Antispermantistoffer: Antisperm antistoffer og infertilitet: et uløseligt spørgsmål?

Efterforskningen og den kliniske betydning af antisperm antistoffer (ASA) diskuteres igen (Helmerhorst et al., 1999). Selv om det forsigtigt konkluderes, at `der er grund til at acceptere antistofmedieret antispermimmunitet som en årsag til subfertilitet’, opregner forfatterne tre grunde til, at klinikerne ikke er tilbøjelige til at teste for ASA hos subfertile par: (i) mangel på en standardiseret og universelt accepteret test for ASA, (ii) manglende konsensus om de kliniske konsekvenser af ASA og (iii) manglende beviser for en mekanistisk forklaring på, hvordan ASA forringer befrugtningen. Disse tre påstande fortjener hver især en kommentar.

Diskussionen af Helmerhorst et al. (1999) er strengt baseret på moderne immunologiske koncepter, hvilket fører til anbefaling af immunoblotting og affinitetskromatografi som lovende på dette område. For dem, der har været på området i mange år, kan disse anbefalinger fremkalde en følelse af deja vu. Dette var den almindelige strategi for ~20 år siden, og mange undersøgelser er siden blevet foretaget ved hjælp af enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), ved hjælp af spermatozoer eller antigenfraktioner og ved immunoblotting (Lehmann et al., 1985; Mettler et al., 1985). Resultaterne har imidlertid generelt været skuffende; den klarhed, man havde håbet på, er ikke opnået. Der findes ingen gode forklaringer på den manglende succes, men et aspekt af problemet kan være, at konventionel immunologisk tænkning ikke er nok til at opnå fremskridt inden for reproduktionsimmunologi. Der skal også tages hensyn til reproduktionsfysiologien. Et kig på de mulige in vivo-virkninger af ASA kan illustrere dette.

Mekanistiske forklaringer på forringet befrugtningsevne ved ASA?

Helmerhorst et al.’s påstand om “manglende beviser for en mekanistisk forklaring på, hvordan ASA forringer befrugtningsevnen” er ret overraskende, især i en hollandsk artikel, endda en artikel fra Groningen. Det var i Groningen, at den fremragende gruppe under ledelse af Jan Kremer påviste, at vandringen af spermatozoer med ASA af immunoglobulin (Ig) A-klassen på overfladen gennem livmoderhalsslimhinden var stærkt forringet, tilsyneladende fordi Fc-delen af IgA-molekylet (men ikke af IgG-molekylet) binder sig effektivt til micellerne i livmoderhalsslimhinden (Jager et al., 1980). I testen med kontakt mellem sædceller og cervikal slim var procentdelen af sædceller, der var dækket af IgA-antistoffer, proportional med procentdelen af sædceller, der viste det såkaldte “shaking”-fænomen, dvs. kraftige halebevægelser uden fremadgående bevægelse i cervikalslimhinden. Yderligere beviser for IgA’s betydning blev fundet, da behandling af IgA-dækkede spermatozoer med en IgA1-protease viste sig at forbedre sædcellernes migration gennem cervikalslimhinden (Bronson et al., 1987)

Det betyder, at IgA-antistoffer mod ethvert antigen udtrykt på sædcellernes membran vil forringe penetrationen, og at ASA’s immunoglobulinklasse i denne situation bliver vigtigere end antigenspecificiteten. Dette står i modsætning til konventionelle immunologiske reaktioner, hvilket kan være årsagen til, at rystelsesfænomenet ofte bliver negligeret i immunologiske diskussioner. Det er dog tydeligvis en meget effektiv mekanisme; i forsøg med migration af IgA-beklædte spermatozoer ind i cervikal slim i kapillærrør nåede spermatozoerne fra patienter med stærke immunreaktioner ofte kun få mm ind i slimen. Bindingen af IgA’s Fc-stykke til livmoderhalsslimhinden bør ses i et evolutionært perspektiv. Da livmoderhalsslimhinden er den eneste barriere mellem miljøet og kvindens kønsorganer og peritonealhule, må der være forsvarsmekanismer i slimen, som forhindrer mikroorganismer i at trænge ind i kønsorganerne. IgA-antistoffer mod mikroorganismer tjener denne funktion ved at fange mikroorganismerne. I sjældne tilfælde, hvor en kvinde har produceret IgA-antistoffer mod spermatozoer, eller, mere almindeligt, hvor spermatozoer, der kommer ind i slimen, allerede er dækket af IgA, vil resultatet være det samme: fældefangst af spermatozoerne eller forringelse af migrationen.

