Ap-3 adaptorkomplekset medierer sortering af gær og pattedyrs PQ-loop-familiens basiske aminosyretransportører til den vacuolære/lysosomale membran familie basiske aminosyretransportører til den vakuolære/lysosomale membran

Ypq1-proteinet kan nå den vakuolære membran via ALP- eller endosomalvejen

Har for nylig rapporteret, at et Ypq1-GFP-fusionsprotein lokaliseres til den vakuolære membran6, forsøgte vi at bestemme, ad hvilken trafikeringsvej Ypq1 når dette kompartment. Vacuolære membranproteiner kan nå vacuolen via to forskellige veje: ALP (alkalisk fosfatase) og CPY (carboxypeptidase Y)-vejen, hvor sidstnævnte indebærer passage af proteinerne via endosomer (Fig. 2A). For at teste, om Ypq1 følger CPY-vejen, undersøgte vi dens intracellulære fordeling i en pep12Δ-mutant, der mangler en t-SNARE, der er involveret i vesikelfusion med det sene endosom13. I denne mutant blev Ypq1-GFP udelukkende fundet ved den vakuolære membran (Fig. 2B). I en vps27Δ-mutant, der mangler en komponent af det endosomale ESCRT-0-kompleks, er membranproteiner, der transporteres via endosomer, typisk stablet i klart synlige klasse E-kompartmenter, der svarer til unormalt forstørrede endosomer, men Ypq1-GFP-proteinet blev rettet normalt mod den vacuolære membran i denne mutant (data ikke vist). Disse resultater viser, at Ypq1 ikke kræver en funktionel CPY-vej for at nå vacuolen. Vi testede derefter, om Ypq1 når den vacuolære membran via ALP-vejen. Det er veldokumenteret, at denne vej kræver AP-3 adaptorkomplekset, som antages at virke ved trans-Golgi for at sortere fragtproteiner i vesikler, der efterfølgende fusionerer med endosomerne. Dette kompleks er en heterotetramer, der består af to store underenheder (β3a og δ), en mellemstor underenhed (μ3a) og en lille underenhed (σ3), og fravær af en af disse underenheder resulterer i et mangelfuldt AP-3-kompleks14. Vi isolerede derfor to AP-3-deficiente stammer, apm3Δ (der mangler underenhed μ3a) og apl5Δ (der mangler underenhed δ). I disse mutanter blev Ypq1-GFP fundet ved den vacuolære membran såvel som i små punktstrukturer, der let blev mærket med FM4-64 og ikke observeret i wild-type celler (Fig. 2B). I amp3Δ- og apl5Δ-mutantceller, der også udtrykker et funktionelt Sec7-mCherry til mærkning af Golgi, blev en høj procentdel af disse punktstrukturer dekoreret med Sec7-mCherry (Fig. 2C) (for en kvantificering af sublokaliseringsmønstrene, se Supplementary Fig. S1 online). Disse resultater indikerer, at når ALP-vejen er mangelfuld, har Ypq1 en tendens til at akkumulere i Golgi, mens en betydelig del af proteinet når den vacuolære membran via en anden vej. For at teste, om sidstnævnte er CPY-vejen, bestemte vi placeringen af Ypq1-GFP i apm3Δ pep12Δ- og apl5Δ pep12Δ-dobbeltmutanter (Fig. 2B). Interessant nok var levering af Ypq1-GFP til vacuolen stort set nedsat i disse stammer, og proteinet blev fundet mest spredt i hele cytosolen såvel som i punktstrukturer mærket med Sec7-mCherry (Fig. 2B,C) (for en kvantificering af sublokaliseringsmønstrene, se Supplementary Fig. S1 online). Vakuolen i disse dobbeltmutanter kunne normalt mærkes med FM4-64. Disse resultater viser, at Ypq1 kan sorteres til den vacuolære membran via både ALP- og CPY-vejene. I wild-type celler bruger det hovedsageligt ALP-vejen, men når denne vej er mangelfuld, opholder proteinet sig længere i Golgi, men kan stadig effektivt nå den vakuolære membran via CPY-vejen. Når både ALP- og CPY-vejene er mangelfulde, kan en lille del af Ypq1-GFP påvises ved den vakuolære membran, hvilket tyder på, at proteinet kan bruge endnu en vej, men en vej, der er langt mindre effektiv til korrekt at målrette Ypq1 til vakuolen.

