AP endonuklease EXO-3 mangel forårsager udviklingsforsinkelse og unormal vulval organogenese, Pvl, gennem DNA-glykosylase-initieret checkpoint-aktivering i Caenorhabditis elegans

Ekspressionsniveauet af AP-endonukleaser stiger efter L4-stadiet

Efter udklækning af C. elegans udvikler sig til voksne gennem fire larvestadier (L1-L4), der hver især er afbrudt af en skældannelse af kutiklen. Voksenstadier er stadig underopdelt i to stadier: det unge voksenstadium og det gravide voksenstadium. For at få indsigt i AP-endonukleasernes rolle efter embryogenese målte vi den tidsmæssige ændring i mRNA-ekspressionsniveauet af exo-3 eller apn-1. Ved 0, 24 og 48 timer, hvor de fleste N2-orme befinder sig i henholdsvis ægstadiet, L1-stadiet og L4-stadiet, blev der ikke fundet nogen forskel i mRNA-ekspressionsniveauet for både exo-3 og apn-1 (Fig. 1a,b). Ved 60 timer, hvor de fleste N2-orme befinder sig i det unge voksne stadium, var exo-3- og apn-1-ekspressionsniveauerne ca. 13 gange og 2,3 gange højere end ved 0 timer (Fig. 1a,b). Ekspressionsniveauet ved 72 timer, når de fleste N2-orme er i det gravide voksne stadium, var det samme som ved 60 timer (Fig. 1a,b). Disse resultater tyder på, at AP-endonukleaser er nødvendige efter embryogenese, især efter L4-stadiet.

De exo-3 mutanter udviser udviklingsforsinkelse

For at klarlægge AP endonukleasernes bidrag til ormenes udvikling fra L4- til voksenstadiet blev orme med mangel på en eller begge AP endonukleaser (EXO-3 og APN-1) inkuberet under normale opdrætsforhold i 3 dage fra det befrugtede ægstadium (Fig. 1c). Udviklingsstadier blandt L4-, ung voksen- og gravid voksenstadier blev skelnet efter tilstanden af vulvemorfologi og æggene (Fig. 1d,f). Selv om alle N2-ormene udviklede sig til gravide voksne, var kun 14% af exo-3-mutanterne i det gravide voksne stadium, 85% var i det unge voksne stadium og 1% var i larvestadiet (Fig. 1g), hvilket tyder på, at EXO-3-mangel forårsager ophør af udvikling eller udviklingsforsinkelse. I modsætning hertil blev alle apn-1-mutanterne gravide voksne, og apn-1;exo-3-mutanterne var på næsten de samme udviklingsstadier som exo-3-mutanterne (Fig. 1g). Tolv timer senere nåede alle exo-3- og apn-1;exo-3-mutanterne det gravide voksne stadium (data ikke vist), hvilket indikerer, at EXO-3-mangel ikke forårsager ophør af udviklingen på det unge voksne stadium, men kun udviklingsforsinkelse. For præcist at undersøge, hvor lang forsinkelsen hos exo-3-mutanterne var, målte vi hver enkelt orms tid til gravid voksen alder hver anden time og beregnede forskellen i den gennemsnitlige tid mellem N2 (N = 8) og exo-3-mutanterne (N = 16). Forskellen var 6 timer.

Udviklingsforsinkelsen hos exo-3 mutanterne er afhængig af DNA-glykosylasen NTH-1

Det er rimeligt at udlede, at udviklingsforsinkelsesfænotypen hos exo-3 mutanterne skyldes ophobning af AP-steder eller 3′-blokerede SSB i DNA, fordi disse er substrater for EXO-315. Disse strukturer i DNA kan genereres af DNA-glykosylaser. Af de to DNA-glykosylaser, der er bevaret i C. elegans, genererer UNG-1 AP-steder gennem monofunktionel DNA-glykosylaseaktivitet på uracil i DNA, og NTH-1 producerer 3′-blokerede SSB gennem bifunktionel DNA-glykosylaseaktivitet på oxidative pyrimidinlæsioner i DNA. Derfor undersøgte vi, om forsinkelsen i exo-3-mutanterne er afhængig af UNG-1 og NTH-1. Tre dage efter udvikling fra æg var 9% af ung-1;exo-3 mutanterne i det gravide voksne stadium, 86% var i det unge voksne stadium og 5% var i larvestadiet, og disse proportioner var næsten de samme som dem, der blev vist af exo-3 mutanterne (11% i det gravide voksne stadium, 85% i det unge voksne stadium og 4% i larvestadiet) (Fig. 2), hvilket tyder på, at forsinkelsen er uafhængig af UNG-1. I modsætning hertil var 94% af nth-1;exo-3 mutanterne i det gravide voksne stadium og 6% i det unge voksne stadium. nth-1;ung-1;exo-3 mutanterne viste lignende resultater (Fig. 2), hvilket tyder på, at forsinkelsen er afhængig af NTH-1.