En mere konventionel immunologisk mekanisme, hvormed ASA kan reducere fertiliteten, ville være ved at binde sig til den receptor, hvormed spermatozoer binder sig til ægget, og derved blokere interaktionen mellem sædceller og æggeleder. I denne situation vil ASA’s antigenspecificitet være afgørende, og da der findes mere end ét autoantigen i sædcellernes membran, vil ikke alle ASA’er have denne virkning. I løbet af de sidste to årtier er dette fænomen blevet undersøgt indgående i forbindelse med in vitro-befrugtning (IVF) med anvendelse af spermatozoer fra mænd med ASA. I næsten alle undersøgelser blev der observeret en betydelig reduktion i andelen af befrugtede æg. En af de tidlige undersøgelser viste også, at den blokerende effekt hovedsageligt var forårsaget af IgA-antistoffer (Clarke et al., 1985), men dette er ikke blevet bemærket i efterfølgende undersøgelser, og absorptionsforsøg har vist, at en hæmmende effekt også kan forårsages af IgG-antistoffer (Bronson et al., 1982). En nyere undersøgelse af spermatozoers binding til zona pellucida (Francavilla et al., 1997) er særlig illustrativ. I hvert forsøg tilføjede de samme antal spermatozoer fra en fertil person og fra en patient med stærk reaktivitet i immunobead-testen, således at de to typer spermatozoer, der var mærket med forskellige fluorochromer, kunne konkurrere om at binde sig til zona pellucida. Sammenlignet med spermatozoerne fra de fertile mænd blev spermatozoerne fra patienter med normale sædprøver (bortset fra tilstedeværelsen af ASA) hæmmet i ~50 % af tilfældene, forstærket i nogle få tilfælde og ikke påvirket i de resterende tilfælde, hvilket passer med konceptet om, at antistofspecificitet må spille en rolle. Men på trods af patienternes stærke immunrespons med høje titre af cirkulerende ASA og, i de fleste tilfælde med både IgG og IgA, på næsten alle spermatozoer, var hæmningen aldrig fuldstændig, men nogle af de antistofbelagte spermatozoer blev bundet til zona pellucida. Dette er i overensstemmelse med erfaringerne fra mange andre IVF-undersøgelser, at selv om procentdelen af befrugtede æg kan være reduceret på grund af tilstedeværelsen af ASA, vil nogle æg normalt være blevet befrugtet.

Konklusionen af denne diskussion om de mulige fertilitetsreducerende virkninger af ASA er, at forringelse af sædcellernes migration gennem livmoderhalsslimhinden ved IgA-antistoffer er en meget effektiv mekanisme, mens blokering af samspillet mellem sædceller og ovum (forårsaget af både IgG og IgA ASA) synes at være mindre effektiv og sandsynligvis sjældent forhindrer, men måske forsinker befrugtningen. Kliniske erfaringer støtter disse konklusioner. På infertilitetsklinikker har mænd med ASA sjældent et isoleret IgG-respons, men præsenterer som regel en blanding af IgG- og IgA-antistoffer. På den anden side var immunrespons begrænset til IgG-klassen ikke sjældent i fertilitetsundersøgelser af vasektomerede og efterfølgende vasovasostomerede mænd, men disse mænd syntes at have normal fertilitet, hvorimod fertilitetsraten var omvendt korreleret med IgA-responset (Meinertz et al., 1990). Det ser derfor ud til, at “manglende beviser for en mekanistisk forklaring” ikke bør afholde klinikeren fra at teste patienter (i det mindste mænd) med fertilitetsproblemer for ASA.

