Antinociceptiv aktivitet af methanolekstrakt af Tabebuia hypoleuca (C. Wright ex Sauvalle) Urb. Stems

Abstract

Objektiv: Formålet med denne undersøgelse var at evaluere den antinociceptive aktivitet af methanolekstrakt af Tabebuia hypoleuca-stængler (THME). Materialer og metoder: Dyrene blev inddelt i 5 grupper af 8 mus til hver test (negative kontroller, positive kontroller og 3 grupper behandlet med THME i doser på 150, 300 og 500 mg/kg, p.o.). Den antinociceptive virkning af THME blev evalueret ved hjælp af writhing-, formalin-, tail flick- og hot plate-modellerne hos mus. Resultater: I writhing-testen gav THME (150, 300 og 500 mg/kg) signifikant (p p p p p p p p p p p p konklusioner: Disse resultater viser, at THME havde antinociceptiv aktivitet ved hjælp af flere nociceptionsmodeller, og de tyder på, at effekten formidles ved deltagelse af både perifere og centrale antinociceptive mekanismer.

© 2017 Forfatteren/forfatterne Udgivet af S. Karger AG, Basel

Undersøgelsens betydning

– I denne undersøgelse blev det vist, at Tabebuia hypoleuca har antinociceptive virkninger, der formidles ved deltagelse af både perifere og centrale antinociceptive mekanismer. T. hypoleuca-arten kunne blive en ny terapeutisk mulighed for behandling af smerte.

Indledning

Smerte er en subjektiv oplevelse som følge af opfattelsen af en skadelig stimulus, og den omfatter en følelsesmæssig komponent, der kræver, at individet er bevidst, når dette sker . I 1986 definerede International Association for the Study of Pain (IASP) smerte som en ubehagelig sensorisk og følelsesmæssig oplevelse, der er forbundet med en faktisk eller potentiel vævsskade, eller som beskrives i form af en sådan skade . Smerte har også en fysiologisk komponent, som kaldes nociception, dvs. den proces, hvorved intense termiske, mekaniske eller kemiske stimuli registreres af en subpopulation af perifere nervefibre kaldet nociceptorer .

I forbindelse med smertelindring anvendes klassiske analgetiske lægemidler, navnlig opiater og ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler . Langtidsbrug af disse midler kan imidlertid give betydelige bivirkninger, herunder mavesår, nyreskader, bronkospasme, hjerteforstyrrelser, afhængighed og andre, hvilket begrænser deres anvendelse . På trods af de seneste fremskridt i udviklingen af smertebehandlingsbehandlinger er der stadig behov for effektive smertestillende midler. I årenes løb har naturprodukter vist sig at være en uovertruffen kilde til molekylær diversitet, der fører til opdagelse af lægemidler, der i øjeblikket anvendes i moderne medicin, især til behandling af smerter .

Tabebuia spp. (Bignoniaceae) omfatter ca. 100 arter, kendt som strengt træagtige, der findes i tropiske regnskovsområder i hele Central- og Sydamerika . Arter af slægten Tabebuia er traditionelt blevet anvendt til behandling af syfilis, malaria, kutaninfektioner, maveforstyrrelser, kræft, inflammation, smerter, bakterie- og svampeinfektioner, angst, dårlig hukommelse, irritabilitet, depression m.m. .

Tabebuia hypoleuca (C. Wright ex Sauvalle) Urb., almindeligvis kendt som “Roble macho”, er en endemisk art på Cuba, der er hjemmehørende i Sierra Maestra og Guantanamo. Vi har tidligere rapporteret om den antiinflammatoriske aktivitet af methanolekstrakt af T. hypoleuca-stængler (THME) ved hjælp af carrageenininducerede podeødemmodeller og crotonolieinduceret ødem i ørerne hos mus . Den foreliggende undersøgelse blev gennemført for at evaluere den antinociceptive aktivitet af THME, der blev administreret oralt i dyremodeller af smerte.

Materiale og metoder

Plantemateriale og ekstraktion

T. hypoleuca-stængler blev indsamlet i den nationale botaniske have (JBN), Havanna-provinsen, Cuba. Identifikationen af planten blev bekræftet af Dr. Eldis R. Becquer, og en prøve blev deponeret i forsøgsstationens herbarium med nummer HFC-88204. Der blev anvendt fast-væske-ekstraktion i Soxhlet med methanol (Merck®) til ekstraktion af T. hypoleuca-stængler. Methanolekstraktet blev filtreret og koncentreret ved hjælp af roterende fordampning.