Den udviklingsmæssige forsinkelse af exo-3 mutanterne forstærkes af MMS og NaHSO3

For at klarlægge, om AP-sted-genererende midler kan forårsage udviklingsmæssig forsinkelse, udførte vi et udviklingsassay ved hjælp af MMS og natriumbisulfit (NaHSO3) (Fig. 3a). MMS er kendt for indirekte at skabe AP-steder20,21 og har vist sig at inducere DNA-læsioner i C. elegans’ genom22. 3,5 dage efter æggene blev lagt på plader, der indeholdt 0,94 mM MMS, var 97 % af N2 i det gravide voksne stadium og 3 % i larvestadiet, mens 61 % af exo-3-mutanterne var i det gravide voksne stadium, 34 % var i det unge voksne stadium og 5 % var i larvestadiet (Fig. 3b), hvilket tyder på, at MMS-inducerede AP-steder forårsager yderligere udviklingsforsinkelse i exo-3-mutanterne end i N2. På den anden side var 93 % af apn-1-mutanterne i det gravide voksne stadium, 6 % var i det unge voksne stadium og 1 % var i larvestadiet, hvilket svarer til resultaterne for N2 (Fig. 3b). NaHSO3 beskadiger DNA hovedsageligt gennem deaminering af cytosin til uracil23. Fire dage efter at have udviklet sig fra ægstadiet udviklede alle exo-3-mutanter, der ikke blev behandlet med NaHSO3, sig til gravide voksne, men 33 % af dem, der blev behandlet med 10 mM NaHSO3, var i det gravide voksne stadium, 12 % var i det unge voksne stadium og 55 % var i larvestadiet (Fig. 3c), hvilket indikerer, at NaHSO3 inducerede udviklingsforsinkelse hos exo-3-mutanterne. Denne forsinkelse blev afhjulpet i ung-1;exo-3 mutanterne, da 79 % af dem, der blev behandlet med 10 mM NaHSO3, var i det gravide voksne stadium, 14 % var i det unge voksne stadium og 7 % var i larvestadiet (Fig. 3c), hvilket tyder på, at den NaHSO3-inducerede udviklingsforsinkelse skyldtes UNG-1-aktivitet. Samlet set kan AP-steder forårsage udviklingsforsinkelse såvel som 3′-blokeret SSB genereret af NTH-1.

Den udviklingsmæssige forsinkelse af exo-3 mutanterne er induceret af CHK-2

Vi antog dernæst, at den DNA-glykosylase-initierede udviklingsmæssige forsinkelse af exo-3 mutanterne skyldtes DNA-skadeskontrolpunktsaktivering drevet af spaltningsprodukter produceret af DNA-glykosylaser. DNA-skadekontrolpunktgener, såsom chk-2 og clk-2, er blevet beskrevet i C. elegans24. For at teste vores hypotese blev udviklingsassayet udført under chk-2 (RNAi) eller clk-2 (RNAi) betingelser (Fig. 4a). Selv om 14% af exo-3;kontrol (RNAi) ormene var i det gravide voksne stadium og 84% var i det unge voksne stadium, og exo-3;clk-2 (RNAi) ormene viste lignende proportioner (18% i det gravide voksne stadium og 82% i det unge voksne stadium), var 93% af exo-3;chk-2 (RNAi) ormene i det gravide voksne stadium (Fig. 4b). Således reddede knockdown af chk-2 udviklingsforsinkelsen i exo-3 mutanterne, hvilket tyder på, at CHK-2 inducerer udviklingsforsinkelsen i exo-3 mutanterne.

EXO-3 forhindrer dut-1 (RNAi)-induceret Pvl-dannelse

DUT-1 er en deoxyuridin-trifosfat-nukleotidohydrolase (dUTPase), som hydrolyserer dUTP til dUMP. Derfor fører dut-1 (RNAi) til øget dUTP i nukleotidpuljen, som inkorporeres i DNA gennem DNA-replikation i stedet for dTTP, hvilket medfører ophobning af uracil i DNA25,26. Det er blevet rapporteret, at dut-1 (RNAi) inducerer unormal vulvalorganogenese, Pvl, i wild-type N2-orme, og at den dut-1 (RNAi)-inducerede Pvl er afhængig af UNG-127. Vi spekulerede i, at EXO-3-mangel forårsager en stigning i forekomsten af dut-1 (RNAi)-induceret Pvl, fordi EXO-3 er nødvendig for at reparere AP-steder efter UNG-1’s spaltning af uracil i DNA. For at bekræfte dette blev dut-1 (RNAi)-induceret Pvl-dannelse observeret i AP-endonuklease-deficiente mutanter (Fig. 5a-c). Af de overlevende voksne 4 dage efter udvikling fra æg var 52% exo-3 mutanter med dut-1 (RNAi)-induceret Pvl og 13% var N2 orme med Pvl (Fig. 5d), hvilket tyder på, at EXO-3 mangel forårsager en stigning i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl. På den anden side havde 15% af apn-1-mutanterne Pvl, hvilket svarer til andelen af N2-orme med Pvl (Fig. 5d). Apn-1;exo-3-mutanterne og exo-3-mutanterne havde samme andel, idet 52 % havde Pvl (Fig. 5d).