Mangel på et standardiseret og universelt accepteret assay for ASA?

Selv om der ikke kan fremføres argumenter imod denne udtalelse fra Helmerhorst et al. (1999), er spørgsmålet, om det er et rimeligt og nødvendigt krav, at der anvendes et assay? Hvis det er tilfældet, kan det brede spektrum af laboratorieforsøg blive dramatisk reduceret. Det væsentlige spørgsmål synes at være, om visse assays for ASA giver klinisk relevante resultater.

I mange år var sæd-agglutinationstest (enten makroskopisk gelatine-agglutination eller mikroskopisk bakke-agglutination) de almindelige assays (Rose et al., 1976). På det seneste er disse test blevet miskrediteret og ofte beskrevet som upålidelige, især i forbindelse med beskrivelse af nye teknikker. Det er sandt, at ingen af dem er ideelle, da de begge kræver friske sædprøver af optimal kvalitet. I gelatine-agglutinationstesten anvendes store mængder sæd, og i bakke-agglutinationstesten kræves der erfaring og forsigtighed ved læsning af resultaterne for at skelne mellem ægte agglutinater og uspecifikke sammenklumpninger. Ikke desto mindre har disse test givet klinisk relevante resultater hos mænd. Flere undersøgelser har vist, at høje titre i serum eller frie antistoffer i seminalplasma meget sjældent forekommer, undtagen hos patienter med et fertilitetsproblem (hos ~10% af mænd fra par med uforklarlig fertilitet) (f.eks. Bronson et al., 1985) og hos normospermiske mænd i en opfølgende undersøgelse (Rümke et al., 1985), 1974), var stigende serumtiter i gelatine-agglutination korreleret med faldende fertilitet (f.eks. havde kun 12,5 % af 64 mænd med titre fra 128-512 og ingen af 11 med titre ≥1024 fremkaldt en befrugtning i løbet af observationsperioden på 2-16 år). Da de ASA, der påvises i serum, hovedsagelig er af IgG-klassen, kan det synes mærkeligt, at serumtiter er relateret til subfertilitet, hvis ASA’s anti-fertilitetsvirkning hovedsagelig skyldes IgA-antistoffer i sæd. Forklaringen er, at IgA-antistoffer meget sjældent forekommer uden IgG-antistoffer, og at høje IgA-koncentrationer hovedsagelig findes hos patienter, der også har høje IgG-koncentrationer.

En lige så vigtig observation i disse undersøgelser var, at lave koncentrationer af antistoffer (titre på 4-16) var lige almindelige blandt fertile kontroller og infertile patienter, hvilket indikerer, at sådanne lave værdier tilsyneladende ikke påvirker fertiliteten på nogen væsentlig måde.

For nylig er den indirekte immunobead-test blevet den mest populære (Bronson et al, 1982). Friske spermatozoer, der er høstet ved swim-up-teknik, inkuberes med serum eller seminalplasma, hvorefter de vaskes omhyggeligt, og der tilsættes immunobeads dækket med anti-IgG eller anti-IgA (eller anti-IgM). Under mikroskopet ses immunobeads, der klæber til de bevægelige spermatozoer, hvis prøven indeholder ASA af den rette immunoglobulinklasse. Brugen af et anti-immunglobulin garanterer reaktionens specificitet; det er en meget følsom test, der bestemmer ASA’s immunglobulinklasse, og som kun kræver små mængder sædceller, hvilket tilsyneladende gør den til den ideelle test. Der er dog et problem. For at gøre den praktisk anvendelig udføres den normalt kun med én fortynding af serum, som regel en lav fortynding (oftest 1:4). I sådanne tilfælde fungerer den indirekte immunobead-test som en meget følsom screeningstest, således at selv de lave antistofniveauer uden betydning for fertiliteten (som sandsynligvis udgør hovedparten af de positive reaktioner) kan fremkalde stærke reaktioner, i det mindste for IgG (se f.eks. Bronson et al., 1985). Dette kan forklare, hvorfor flere undersøgere har sat spørgsmålstegn ved værdien af testning for ASA og betydningen af ASA som årsag til infertilitet. Hvis testen blev udført med højere fortyndinger af serum (f.eks. 1:50 og 1:250), kunne den måske give bedre klinisk vejledning.