Ypq1 kan nå den vacuolære membran via ALP- eller CPY-vejen.

(A) De to vigtigste trafikeringsveje fra trans-Golgi til vacuolen i gæren Saccharomyces cerevisiae. MVB: multivesikulært legeme (B) Stammerne 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) og LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), der var transformeret med plasmidet pLL063 (YPQ1-GFP URA3), blev dyrket på et glukose-ammoniummedium. Cellerne fik lov til at internalisere FM4-64 i 15 minutter for at markere vacuolen før billeddannelse. (C) Stammerne GC004 (ura3 leu2), BOA003 (apm3∆ ura3 leu2), BOA005 (apl5∆ ura3 leu2), BOA007 (apm3∆ pep12∆ ura3 leu2), BOA008 (apl5∆ pep12∆ ura3), der er transformeret med plasmiderne pLL063 (YPQ1-GFP URA3) eller pBOA010 (SEC7-mCherry LEU2), blev dyrket på et glukose-ammoniummedium. Cellerne fik lov til at internalisere CMAC i 30 minutter for at mærke det vacuolære lumen før billeddannelse. Skala bar: 10 μm. En kvantificering af sublokaliseringsmønstrene for Ypq1-GFP (B) og Ypq1-GFP-Sec7-mCherry (C) kan findes som Supplerende figur S1 online.

Et surt dileucinmotiv fremmer Ypq1-sortering til ALP-banen

AP-3-afhængig sortering af transmembranproteiner medieres ofte af tyrosinbaserede (YXXØ) eller dileucinbaserede (XXXL) signaler (hvor Ø er en voluminøs hydrofob rest og X en hvilken som helst aminosyre)15. Ypq1 indeholder en EQQPLL-sekvens i sin anden store løkke, der vender ud mod cytosolen. Dileucinet i dette motiv er forud for et prolin, et træk, der er observeret i flere fragtstoffer, der benytter ALP-vejen16. En dileucin-til-dialanin-substitutionsmutant af Ypq1 (Ypq1LL>AA) viste sig at være målrettet mod den vacuolære membran, men også at dekorere punktstrukturer (fig. 3A). Denne fænotype ligner den, der er observeret for wild-type Ypq1 i AP-3-deficiente celler, hvilket tyder på, at Ypq1LL>AA når frem til vacuolen via den alternative CPY-vej. Til støtte for dette synspunkt blev Ypq1LL>AA produceret i en pep12Δ-mutant ikke målrettet mod vacuolen og blev missorteret i cytosoliske punktstrukturer som observeret for Ypq1 i apm3Δ pep12Δ- og apl5Δ pep12Δ-mutanterne (Fig. 3A). Disse resultater viser, at det sure dileucinmotiv af Ypq1 er påkrævet for dets AP-3-afhængige sortering til vacuolen, men ikke for dets Pep12-afhængige levering til vacuolen. Disse konklusioner er i overensstemmelse med resultaterne af en nyere undersøgelse, der blev offentliggjort af S. Emr og medarbejdere under forberedelsen af dette manuskript17. Vi undersøgte derefter mere detaljeret, hvordan Ypq1LL>AA-varianten transporteres til vacuolen. Vi overvejede først den mulighed, at dette mutantprotein, fordi det ikke kan bruge ALP-vejen, først kunne blive missorteret til plasmamembranen, før det gennemgår hurtig endocytose og efterfølgende Pep12-afhængig levering til vacuolærmembranen. Denne model blev ikke understøttet af vores observationer: Ypq1LL>AA akkumulerede ikke ved celleoverfladen i en end3Δ-mutant defekt i endocytose, hvilket indikerer, at det når vacuolen via CPY-vejen (Fig. 3B). Vi antog derefter, at levering af Ypq1LL>AA til vacuolen kunne involvere dens sortering fra Golgi til endosomer takket være alternative adaptorer såsom AP-1-komplekset eller de monomere GGA-proteiner. Vi udtrykte Ypq1LL>AA-mutantproteinet i gga1Δ gga2Δ-celler, der mangler de redundante Gga1- og Gga2-adaptorer, og i amp1Δ, amp2Δ og apl4Δ-celler, der mangler underenheder af AP-1-komplekset. I hver af disse mutanter blev det konstateret, at proteinet stadig nåede frem til vacuolen (fig. 3B). Disse observationer tyder enten på, at disse adaptorer virker redundant for at fremme sortering af Ypq1LL>AA til vacuolen via CPY-vejen, eller at andre adaptorer er involveret.