Medikamenter og kemikalier

De anvendte lægemidler og kemikalier var: indometacin (SOLMED, Havana, Cuba), diclofenac (SOLMED), methanol (Merck, Tyskland), eddikesyre (Merck) og formalin (Merck). Ekstraktet og alle lægemidlerne blev fortyndet i 0,9 % saltopløsning (NaCl fortyndet i destilleret vand).

Dyr

Han og hun Balb/c-mus (20-25 g) og hun Sprague-Dawley rotter (180-200 g) blev leveret af det nationale center for laboratoriedyreproduktion (CENPALAB, Santiago de Las Vegas, Havana, Cuba). Dyrene blev holdt under standardbetingelser på 23 ± 2 °C, 40-60 % relativ luftfugtighed og en lys/mørke-cyklus på 12/12 timer, og de fik mad og vand ad libitum i 7 dage. Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med de internationale retningslinjer for pasning og brug af forsøgsdyr og godkendt af den dyreetiske komité ved det nationale center for dyre- og plantesundhed (CENSA, Havana, Cuba) (protokol nr. 03/FT/15).

Akut oral toksicitet

Den akutte orale toksicitetsundersøgelse blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD; retningslinje 423). Der blev anvendt sunde hunrotter uden parringstid til denne undersøgelse. Rotterne blev inddelt i 2 grupper med 3 dyr i hver gruppe. Fra 12 timer før til 3 timer efter den orale indgift blev dyrene holdt uden adgang til mad og vand. Kontrolgruppen fik normal saltvand på 1 mL/kg ved gavage, mens den eksponerede gruppe fik 2.000 mg/kg THME. Sikkerheden af dosis på 2 000 mg/kg blev efterfølgende bekræftet på yderligere 3 dyr som anbefalet i OECD-retningslinjerne. Umiddelbart efter administrationen blev alle dyrene observeret i i alt 14 dage på grundlag af de fastsatte kriterier, idet der blev lagt særlig vægt på de første 4 timer; der blev noteret kliniske tegn eller dødelighed. På dag 15 blev alle dyrene aflivet ved cervikal dislokation, efterfulgt af nekropsi og makroskopisk observation af organerne .

Writhing Test

Writhing Testen blev udført som beskrevet af Koster et al. med få modifikationer . Hanmus blev inddelt i 5 grupper på hver 8 mus i 5 grupper på 8 mus. Dyrene blev behandlet oralt med indometacin (20 mg/kg), destilleret vand (10 mL/kg) og THME (150, 300 og 500 mg/kg). Vridning blev fremkaldt ved intraperitoneal injektion af 0,8 % eddikesyreopløsning (0,01 mL/g kropsvægt) 1 time efter behandlingen. Vridningerne (indsnævring af maven og strækning af bagbenene) blev talt i 15 min. efter injektion af eddikesyreopløsningen. Den procentvise analgetiske aktivitet blev beregnet som følger:

Formalin-test

Formalin-testen blev udført som beskrevet af Santos og Calixto . Formalininduceret smerteadfærd var bifasisk; den indledende akutte fase (neurogen smerte) varede 0-5 min og blev efterfulgt af en relativt kort hvileperiode, hvorefter der fulgte en langvarig tonisk reaktion (inflammatorisk smerte), der varede 15-30 min. Hanmus blev inddelt i 5 grupper på hver 8 mus. Dyrene blev behandlet oralt med diclofenac (10 mg/kg), destilleret vand (10 mL/kg) og THME (150, 300 og 500 mg/kg). Efter 30 min. blev dyrene injiceret med 20 μL af en 2,5 % formalinopløsning (37 % formaldehyd) på plantaroverfladen af højre bagpote. Nociceptionsindekset, dvs. den samlede tid, som hvert dyr brugte på at slikke eller bide i den injicerede pote, blev registreret i 30 minutter.