Den mest rationelle måde at teste for ASA hos mænd er naturligvis at bestemme immunoglubuliner (IgG og IgA) på overfladen af patientens spermatozoer ved hjælp af den direkte blandede agglutineringsreaktion (MAR) eller immunobead-test. Begge test er hurtige, nemme og følsomme, men kræver bevægelige spermatozoer for at sikre, at erytrocytterne eller immunobeadsene klæber til sædcellernes membran. De er fremragende screeningtest; hvis reaktionen er negativ eller svagt positiv (≤50 % af de bevægelige spermatozoer bærer immunoglobuliner) kan patienten næppe have et infertilitetsproblem forårsaget af ASA, og der er ikke behov for yderligere immunologiske test. Hvis alle eller størstedelen af spermatozoerne derimod har immunoglobuliner på deres membran, er konsekvenserne for fertiliteten vanskeligere at vurdere, først og fremmest fordi disse følsomme test ikke kan skelne mellem spermatozoer med kun meget små mængder immunoglobulin og spermatozoer, der er fuldt mættet med antistof på alle tilgængelige antigenmolekyler. Både for den IgA-inducerede forringelse af sædcellernes migration gennem cervikalslimhinden og for en eventuel blokering af interaktionen mellem sædceller og ovum må det antages, at antallet af antistofmolekyler spiller en rolle. I denne situation kan det være nyttigt at bestemme ASA i serum og sædplasma. Med høje titre i serum eller et overskud af fri ASA i seminalplasma synes det sandsynligt, at mængden af ASA på spermatozoerne også vil være høj.

Det blev illustreret på den mest tydelige måde i vores opfølgende undersøgelse af vasovasostomerede mænd, som nævnt ovenfor (Meinertz et al, 1990).

I observationsperioden (22-111 måneder, median 44 måneder) havde 10 af de 15 mænd (66,7%) med en negativ direkte MAR (≤10% af de mobile spermatozoer med vedhæftede erytrocytter) fremkaldt en befrugtning, men det samme havde 42 af de 79 mænd (53,2%) med en positiv MAR (Fisher’s two tailed exact test: P = 0,4995). En ren positiv MAR (>10 % for IgG eller IgA) gav således ingen oplysninger om fertilitetsstatus. De fleste af mændene med ASA havde både IgG og IgA på deres spermatozoer, men nogle havde kun IgG. Der blev ikke registreret rene IgA-reaktioner. Hvis man ser på de mænd med immunreaktioner begrænset til IgG-klassen, var befrugtningsraten for den samlede gruppe 85,7 % (18/21), og for dem med IgG på alle spermatozoer var den lige så høj (11/13 = 84,6 %). Der kunne således ikke registreres nogen anti-fertilitetseffekt for IgG; faktisk var befrugtningsraten bemærkelsesværdigt høj, endda højere end for patienter uden ASA (selv om forskellen ikke var statistisk signifikant). På den anden side viste mændene med både IgG- og IgA-reaktivitet en faldende fertilitet med stigende IgA-reaktivitet. For den samlede gruppe var befrugtningsraten 42,9 % (24/56) og for dem med IgA på alle spermatozoer 21,7 % (fem ud af 23). Sammenlignet med de grupper, der kun havde IgG-reaktivitet, var forskellene meget signifikante. I et forsøg på at identificere de mænd med særligt stærke immunresponser viste det sig, at ingen af 10 mænd med 100 % IgA-reaktivitet i MAR og cirkulerende sædagglutininer i titre på 256 eller derover havde fremkaldt graviditet, og kun én af 13 mænd med 100 % IgA MAR og frie sædagglutininer i sædplasma havde haft held til at opnå graviditet.