Stigningen i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl i exo-3 mutanterne er afhængig af UNG-1 uanset NTH-1

For at undersøge, om stigningen i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl i exo-3 mutanterne skete gennem UNG-1 aktivitet, undersøgte vi afhængigheden af fænotypen af UNG-1. Procentdelen af ung-1;exo-3-mutanter med Pvl var 2%, hvilket var det samme som for ung-1-mutanterne med Pvl (1%) (Fig. 6a), hvilket tyder på, at stigningen i Pvl i exo-3-mutanterne kun skyldes UNG-1-ekspression.

Næst undersøgte vi, om de spaltningsprodukter, der produceres af UNG-1, er nødvendige for at inducere Pvl, dvs. om AP-stederne omdannes til 3′-blokeret SSB via AP-lyaseaktiviteten af NTH-1. Procentdelen af exo-3-mutanter med Pvl var sammenlignelig med procentdelen af nth-1;exo-3-mutanter (fig. 7b), hvilket tyder på, at NTH-1 ikke er nødvendig for dut-1 (RNAi)-induceret Pvl.

Stigningen i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl i exo-3 mutanterne er drevet af CHK-2

Vi antog, at den UNG-1-afhængige stigning i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl i exo-3 mutanterne kan ske via DNA-checkpoint-aktivering drevet af spaltningsprodukter produceret af UNG-1 ud over udviklingsforsinkelse. Det er også blevet rapporteret, at dut-1 (RNAi)-induceret Pvl er forårsaget af checkpoint-kinasen CLK-227. Derfor undersøgte vi, om stigningen i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl i exo-3-mutanterne var afhængig af CHK-2 og CLK-2. Selv om 49% af exo-3;kontrol (RNAi) orme havde dut-1 (RNAi)-induceret Pvl, havde kun 10% af exo-3;chk-2 (RNAi) ormene det (Fig. 6b). På den anden side var andelen af exo-3;clk-2 (RNAi) orme med Pvl næsten den samme (44%) som andelen af exo-3;kontrol (RNAi) orme. Derfor reddede knockdown af chk-2 stigningen i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl i exo-3 mutanterne, som det blev observeret for udviklingsforsinkelse. Disse resultater tyder på, at stigningen i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl i exo-3 mutanterne sker via CHK-2 ekspression.

Oxidative DNA-skadelige agenter øgede kun andelen af Pvl i exo-3-mutanterne, når de blev kombineret med dut-1 (RNAi)

For at undersøge andre DNA-skadelige agenter, der forårsager en stigning i Pvl i exo-3-mutanterne, evaluerede vi, om Pvl-dannelsen øges af oxidative DNA-skadelige agenter såsom ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) og methylviologen (MV). NDX-1 og NDX-2 hydrolyserer 8-oxo-dGDP til 8-oxo-dGMP24,28. Følgelig fører ndx-1 (RNAi) og ndx-2 (RNAi) til en stigning i 8-oxo-dGDP i nukleotidpuljen. Tilstedeværelsen af 8-oxo-dGDP reducerer NDX-4’s 8-oxo-dGTPaseaktivitet, hvilket medfører, at 8-oxo-dGTP ophobes i puljen24. 8-oxo-dGTP inkorporeres i DNA under DNA-replikation, hvilket resulterer i en ophobning af 8-oxoG i DNA24,28. MV genererer superoxidradikaler, som efterfølgende forårsager oxidative læsioner i DNA29. En enkelt behandling med ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) eller MV havde imidlertid ingen effekt på forekomsten af Pvl i exo-3-mutanterne. (data ikke vist). Dernæst undersøgte vi, om hvert oxidativt DNA-skadende middel, når det kombineres med dut-1 (RNAi)-behandling, yderligere forstærkede stigningen i Pvl i exo-3-mutanterne (Fig. 7a). Hver testet behandling øgede stigningen i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl i exo-3 mutanterne med ca. 10 % (Fig. 7b), hvilket tyder på, at oxidative læsioner i DNA også kan forårsage en stigning i Pvl.

I in vitro-forsøg viste NTH-1 sig at besidde en svag DNA-glykosylaseaktivitet over for 8-oxoG i DNA, ud over sin meget højere aktivitet over for oxidative pyrimidinlæsioner30. Vi formoder således, at den højere stigning i dut-1 (RNAi)-induceret Pvl ved de yderligere oxidative midler afhænger af aktiviteten af NTH-1. Selv om vi bekræftede fænotypens afhængighed af NTH-1, ændrede NTH-1-mangel ikke andelen af orme, der udviste Pvl (Fig. 7b).