Tail Flick Test

Hail Flick Testen blev udført i henhold til D’Amour og Smith . Hanmus blev inddelt i 5 grupper på hver 8 mus. En til 2 cm af musens hale blev nedsænket i varmt vand, der blev holdt konstant på 55 ± 0,5 °C. Latencen mellem nedsænkning af halen og defleksion af halen blev registreret. Mus, der viste en latenstid på mellem 1,5 og 3,5 s, blev udvalgt til denne undersøgelse 24 timer før forsøget, og latenstiden for forbehandlingen blev registreret. Dyrene blev behandlet oralt med indometacin (20 mg/kg), destilleret vand (10 mL/kg) og THME (150, 300 og 500 mg/kg). 60 minutter efter den orale indgift blev reaktionstiden igen registreret. Der blev anvendt en grænsetid på 10 s for at undgå skader på halevævet hos musene. Procentdelen af analgetisk aktivitet blev beregnet som følger:

Hot Plate Test

The hot plate test blev udført som beskrevet af Asongalem et al. . Hunmus blev inddelt i 5 grupper på hver 8 mus i 5 grupper på 8 mus. Anordningen bestod af et vandbad, hvori en metalcylinder (diameter 20 cm og højde 10 cm) blev anbragt. Cylinderens temperatur var indstillet til 55 ± 0,5 °C. De mus, der viste slikken af forpoter, tilbagetrækning af pote(r) eller en hoppereaktion inden for 15 s på den varme plade, blev udvalgt til denne undersøgelse 24 timer før forsøget, og forbehandlingslatenstiden blev registreret. Dyrene blev behandlet oralt med indometacin (20 mg/kg), destilleret vand (10 mL/kg) og THME (150, 300 og 500 mg/kg). Seks minutter efter den orale indgift blev reaktionstiden igen registreret. Der blev anvendt en grænsetid på 15 s for at undgå skader på poterne. Den procentvise analgetiske aktivitet blev beregnet ved hjælp af den samme formel som ved haleflimmertesten.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af den statistiske softwarepakke SPSS, version 21.0 til Windows (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Data er udtrykt som gennemsnit ± SEM. Envejs ANOVA efterfulgt af Dunnett post hoc-test blev anvendt til at bestemme de signifikante forskelle mellem kontrol- og behandlingsgrupperne. p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Akut oral toksicitetsundersøgelse

En akut oral toksicitetsundersøgelse viste, at THME på op til 2.000 mg/kg kropsvægt ikke gav anledning til nogen dødelighed eller tegn på adfærdsmæssig eller neurologisk toksicitet hos dyrene efter 14 dages observation. Der blev observeret en normal tilvækst i kropsvægt, og der var ingen forskel i organvægtene hos kontrol- og behandlede rotter (tabel 1).

Writhing Test

Oral indgift af THME på 150, 300 og 500 mg/kg og indomethacin (20 mg/kg) forårsagede en signifikant (F = 168.63, p < 0,001) fald i antallet af writhing-episoder induceret af eddikesyre på en dosisafhængig måde sammenlignet med kontrolgruppen (Fig. 1). Den beregnede procentvise hæmning af forsnævringer for indometacin var 80 %, for THME ved 150 mg/kg var den 53 %, for THME ved 300 mg/kg var den 67 %, og for THME ved 500 mg/kg var den 87 %.

Formalin-test

I denne model var slikketiden for THME (300 og 500 mg/kg, p.o.) og diclofenacnatrium (10 mg/kg, p.o.) var significant (F = 43,86, p < 0,001) lavere end for kontrolgruppen (fig. 2a). I den første fase (0-5 min) var sliktiden for THME i doser på 300 og 500 mg/kg, p.o., og diclofenacnatrium (10 mg/kg, p.o.) signifikant kortere (F = 50,08, p < 0,001) end i kontrolgruppen, med 82 % (diclofenacnatrium), 69 % (THME ved 300 mg/kg) og 86 % (THME ved 500 mg/kg) hæmning. THME i doser på 150 mg/kg, p.o., viste ikke en significant analgetisk virkning (fig. 2b). I anden fase (15-30 min) viste THME kun en signifikant (F = 26,67, p < 0,001) antinociceptiv virkning ved en dosis på 500 mg/kg, p.o. Desuden var sliktiden for den positive kontrolgruppe, der blev behandlet med diclofenacnatrium (10 mg/kg, p.o.), significant kortere (p < 0,001) sammenlignet med kontrolgruppen med en hæmning på 91 % (diclofenacnatrium) og 79 % (THME 500 mg/kg). THME i doser på 150 og 300 mg/kg, p.o., viste ikke en significant analgetisk virkning i denne fase (fig. 2b).