Og selv om der på nuværende tidspunkt ikke findes nogen enkelt test, der kan vurdere den enkelte patients fertilitetsstatus på en entydig måde med hensyn til immun subfertilitet eller infertilitet, synes det berettiget at konkludere, at vi med den rette kombination af test (f.eks. MAR- eller immunobead-test kombineret med sædagglutininer i serum eller seminalplasma) kan komme ret tæt på dette mål. En nylig undersøgelse af diagnosticering og behandling af ASA, som blev foretaget af reproduktionsmedicinske centre i hele Storbritannien (Krapez et al., 1998), viste, at langt de fleste centre faktisk følger denne strategi. Således testede 44 ud af 48 centre for ASA på spermatozoer ved direkte MAR-test (28 laboratorier) eller immunobead-test (19 laboratorier). I nogle tilfælde blev der også testet sædplasma, og 17 laboratorier undersøgte serum fra mandlige partnere ved hjælp af forskellige test, især bakke-agglutinationstest. Det betyder, at næsten alle centre på en nem måde kunne identificere de mænd, der kunne have en immunologisk årsag til deres subfertilitet. Selv om dette er det bedste, der kan gøres på nuværende tidspunkt, er det ikke optimalt. Der er behov for en teknik, der på en mere præcis måde kan identificere de mænd, der har et immunologisk problem. I øjeblikket synes flowcytometri at være en lovende teknik, som måske vil kunne bestemme den nøjagtige mængde IgG og IgA på de enkelte spermatozoer (Räsanen et al., 1992; Ke et al., 1995).

Mangel på konsensus om de kliniske konsekvenser af ASA?

Omiddelbart kan denne påstand fra Helmerhorst et al. synes korrekt, men spørgsmålet er, om undersøgelser med mange forskellige teknikker og kriterier kan sammenlignes? For år tilbage var det en almindelig opfattelse, at ASA kunne forårsage infertilitet, men i dag synes billedet langt mindre klart. Der kan være flere årsager til denne ændring i synspunktet.

For det første har vi lært, at selv med de højeste niveauer af ASA (især IgA) kan undfangelse næppe udelukkes. Derfor er spørgsmålet snarere, i hvilket omfang ASA kan forårsage subfertilitet. De undersøgelser af mandlig infertilitet, der er omtalt i denne gennemgang, har hovedsagelig været baseret på forskellige konventionelle (nogle vil måske sige gammeldags) teknikker. Selv om konsensus måske er et for stærkt ord at bruge, er resultaterne af sådanne undersøgelser dog generelt i god overensstemmelse, hvilket tyder på, at lave niveauer af ASA ikke gør nogen skade, mens noget højere værdier (især IgA) forårsager subfertilitet, der stiger til noget nær infertilitet for meget høje niveauer af ASA; en konklusion, der naturligvis udgør en alvorlig hindring for forsøgene på at fremstille en vaccine mod fertilitet baseret på sædantigener!

For det andet bør man, når der indføres nye testmetoder for ASA, sammenligne dem med de konventionelle testmetoder, og hvis de ikke bestemmer den samme slags ASA, bør man huske på dette. Da der for 15 år siden blev gennemført en multicenterundersøgelse fra Verdenssundhedsorganisationen (WHO) om antistoffer mod reproduktionsantigener, viste det sig, at flere af teknikkerne, herunder de fleste ELISA’er, immunoblotting-teknikker, passiv hæmagglutination og cytotoksicitetstest, ikke påviste den ASA, der blev registreret ved de konventionelle teknikker. Desuden havde resultaterne normalt kun ringe klinisk relevans, idet de ikke viste nogen signifikant forskel mellem fertile og infertile grupper (Hjort et al., 1985). Desværre glemmes dette ofte i diskussionerne om ASA.