Et surt-dileucin-motiv fremmer Ypq1-sortering til ALP-vejen.

(A) Stammer 23344c (ura3) og EN046 (pep12∆ ura3), der er transformeret med pLL034 (YPQ1LL>AA-GFP URA3)-plasmidet, blev dyrket på et glukose-ammoniummedium. Cellerne fik lov til at internalisere FM4-64 i 15 minutter for at markere vacuolen før billeddannelse. (B) Stamme 23344c (ura3), LL115 (end3∆ ura3), JA445 (gga1∆ gga2∆ ura3), LL078 (apm1∆ ura3) og LL066 (apl4∆ ura3) transformeret med plasmiderne pLL063 (YPQ1-GFP URA3) eller pLL034 (YPQ1LL>AA-GFP URA3) blev dyrket på et glukose-ammoniummedium. Cellerne fik lov til at internalisere FM4-64 i 15 minutter for at markere vacuolen før billeddannelse. Skala bar: 10 μm.

Ypq2 og Ypq3 trafikerer også til vacuolen via ALP-vejen, men gennemgår forskellige skæbner, når ALP-vejen ikke er funktionel

Ypq2- og Ypq3-proteinerne, der i sekvens ligner meget Ypq1, lokaliseres også til den vacuolære membran6 og indeholder begge også et surt dileucin i den anden cytosoliske loop. Resultaterne i Fig. 4A viser, at Ypq2 transporterer sig normalt til vacuolen i en pep12Δ-mutant. Dette viste sig også at være tilfældet i apm3Δ- og apl5Δ-mutanter, der er defekte i ALP-vejen, hvor det desuden blev fundet at dekorere punktstrukturer, en fænotype, der ikke blev observeret i wild-type celler. En høj andel af disse punktstrukturer var også mærket med Sec7-mCherry (Fig. 4B), hvilket indikerer, at Ypq2, i lighed med Ypq1, har tendens til at akkumulere i Golgi, når ALP-vejen er mangelfuld. I både apm3Δ pep12Δ og apl5Δ pep12Δ dobbeltmutanter mislokaliserede Ypq2 stort set til små punktformede cytosoliske strukturer, hvoraf mange var dekoreret med Sec7-mCherry, selv om en fraktion af proteinet syntes korrekt leveret til vacuolen (Fig. 4A,B) (for en kvantificering af sublokaliseringsmønstrene, se Supplerende Fig. S2 online). Disse resultater indikerer, at Ypq2 opfører sig som Ypq1, idet det primært bruger ALP-vejen til at nå vacuolen. De viser også, at når denne vej er defekt, opholder Ypq2 sig længere i Golgi, men kan stadig leveres til vacuolærmembranen, hovedsageligt via CPY-vejen.

Ypq2 kan nå vacuolærmembranen via ALP- eller CPY-vejen.

(A) Stamme 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) og LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), der var transformeret med plasmidet pLL161 (YPQ2-GFP URA3), blev dyrket på et glukose-ammoniummedium. Cellerne fik lov til at internalisere FM4-64 i 15 minutter for at markere vacuolen før billeddannelse. (B) Stammerne GC004 (ura3 leu2), BOA003 (apm3∆ ura3 leu2), BOA005 (apl5∆ ura3 leu2), BOA007 (apm3∆ pep12∆ ura3 leu2), BOA008 (apl5∆ pep12∆ ura3), der er transformeret med plasmiderne pLL161 (YPQ2-GFP URA3) eller pBOA010 (SEC7-mCherry LEU2), blev dyrket på et glukose-ammoniummedium. Cellerne fik lov til at internalisere CMAC i 30 minutter for at mærke det vacuolære lumen før billeddannelse. Skala bar: 10 μm. En kvantificering af sublokaliseringsmønstrene for Ypq2-GFP (A) og Ypq1-GFP-Sec7-mCherry (B) kan findes som Supplerende figur S2 online.

