev konstateret, at billeddannelsesmidlet havde en sensitivitet på 100 % og en specificitet på 80 %. Forskerne konkluderede, at -UBI 29-41 havde en positiv prædiktiv værdi på 92,9 %, en negativ prædiktiv værdi på 100 % og en samlet diagnostisk nøjagtighed på 94,4 %. Det radiomærkede peptid viste effektivitet over for en række forskellige bakterier, herunder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Streptococcus pyogenes. Det var forskernes opfattelse, at -UBI 29-41 er et meget følsomt og specifikt billeddannelsesmiddel til påvisning af infektioner i blødt væv og knogler hos mennesker.

Figur 7

Anterior helkropsbillede taget 30 min. efter sporstofinjektion, der viser nyrer (stiplet pil), lever (solid pil) og urinblære (kuglepil) (tilpasset fra ).

10. Diskussion og perspektiv

Anvendelsen af nuklearmedicinske modaliteter som SPECT eller PET giver klinikere mulighed for ikke-invasiv helkropsundersøgelse af fysiologiske processer som f.eks. skjult infektion på celleniveau, og ud over at være et nyttigt redskab til fysiologisk og medicinsk forskning er disse meget følsomme teknologier i stand til at påvise sygdomme uden anatomiske ændringer eller forud for anatomiske ændringer (feber af ukendt oprindelse). Hidtil har man anvendt radiomærkede leukocytter, monoklonale antistoffer mod cytokiner/leukocytter og sporstoffer, der er forbundet med specifikke molekylære mål eller metaboliske processer . Radiomærkede leukocytter har en række begrænsninger (ændring af leukocytfunktionen som følge af strålingsskader), dvs. de har en besværlig farmakokinetik og er også relativt uspecifikke. Desuden kan mærkede leukocytter og sporstoffer med høj molekylvægt som f.eks. antistoffer også have begrænset indtrængning i inficeret eller sygt væv. Sidstnævnte præsenterede oversigt, som tydeliggør det udbredte potentiale for AMP’er til at blive evalueret som billeddannende sonder i betragtning af deres unikke selektive involvering med bakterier. En simpel litteratursøgning med søgning på “antimicrobial peptides” resulterede i ca. 6000 publikationer. Så snart forespørgslen kombineres med udtrykket “imaging”, resulterede den imidlertid kun i 63 publikationer; kun 17 af disse har klinisk relevans (-UBI-29-41 relaterede undersøgelser/forsøg). Dette er en vigtig observation, da dette ubiquicidin-fragment kan udgøre en næsten perfekt bærer for målrettede molekyler til påvisning af infektioner. I de kliniske forsøg på mennesker, som Akhtar og kolleger gennemførte med -UBI 29-41, blev der ikke fundet tegn på cytotoksicitet hos patienterne, hvilket understøtter resultaterne af den aktuelle undersøgelse. Selv om det blev anført, at signal/støjforholdet er lavt, er det blevet anvendt med succes i 10 år nu. I 2010 begrundede de Murphy et al. de hidtidige kliniske forsøg med deres diagnostiske værdi i den indledende 7-årige periode. -UBI 29-41-metaanalysen gav høje værdier for sensitivitet (96,3 %), specificitet (94,1 %) og nøjagtighed (95,3 %) med høje positive prædiktive (95,1 %) og negative prædiktive værdier (95,5 %) . Fra 2011 og fremefter er der gennemført yderligere syv kliniske undersøgelser (med tilsammen over 160 patienter), som alle har vist, at -UBI29-41-SPECT er et meget nøjagtigt og selektivt diagnostisk værktøj for knogleinfektion i forbindelse med diabetisk fod , hofteproteser eller andre implantatrelaterede infektioner; desuden påvises også osteomyelitis og infektiøs endokarditis . Det kan konstateres, at dette anvendelsesområde for -UBI29-41-billeddannelse vil fortsætte med at vokse, også fordi forskning med andre alternative radioisotoper end radioisotoper kan give en ny gruppe af radiofarmaceutiske stoffer til medicinsk diagnostisk billeddannelse ved hjælp af klinisk PET/CT eller PET/MRI i fremtiden. Nye radioisotoper som 68Ga, 82Rb eller 62Cu kan produceres efter behov fra en radioisotopgenerator uden behov for en cyklotron på stedet og kan anvendes som radionuklider til PET. 68Ga har vakt interesse som positronemitter til molekylær billeddannelse på grund af nogle af de fordele, det giver som sporstof. Det har en radioaktiv halveringstid på 67,71 minutter, hvilket gør det kompatibelt med biokinetikken for de fleste radiofarmaceutiske stoffer med lav molekylvægt, f.eks. peptider, oligonukleotider, aptamerer eller antistoffragmenter. Isotopens nukleare henfald sker hovedsagelig ved hjælp af positronemission (89 %) med en gennemsnitlig positronenergi på 740 keV. Desuden er Ga3+’s koordinationskemi velforstået, hvilket er nyttigt ved udformningen af chelaterende stoffer, som kan bruges til at knytte dette radionuklid til en målrettet vektor. For nylig blev UBI29-41 konjugeret til makrocyklussen 1,4,7-triazacyclononan-1,4,7-triacetat (NOTA) og efterfølgende mærket med 68Ga . Denne fremgangsmåde blev oprindeligt anvendt med 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N′,N′′,N′′′′′,N′′′′ ′-tetraeddikesyre (DOTA) for at opnå peptidderivater såsom DOTA-TOC eller DOTA-TATE til 68Ga-kompleksering, som efterfølgende muliggjorde tumorreceptorbaseret PET-billeddannelse. I en præklinisk undersøgelse med 68Ga-NOTAUBI29-41-PET blev det vist, at makrocykluskonjugeringen ikke kompromitterede peptidets evne til selektivt at binde til bakterier in vivo . Ud over UBI