Tail Flick Test

Oral indgift af 300 og 500 mg/kg THME og 20 mg/kg indometacin forårsagede en signifikant (F = 13.63, p < 0,002 ; F = 5,49, p < 0,034 ; og F = 26,86, p < 0,001 ) stigning i latenstidsresponset sammenlignet med latenstiden før behandling (indomethacin, 13 %; THME ved 300 mg/kg), 7 %; og THME ved 500 mg/kg, 16 % hæmning). THME i doser på 150 mg/kg, p.o., inducerede ikke en significant analgetisk effekt (fig. 3).

Hot Plate Test

Oral administration af 300 og 500 mg/kg THME øgede significant (F = 14,24, p < 0,002 ; F = 25,32, p < 0,001 ) latenstidsresponset sammenlignet med forbehandlingslatenstiden. Smertetærsklen var også significant (F = 6,76, p < 0,021) reduceret i den positive kontrolgruppe, der blev behandlet med indometacin (20 mg/kg), sammenlignet med latenstiden før behandling. Hæmningen var for 51 % for indometacin, 51 % for THME ved 300 mg/kg og 61 % for THME ved 500 mg/kg. De nociceptive responser blev ikke significant påvirket af THME ved 150 mg/kg (fig. 4).

Diskussion

Denne undersøgelse viste, at THME op til 2.000 mg/kg legemsvægt (undersøgelse af akut oral toksicitet) ikke havde nogen toksiske virkninger. Desuden forårsagede oral administration af THME til mus antinociceptive virkninger mod de kemiske (writhing og formalin) og termiske (tail flick og varm plade) stimuli af nociception.

Den writhing test beskriver en typisk model for inflammatorisk smerte. Eddikesyre er en inducerende faktor for abdominale sammentrækninger og vridning af mavemusklerne ved at øge niveauet af proinflammatoriske stoffer i den perifere vævsvæske . I denne test var antallet af vridninger hos mus behandlet med THME lavere end hos kontrollerne, hvilket indikerer en hæmning af den eddikesyreinducerede viscerale nociception. Dette resultat bekræftede den tidligere rapport om, at THME viste antiinflammatorisk aktivitet i 2 modeller af akut inflammation hos mus, så den antinociceptive effekt, der sås, kunne til dels skyldes hæmning af frigivelse af inflammatoriske mediatorer eller blokering af den perifere cyclooxygenaseaktivitet. Det er sandsynligt, at den smerte, der er forbundet med dette forsøg, kunne genereres indirekte via stimulering af de perifere nociceptive neuroner ved hjælp af endogene mediatorer som serotonin, histamin, bradykininin og prostaglandiner . Denne kemiske metode har imidlertid en god følsomhed, men dårlig specificitet, hvilket giver mulighed for fejlfortolkning af resultaterne, fordi der er tale om en uspecifik stimulus for nociception, der er følsom over for stoffer med forskellige mekanismer. Dette problem kan undgås ved at supplere med andre nociceptionsmodeller .

Den formalinprøve betragtes som en model for vedvarende smerte, der produceres i 2 faser. Den første fase (0-5 min) er karakteriseret ved neurogene smerter og den anden (15-30 min) ved inflammatoriske smerter . I denne test var sliktiden for THME ved doser på 300 og 500 mg/kg signifikant kortere end i kontrolgruppen i den første fase, mens THME i den anden fase kun viste en antinociceptiv virkning ved en dosis på 500 mg/kg. Den antinociceptive virkning i anden fase er relateret til tidligere undersøgelser, hvor THME kun viste antiinflammatorisk aktivitet ved en dosis på 500 mg/kg. Smerter i den tidlige fase var overvejende forårsaget af aktivering af C-fibre, mens der i den sene fase var tale om en kombination af en inflammatorisk reaktion i perifert væv og funktionelle ændringer i rygmarvets dorsalhorn . Centralt virkende lægemidler hæmmer begge smertefaser, mens perifert virkende lægemidler hovedsageligt hæmmer den anden fase . Disse resultater tyder på, at den antinociceptive aktivitet af THME i formalinprøven kan tilskrives virkningen af både neurogene og antiinflammatoriske mediatorer.