Da ekspression af et YPQ3-GFP-gen under kontrol af den naturlige promotor for YPQ3 gav et knap detekterbart niveau af Ypq3-GFP, udtrykte vi fusionsgenet under kontrol af en galaktose-inducerbar promotor. For at reducere risikoen for fejllokalisering på grund af overproduktion af Ypq3-GFP blev cellerne først dyrket på raffinose, derefter blev der tilsat galaktose i 3 timer, og til sidst blev der tilført glukose i to timer for at undertrykke transkriptionen af YPQ3-GFP-genet. Denne forbigående inducerede Ypq3-GFP, som akkumuleres i cellen på et niveau tæt på det endogene niveau af Ypq1-GFP (se Supplerende figur S3, online), blev fundet at lokalisere til den vakuolære membran (Fig. 5A), hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere resultater6. Denne vacuolære lokalisering blev også observeret i pep12Δ-mutanten. I apm3Δ- og apl5Δ-mutanterne blev Ypq3 imidlertid hovedsageligt missorteret til vacuolens lumen. Denne missorting var afhængig af Pep12, da Ypq3 ikke blev målrettet mod vacuolen i apm3Δ pep12Δ- og apl5Δ pep12Δ-dobbeltmutanter (Fig. 5A) (for en kvantificering af sublokaliseringsmønstrene, se Supplerende Fig. S4 online). Disse resultater tyder på, at Ypq3 ligesom Ypq1 og Ypq2 hovedsageligt bruger ALP-vejen til at nå den vakuolære membran. Når komponenter af AP-3-komplekset mangler, omdirigeres Ypq3 på en Pep12-afhængig måde til endosomer, hvor det sorteres ind i den multivesikulære legemsvej (MVB), hvilket resulterer i dets levering til det vacuolære lumen. Denne fortolkning blev yderligere vurderet ved at isolere en Ypq3LL>AA-mutant, som ikke bør genkendes af AP-3-adaptorkomplekset. I wild-type celler blev Ypq3LL>AA varianten klart missorteret til det vacuolære lumen, men i en pep12Δ mutant blev den omdirigeret til små cytosoliske punktstrukturer (Fig. 5B).

Ypq3 leveres til den vacuolære membran via ALP-vejen og er målrettet mod det vacuolære lumen, hvis sortering via ALP-vejen er defekt.

(A) Stamme 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) og LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), der er transformeret med plasmidet pLL106 (GAL1-YPQ3-GFP URA3), blev dyrket på raffinose-ammoniummedium, galaktose (3 %) blev tilsat i 3 timer, og cellerne blev tilsat glukose (3 %) i 2 timer. Cellerne fik lov til at internalisere FM4-64 i 15 minutter for at markere vacuolen før billeddannelse. (B) Stamme 23344c (ura3) transformeret med pLL106 (GAL1-YPQQ3-GFP URA3) og pLL168 (GAL1-YPQ3LL>AA-GFP URA3) plasmiderne og stamme EN046 (pep12∆ ura3) transformeret med pLL168 (GAL1p-YPQ3LL>AA-GFP URA3) plasmidet blev dyrket og analyseret som i (A). Skala bar: Skala: 5 μm. En kvantificering af Ypq3-GFP’s sublokaliseringsmønstre kan findes som Supplerende figur S4 online.

Vi overvejede, at den anderledes opførsel af Ypq3 sammenlignet med Ypq1 og Ypq2 i AP-3-mangelfulde stammer kunne skyldes, at Ypq3-GFP blev syntetiseret i celler, der voksede i tilstedeværelse af galactose, eller fordi transkription af Ypq3-GFP-genet blev induceret ved hjælp af den stærke GAL-promotor. Dette synes imidlertid usandsynligt, fordi Ypq1-GFP- og Ypq2-GFP-proteinerne, der er transient induceret i vild-type og mutantstammer ved hjælp af den samme GAL-promotor, lokaliserede sig i cellerne, som når de blev udtrykt under deres egne genpromotorer (se Supplerende figur S5 online). Desuden, selv om det fluorescerende signal var knap nok påviseligt, fik vi beviser for, at Ypq3-GFP udtrykt ved hjælp af det naturlige YPQ3-genets promotor mærkede vacuolernes membran i wild-type stammen, men ikke i apl5Δ mutanten, en fænotype, der klart adskiller sig fra dem, der blev opnået med Ypq1-GFP og Ypq2-GFP. I denne mutant var Ypq3-GFP til stede i punktstrukturer, der sandsynligvis svarede til Golgi, og dens fejlsortering til det vacuolære lumen var ikke tydeligt synlig, sandsynligvis fordi fluorescensen var for svag (se Supplerende figur S6 online).