er der andre forbindelser, der er evalueret med henblik på afbildning af infektion og inflammation, men størstedelen af de tilgængelige antimikrobielle peptider er fortsat underundersøgt med hensyn til afbildning af infektion. I 2000 blev de humane neutrofile peptider (HNP1-3) blandt andre peptider betragtet som et nyttigt middel til målretning af infektioner, da HNP’er som en del af forsvarsmekanismen i monocyt/lymfocytkulturer spiller en kemotaktisk rolle som formidlende molekyler. Denne tvetydige rolle kan være en ulempe ved udvikling af HNP’er til billeddannelse; derfor kan brugen af bestemte peptider som målrettede vektorer have nogle sekundære begrænsninger på trods af deres gunstige cellulære egenskaber . Da radiofarmaceutiske stoffer for det meste administreres ved i.v.-injektion, kan peptiderne være udsat for enzymatisk nedbrydning eller destabilisering af radioisotopen, som det er rapporteret for 18F-UBI29-41 . Det lactoferrin-afledte peptid hLF(1-11) viste stor følsomhed som infektionsmiddel rettet mod multiresistente Acinetobacter baumannii-stammer; binding til Candida albicans, en svamp, og den hepatobiliære udskillelse gjorde det imidlertid mindre gunstigt til billeddannelse . Desuden viste hLF immunaktiverende eller bakteriedræbende virkninger afhængigt af den indgivne dosis, dvs. mødt med en negativ feedback-mekanisme ved interleukin-10-modulation . Et andet eksempel, AMP Latarcin-2a, der er udvundet af giften fra den centralasiatiske edderkop Lachesana tarabaevi, har uønsket lytisk aktivitet mod Gram-positive og Gram-negative bakterier, erytrocytter og gær ved mikromolære koncentrationer, hvilket gør det mindre velegnet til bakteriedetektion med PET . Desuden er de fleste bakterier i stand til at producere både overfladebundne og/eller sekretoriske proteaser, som er en forsvarsstrategi, der kan nedbryde eller inaktivere AMP’er. Følgelig vil brugen af AMP-afledte forbindelser som billeddannelsesmidler resultere i falsk-negative diagnoser, hvor en vedvarende infektion let kan fejlvurderes eller overses helt og holdent. Ved at forstå disse specifikke bakterieintrinsiske forsvarsmekanismer kan det undgås at anvende sårbare AMP-afledte strukturer som billeddannelsesmidler i forbindelse med infektioner. Det skal også bemærkes, at forskningen, bortset fra nogle få strukturer, ikke har afsløret et bakteriespecifikt receptorlignende mål, der supplerer de potentielle peptider som ligander eller allosteriske modulatorer. Tumorceller udtrykker derimod specifikke receptorer integrin-, bombesin- eller somatostatin-ligander eller -antagonister, som er mål for SPECT- eller PET-tracere . Desuden har værtens immunsystem, når det reagerer på infektioner, patologiske veje, som kan afbildes ved hjælp af PET. Aktiverede makrofager kan fungere som et tilsvarende værtsafhængigt mål, som kan visualiseres uspecifikt ved hjælp af 18F-FDG, men den faktiske bakteriebyrde er stadig ikke synlig. I modsætning hertil virker AMP-afledte peptider efter en værtsuafhængig mekanisme: radiomærkede peptider binder sig til frie og celleadhærente, men ikke til fagocyterede bakterier, og derfor bliver bakterier usynlige for -UBI29-41-SPECT, når de først er optaget af makrofager . Anvendelsen af denne modalitet giver potentielt mulighed for tidlig påvisning af infektion, før der sker morfologiske ændringer i kroppen . Den gør det også muligt at skelne mellem infektion og en steril betændelse, som overfladisk set kan se ens ud, da begge dele kan fremstå som rødlige, hævede og usædvanligt varme områder. Dette skyldes den øgede blodgennemstrømning, den øgede vaskulære permeabilitet og tilstrømningen af hvide blodlegemer, som er fælles i begge situationer . Sidstnævnte fremgangsmåde ville lægge vægt på et billeddannelsesregime med to sporstoffer i fremtidige kliniske undersøgelser eller endog to sporstofadministrationer (hvis de respektive radioisotopegenskaber og farmakokinetiske egenskaber supplerer fremgangsmåden). Sammenfattende kan man sige, at den ideelle tracer til klinisk PET-billeddannelse af infektioner bør opfylde flere kriterier. (1) Den bør undergå en betydelig nedbrydning i blodet og have en rimelig grad af lipofilihed; (2) den bør akkumuleres og fastholdes på infektionsstedet (ideelt set ved internalisering og efterfølgende forstærkning) med minimal akkumulering på ikke-inficerede steder; (3) den bør have hurtig clearance af uspecifik aktivitetsoptagelse fra de omkringliggende regioner med henblik på høje signal-støj-forhold; og (4) den bør have minimale bivirkninger og bør være let at fremstille til lave omkostninger. UBI29-41 har vist sin anvendelighed i forbindelse med billeddannelse af generiske infektioner, og andre egnede AMP-baserede radiofarmaka vil utvivlsomt følge efter.

Abkortelser

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Anerkendelser

Arbejdet i forbindelse med denne gennemgang blev finansieret og venligst støttet af National Research Foundation (NRF), Institute of Cellular and Molecular Medicine og Nuclear Technologies in Medicine and the Biosciences Initiative (NTeMBI), en national teknologiplatform udviklet og forvaltet af South African Nuclear Energy Corporation (Necsa) og finansieret af Department of Science and Technology (DST).