I tail flick-testen aktiverede den termiske stimulation perifere nociceptorer, hvilket førte til refleksiv fjernelse af halen. En stigning i reaktionstiden anses generelt for at være en vigtig parameter til evaluering af central antinociceptiv aktivitet som tidligere rapporteret . Fundet af flick af halen kunne skyldes en reflexbue i rygmarven, som blev moduleret gennem en nedadgående vejmekanisme . Den observerede antinociceptive virkning af THME (300 og 500 mg/kg, p.o.) i halen flick-testen bekræftede dens centrale aktivitet. I hot plate-testen afslørede en overvejende supraspinal refleks en centralt virkende antinociceptiv virkning af THME. Pladen, der var opvarmet til en konstant temperatur, frembragte 2 adfærdskomponenter, dvs. slikke på poterne og hoppe, målt ved reaktionstider, som kunne skyldes supraspinalt integrerede reaktioner . Disse resultater afslører, at THME (300 og 500 mg/kg, p.o.) inducerede centrale antinociceptive virkninger, fordi det signifikant øgede latenstiden i denne model og dermed bekræftede dets centrale aktivitet.

Flere fytokemiske undersøgelser havde afsløret, at ekstrakter fra Tabebuia-arter indeholder en bred vifte af sekundære metabolitter såsom tanniner, flavonoider, quinoner, alkaloider, naphthoquinoner og iridoider . Med hensyn til THME afslørede en foreløbig fytokemisk analyse tilstedeværelsen af tanniner, alkaloider og phenolforbindelser, som har vist sig at have forskellige biologiske virkninger, herunder antinociceptive og antiinflammatoriske aktiviteter , og derfor kan de antinociceptive virkninger, der er observeret med THME, skyldes tilstedeværelsen af disse forbindelser. Der er imidlertid behov for yderligere undersøgelser for at identificere de bioaktive komponenter og for at bestemme den virkningsmekanisme, hvormed disse forbindelser udøver deres antinociceptive egenskaber.

Slutninger

Denne undersøgelse viste den antinociceptive aktivitet af methanolekstrakt af stængler af T. hypoleuca ved hjælp af flere modeller (kemiske og termiske) af nociception hos mus, og indikerer dermed, at denne art har centralt og perifert medierede antinociceptive virkninger.

Anerkendelser

Forfatterne er taknemmelige for den tekniske støtte, som Rafael Lorenzo og Damileysi Castro fra Division of Biopharmaceutical Development, CENSA, har ydet. Forfatterne vil også gerne takke Dr. Eduardo Sistachs for hans hjælp til revision af sproget.

Oplysningserklæring

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Author Contacts

Artikel- / Publikationsdetaljer

Open Access License / Drug Dosage / Disclaimer

Denne artikel er licenseret under Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC). Anvendelse og distribution til kommercielle formål kræver skriftlig tilladelse. Lægemiddeldosering: Forfatterne og udgiveren har gjort alt for at sikre, at lægemiddelvalg og dosering, der er beskrevet i denne tekst, er i overensstemmelse med gældende anbefalinger og praksis på udgivelsestidspunktet. I betragtning af den igangværende forskning, ændringer i statslige bestemmelser og den konstante strøm af oplysninger om lægemiddelbehandling og lægemiddelreaktioner opfordres læseren imidlertid til at kontrollere indlægssedlen for hvert enkelt lægemiddel for eventuelle ændringer i indikationer og dosering og for tilføjede advarsler og forsigtighedsregler. Dette er især vigtigt, når det anbefalede middel er et nyt og/eller sjældent anvendt lægemiddel. Ansvarsfraskrivelse: De udtalelser, meninger og data, der er indeholdt i denne publikation, tilhører udelukkende de enkelte forfattere og bidragydere og ikke udgiverne og redaktøren/redaktørerne. Indrykning af reklamer og/eller produktreferencer i publikationen er ikke en garanti, godkendelse eller godkendelse af de produkter eller tjenester, der reklameres for, eller af deres effektivitet, kvalitet eller sikkerhed. Udgiveren og redaktøren/redaktørerne fraskriver sig ansvaret for eventuelle skader på personer eller ejendom som følge af ideer, metoder, instruktioner eller produkter, der henvises til i indholdet eller annoncerne.