Sammenfattende kan det konkluderes, at Ypq2- og Ypq3-proteinerne, som vist ovenfor for Ypq1, hovedsageligt bruger ALP-vejen til at nå den vakuolære membran og afledes til endosomer, når denne vej er defekt. Men mens Ypq1 og Ypq2, der passerer gennem endosomer, effektivt når den vakuolære membran, er Ypq3 mere tilbøjelig til at blive sorteret ind i MVB-vejen, hvilket fører til, at det målrettes til det vakuolære lumen.

PQLC2 produceret i gær bruger ALP-vejen og dens dileucinmotiv til at nå den vacuolære membran

I en tidligere undersøgelse blev det konstateret, at rotte-PQLC2 lokaliseres til lysosomer i HeLa-celler, men dens PQLC2LL>AA-mutant, hvor den C-terminale dileucin er erstattet med en dialanin, viste en mere diffus fordeling gennem cellen og blev delvist missorteret til plasmamembranen6. Desuden viste det sig, at PQLC2 produceret i gær lokaliseres til den vakuolære membran, hvor den er funktionel, da den viste sig at supplere vækstfænotypen hos en ypq2Δ-mutant6. Resultaterne i fig. 6A viser, at PQLC2 var korrekt målrettet mod gærvakuolen i en pep12Δ-mutant, men afveg til det vakuolære lumen i apm3Δ- og apl5Δ-mutanter. Denne målretning til det vacuolære lumen var nedsat i apm3Δ pep12Δ- og apl5Δ pep12Δ-dobbeltmutanter, hvor PQLC2 viste sig at være diffust fordelt gennem cytosolen (for en kvantificering af sublokaliseringsmønstrene, se Supplerende figur S7 online). Vi udtrykte også i wild-type og mutantgærstammer PQLC2LL>AA-mutanten i wild-type og mutantgærstammer. I vild-type gær blev PQLC2LL>AA fundet lokaliseret til det vacuolære lumen, men det blev fundet fordelt i hele cytosolen i pep12Δ-mutanten (Fig. 6B). Sortering af fragtstoffer til den multivesikulære legemsvej er typisk forringet i en vps27Δ-mutant, der mangler en nøglekomponent i ESCRT-0-komplekset18. I vps27Δ-mutanten blev PQLC2LL>AA stablet i et stort perivacuolært kompartment: det klasse E-kompartment, der typisk observeres i denne kategori af mutanter (fig. 6B). Disse resultater viser, at PQLC2 produceret i gær opfører sig som den endogene Ypq3: den sorteres til vacuolen via ALP-vejen på en måde, der er afhængig af korrekt genkendelse af dens dileucinmotiv af AP-3 adaptorkomplekset. Når denne genkendelse er svækket, fordi dileucinmotivet er muteret eller en komponent af AP-3-komplekset mangler, afviger PQLC2 til endosomer, hvor den effektivt sorteres ind i MVB-vejen og til sidst når frem til det vacuolære lumen.

PQLC2 udtrykt i gær sorteres til den vacuolære membran via ALP-vejen.

(A) Stamme 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) og LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), der var transformeret med plasmidet pCJ502 (GAL1-rPQLC2-GFP URA3), blev dyrket og behandlet som i fig. 5 før billeddannelse. (B) Stammerne 23344c (ura3), JA770 (vps27∆ ura3) og EN046 (pep12∆ ura3), der var transformeret med pBOA006 (GAL1-rPQLC2LL>AA-GFP URA3)-plasmidet, blev dyrket og behandlet som i fig. 5 før billeddannelse. Skala bar: 5 μm. En kvantificering af sublokaliseringsmønstrene for PQLC2-GFP findes som Supplerende figur S7 online.

