Apc-relaterede modeller af intestinal neoplasi: en kort gennemgang for patologer

Colorectal carcinoma er en almindelig årsag til kræftdødelighed i den vestlige verden. I mange patologipraksis udgør kolorektale adenomer, der fjernes under screeningskoloskopier, en høj procentdel af den daglige arbejdsbyrde, og derfor er morfologien af humant kolorektalcarcinom og adenomer, dets forstadier til læsioner, velkendt for kirurgiske patologer. I akademiske centre kan kirurgiske patologer blive bedt om at fortolke musemodeller af neoplasi for investigatorer, og en grundlæggende forståelse af ligheder og forskelle mellem morfologien af human tarmneoplasi og musemodeller er nødvendig for en præcis fortolkning.

Genetisk ændrede musemodeller af tumorigenese, selv om de undertiden kritiseres for deres ufuldkomne modellering af menneskelig sygdom, er nyttige til vurdering af, om specifikke mutationer kan føre til tumordannelse, til kemopræventionsundersøgelser og til at belyse funktionaliteten af ændrede genprodukter. Der er mange genetisk manipulerede musemodeller (GEM-modeller) af tarmneoplasi beskrevet i den videnskabelige litteratur, men de kan groft sagt opdeles i fem grupper: Apc-relaterede modeller med ændringer i Wnt-signalering, modeller med mangelfuld mismatch-reparation, modeller behandlet med carcinogener, modeller med ændringer i transformerende vækstfaktor β og colitis-associeret neoplasi, der opstår i immundefekte modeller som f.eks. IL10-/-mus. Denne gennemgang vil fokusere på patologien i en af de første GEM-modeller for tarmneoplasi, ApcMin+/- musen og beslægtede modeller, med det formål at beskrive de morfologiske træk ved de intestinale læsioner med sammenligning med humane colorectale adenomer og carcinomer.

En af de mest udbredte modeller for human tarmneoplasi er ApcMin+/- modellen, der blev udviklet i 1990 i William Doves laboratorium (Moser et al., 1990). ApcMin+/- musen, den første germlinemutante musemodel af tarmneoplasi, bærer en autosomal dominant funktionstabsmutation ved Apc-kodon 850, der er genereret ved eksponering for N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), et meget potent mutagen. Der er siden blevet skabt en række andre modeller med Apc-mutationer, mange med truncating-mutationer (tabel 1).

Disse Apc-relaterede modeller er særligt nyttige, fordi den mest almindelige drivermutation for kolorektalcarcinom hos mennesker er mutation i tumorsuppressor-genet APC, hvilket fører til inaktivering af APC og aktivering af Wnt-signalvejen med stabilisering af β-catenin og translokation af det til kernen. APC-genet hos mennesker koder for et 213 kilodalton protein, der er involveret i celleadhæsion og motilitet, regulering af cellecyklus, apoptose og signaltransduktion (Boman & Fields, 2013), og dets germlinemutation resulterer i familiær adenomatose polyposis coli (FAP). Dette kræftprædisponeringssyndrom er karakteriseret ved udvikling af hundredvis af kolorektal adenomer, der fører til adenokarcinom i en ung alder. De fleste mutationer, der forårsager FAP, er inden for 5′-halvdelen af genet og resulterer i afkortede polypeptider.

Genetik af APC-relaterede dyremodeller

Mange Apc-relaterede musemodeller er blevet konstrueret til at indeholde germlinemutationer i Apc, der fører til ekspression af et afkortet Apc-protein; i de fleste af disse modeller er kun heterozygoter levedygtige, da homozygotitet er embryonalt dødelig. Tab af vækstkontrol ved tab af den resterende vildtypekopi af Apc fører til multiple tarmadenomer. Den specifikke placering af Apc-mutationen påvirker musenes polypemultiplicitet, placering og levetid (McCart et al., 2008). For eksempel har Apc1638N/+ musen en reduceret polypebyrde og en længere levetid sammenlignet med ApcMin/+ musen (Smits et al, 1998), I Apc1322T-musen bevarer det mutante protein en 20-aminosyre β-catenin-bindings-/nedbrydningsreplik (i ApcMin/+-musene er der ingen); adenomer i disse mus kan påvises tidligere, har mere alvorlig dysplasi og er større (Pollard et al., 2009) sammenlignet med ApcMin/+-musene. Timing af Apc-funktionstab kan også være vigtig; for eksempel resulterer trinvis Apc-tab ved hjælp af Apc(Min/CKO) eller Apc(1638N/CKO) i groft synlig neoplasi i tarmen, mens samtidig tab fører til okkult klonal ekspansion gennem kryptfission uden morfologisk transformation (Fischer et al., 2012). Deletion af hele Apc-genet i ApcΔel-15 musen giver hurtigere tumorudvikling sammenlignet med Apc-trunkering, med nedsat overlevelse, mere alvorlig polypose og mere fremskreden tyktarms tumorprogression sammenlignet med ApcMin/+ mus (Cheung et al, 2010).

Genetisk ændrede rottemodeller med Apc-mutation er også tilgængelige og er tiltalende baseret på modellernes lang levetid og den relative lethed at udføre koloskopi, hvilket giver mulighed for longitudinelle eksperimenter (Tabel 2). De mest almindelige er Kyoto Apc Delta (KAD)-rotten og Pirc-rotten. KAD-rotten stammer fra ENU-mutagenese og har en nonsense-mutation ved kodon 2523 i Apc’s exon 15, hvilket giver et afkortet protein. Disse rotter er levedygtige i homozygot tilstand og udvikler ikke spontant tarmtumorer. Behandling med azoxymethan og dextransulfatnatrium (AOM/DSS) er nødvendig for at fremkalde tarmneoplasi. Pirc-rotten, der også er fremstillet via ENU-induceret mutagenese, har en Apc-mutation på nukleotid 3409, hvilket giver et afkortet protein. Denne mutation er embryonalt dødelig i homozygote tilstand. Mutationen har 100 % penetrering, og alle rotter udvikler kolonpolypper efter 4 måneders alderen.