For det tredje bør det kvantitative aspekt og immunoglubulinklassen af antistofferne indgå i testningen. Således bør alle patienter med reaktivitet i direkte MAR- eller immunobead-test ikke betragtes som én gruppe, men der bør skelnes mellem dem med svag reaktivitet (sandsynligvis fertile) og dem med antistof på næsten alle sædceller (muligvis subfertile), og på samme måde bør dem med kun IgG (sandsynligvis fertile) ikke blandes sammen med dem med stærk reaktivitet for både IgG og IgA (sandsynligvis subfertile eller infertile).

Den nylige undersøgelse af reproduktionsmedicinske centre i Storbritannien (Krapez et al, 1998) viste, at der normalt ikke skelnes mellem IgG og IgA ASA. Dette skyldes sandsynligvis, at de fleste infertile mænd med ASA vil have en blanding af de to immunoglobulinklasser på deres spermatozoer. Forsøgene på at behandle patienterne stemmer imidlertid godt overens med konklusionerne fra laboratorieundersøgelser og `kliniske eksperimenter’ (undersøgelser på vasovasostomerede mænd). Således anvendes intrauterin inseminering i de fleste centre for at overvinde den IgA-inducerede forringelse af sædcellernes penetration gennem livmoderhalsslimhinden. Enten IVF eller intracytoplasmisk sædinjektion (ICSI) blev anvendt til patienter med en stærk immunitet over for sædceller (>50% reaktivitet i MAR- eller immunobead-test), men generelt med liberale indikationer i forhold til de konklusioner, der er nået ovenfor. Dette afspejler naturligvis det faktum, at ASA ofte ikke er den eneste årsag til infertilitet hos disse patienter, men at lavt antal sædceller, dårlig motilitet eller problemer hos den kvindelige partner også kan spille en rolle. De anti-fertilitetsvirkninger af ASA er således vanskelige at analysere i grupper af infertile patienter.

Vasectomerede og efterfølgende vasovasostomerede mænd synes at udgøre en meget bedre gruppe; faktisk en gruppe, der minder meget om forsøgsdyr. Begge partnere har normalt tidligere bevist deres frugtbarhed, således at genetiske faktorer for infertilitet kan udelukkes. Der kan udvælges en gruppe af mænd, der har været vasektomeret i en begrænset periode, og som har haft en vellykket vasovasostomi med et acceptabelt antal spermatozoer med god motilitet i sædprøven. Hvis begge partnere således har været sunde og raske siden deres sidste befrugtning, er andre infertilitetsfaktorer end muligvis ASA langt mindre sandsynlige end i en gruppe infertile patienter. Den store fordel ved vasovasostomigruppen er, at deres fertilitetsstatus ikke er kendt fra starten, og at der derfor automatisk indgår en kontrolgruppe, dvs. nogle har ingen ASA, nogle har kun IgG, og nogle har både IgG og IgA. Denne gruppe synes at være ideel til undersøgelse af virkningerne af ASA og til evaluering af nye teknikker, og det er overraskende, at den er blevet så lidt anvendt. Det afgørende spørgsmål i denne forbindelse er naturligvis, om vasektomerede mænd producerer antistoffer mod alle de samme antigener, som infertile mænd kan reagere imod. Der er behov for yderligere undersøgelser, men indtil videre har vi ingen beviser for, at dette ikke skulle være tilfældet.

Dette fører til den konklusion, at sædimmunologi kan give nyttige oplysninger for klinikerne. Det er måske ikke så vigtigt nu, hvor den immunologiske faktor sammen med mange andre infertilitetsfaktorer kan overvindes ved hjælp af assisterede reproduktionsteknikker. Det er dog stadig et godt princip at nå frem til en så præcis diagnose som muligt, før der iværksættes en behandling.