Depletion af en AP-3 underenhed forringer levering af PQLC2 til lysosomer

PQLC2-GFP produceret i HeLa-celler kolokaliserer stort set med LAMP1 lysosomal markør. Lokalisering af PQLC2 til den lysosomale membran blev yderligere understøttet af semi-kvantitativ massespektrometrianalyse af proteiner i præparater stærkt beriget i lysosomale membraner fra rotteleverceller6. For at bestemme, om AP-3-adapteren bidrager til sortering af PQLC2 til lysosomerne, brugte vi små interfererende RNA (siRNA) til at hæmme syntesen af μ3A-underenheden af AP-3 i HeLa-celler. Immunoblot-analyse bekræftede, at de to typiske bånd, der svarer til μ3A-underenheder19 , næsten ikke kunne påvises i μ3A-siRNA-behandlede celler i modsætning til kontrolceller (fig. 7A). Denne udtynding af μ3A forstyrrede stærkt lokaliseringen af PQLC2-GFP (Fig. 7B): proteinet lokaliserede sig i høj grad til talrige intracellulære punktstrukturer, der ikke var mærket med Lyso Tracker-farvestoffet, der akkumuleres i lysosomer, og blev også fundet på celleoverfladen, herunder mikrovilli, hvilket indikerer, at en del af proteinet også blev omdirigeret forkert til plasmamembranen. Dette står i kontrast til lokaliseringen af PQLC2 i mock-behandlede celler, hvor proteinet var til stede i punktformede strukturer, der også var stærkt mærket med Lyso Tracker-farvestoffet, som forventet. Disse resultater tyder på, at AP-3-komplekset bidrager til korrekt lokalisering af PQLC2 til lysosomer. Vi undersøgte også lokaliseringen af PQLC2LL>AA-mutanten (Fig. 7C). I kontrol HeLa-celler blev PQLC2LL>AA fundet fordelt i intracellulære punktstrukturer, der ikke eller meget dårligt var mærket med Lyso Tracker-farvestoffet, og den var også klart til stede på celleoverfladen, hvilket er i overensstemmelse med tidligere observationer6. Denne lokalisering var ikke væsentligt forstyrret i μ3A-siRNA-behandlede celler, hvilket understøtter det synspunkt, at PQLC2’s dileucinmotivs rolle er at formidle intracellulær trafik via AP-3-komplekset. Vi undersøgte dernæst, om PQLC2LL>AA omdirigeres til lumenet af endosomale/lysosomale kompartmenter, som når det produceres i gær. HeLa-celler, der udtrykker PQLC2-GFP, blev behandlet i to timer med vacuolin-1, et stof, der inducerer homotypisk fusion af kompartmenter i det endosomale/lysosomale system, hvilket resulterer i dannelse af store, hævede strukturer (Fig. 8). PQLC2-EGFP blev som forventet lokaliseret til den begrænsende membran i disse forstørrede endosomale/lysosomale kompartmenter. Det samme var tilfældet i celler, der producerede PQLC2LL>AA, hvilket tyder på, at det mutante protein ikke sorteres effektivt ind i MVB-vejen. Det kan konkluderes, at AP-3 adaptorkomplekset synes at spille en vigtig rolle i målretning af PQLC2 til lysosomet, sandsynligvis via genkendelse af dets C-terminale dileucin. Når denne genkendelse er svækket, bliver proteinet afledt til celleoverfladen og til den begrænsende membran i de indre rum.

Ap-3 adaptorkomplekset er påkrævet for lokalisering af PQLC2 til lysosomet i HeLa-celler.

(A) HeLa-celler blev transficeret tre gange med siRNA’er rettet mod μ3A-underenheden af AP3-komplekset. 48 timer efter den tredje transfektionsrunde blev tilsvarende mængder homogenater af mock- og siRNA-behandlede celler underkastet SDS-PAGE og immunoblotting ved hjælp af et antistof mod μ3A-underenheden af AP3-komplekset. Tallene svarer til de relative niveauer af μ3A-underenheden estimeret ved hjælp af actin som reference (B) Ved tredje runde af transfektion med siRNA’er blev cellerne kotransficeret med rPQLC2-EGFP eller rPQLC2LL>AA-EGFP-plasmiderne. Efter 48 timer blev cellerne inkuberet i 2 timer med Lysotracker-Red DND-99 og fikseret før billeddannelse. Skala bar:

PQLC2 leveres ikke til lumenet af lysosomer, når sortering via AP-3-komplekset er nedsat.

HeLa-celler transficeret med PQLC2-EGFP- eller PQLC2LL>AA-EGFP-plasmiderne blev behandlet med vacuolin-1 i 2 timer. Cellerne blev fikseret og undersøgt ved fluorescensmikroskopi. Skala bar: 10 μm.