Der er udviklet en genetisk modificeret svinemodel, der bærer en APC 1311-mutation, der er ortolog til menneskets APC 1309. Disse dyr udvikler aberrant crypt foci, enkelte crypt adenomer og multiple colorectale adenomer, svarende til human FAP. De større adenomer udviser progression i form af højgradsdysplasi. Overfladeinvolvering, svarende til humane adenomer (Flisikowska et al., 2012), er karakteristisk.

Modifikatorer af kræftfænotyper

Stammeforskelle har længe været anerkendt som havende en betydelig effekt på tumorbyrden i ApcMin+/- modellen, som normalt opretholdes på en C57Bl/6J baggrund. Krydsning af B6 Min/+-mus med AKR og andre indavlede stammer resulterede i et fald i det gennemsnitlige tumorantal i F1-musene (Shoemaker et al., 1997). Backcrossing-eksperimenter og andre genetiske analyser med henblik på at kortlægge modificerende loci har givet en række kandidatgener til Modifier of Min (Mom) (McCart et al., 2008). Desuden har kost og tarmmikrobiomet i musekolonien vigtige virkninger på polyppernes multiplicitet, progression og størrelse. For eksempel har en fedtholdig lavfibret vestlig diæt vist sig at øge antallet af polypper og tumorprogression hos ApcΔ716/+ mus (Hioki et al., 1997).

Patologi

Morfologien af tarmlæsioner i ApcMin+/-og beslægtede modeller er ens på tværs af modellerne, selv om alderen for debut, graden af dysplasi og fordelingen i mave-tarmkanalen varierer (Tabel 1). De tidligst genkendelige læsioner består af en enkelt forstørret krypt eller en lille klynge af krypter foret af overfyldte celler med øget kerne-til-cytoplasma-forhold og nukleær hyperkromasi (Fig. 1). Disse tidlige læsioner er dysplastiske læsioner af lav grad, der ligner de små tubulære kolonardenomer, som ses hos patienter med FAP. I tyndtarmen udvikles der en lille invagination i lamina propria i den proliferative zone ved krypto- og villusovergangen (fig. 2). De adenomatøse celler trænger ind i lamina propria og op i villus og danner et dobbeltlag af adenomatøst epitel under en normal overfladeslimhinde (fig. 3). I colon invaginerer de tidlige adenomer ind i lamina propria mellem krypterne, selv om der også kan identificeres enkeltstående kryptadenomer (Oshima et al., 1997). Immunohistokemi for beta catenin kan bruges til at hjælpe med at identificere tidlige adenomer, da selv enkeltstående krypt adenomer i ApcMin+/- og beslægtede modeller viser ophobning af nukleær beta catenin (Fig. 4).

Når adenomerne vokser, danner de polypoide, stilkede eller undertiden kopformede læsioner med et nedtrykt center (Fig. 5a og b). I mange modeller udvikler adenomerne sig ikke ud over lavgradsdysplasi. I modeller med længere levetid og færre tumorer udvikler nogle dog højgradsdysplasi, der er karakteriseret ved en kribriform arkitektur, hvor ikke alle celler er i kontakt med en basalmembran (fig. 6). Talrige mitotiske figurer og apoptotiske legemer er almindelige i adenomer på alle udviklingsstadier.

De tarmneoplasmer, der opstår i ApcMin+/- og beslægtede modeller, indeholder flere celletyper, men er primært sammensat af celler af absorptiv type og gobletceller (Tabel 3). Adenomer, der opstår i tyndtarmen hos ApcMin+/- og beslægtede modeller, indeholder Paneth-celler, der let kan identificeres på hæmatoxylin- og eosinfarve (Fig. 7) og fremhæves med immunohistokemi for lysozym. Det er vist, at de udgør 10 % eller mindre af cellerne i tyndtarmens adenomer (Moser et al., 1992). Musekolonet indeholder ikke Paneth-celler, men lysozym-eksprimerende celler, der mangler PAS-positivitet, er blevet identificeret i kolonardenomer i disse modeller, hvilket tyder på Paneth-cellelignende differentiering selv i kolonarlæsioner (Moser et al., 1992; Husoy et al., 2006). Neuroendokrine celler udgør en lille andel af cellerne i ApcMin+/- type adenomer, men den specifikke celletype afspejler de neuroendokrine celler, der findes i normal tarmslimhinde på stedet for adenomet (Moser et al., 1992). For eksempel er serotoninudtrykkende celler de mest almindelige neuroendokrine celler i musetarmen og findes overalt; sådanne celler udgør op til 5% af ApcMin+/- adenomcellerne i læsioner fra tyndtarm og tyktarm (Moser et al., 1992). PYYY-positive celler findes derimod kun i adenomer fra det distale colon, hvilket afspejler fordelingen af disse celler normalt. Neuroendokrine celler er diffust spredt ud over hele adenomerne og danner ikke små klynger som de lysozym-positive celler (Moser et al., 1992).

Dysplasi i tarmadenomer i musemodeller bør klassificeres ved hjælp af den samme terminologi (lavgradsdysplasi, højgradsdysplasi, intramukosalt karcinom) og kriterier som for humane colorectale adenomer (Washington et al., 2013). De fleste adenomer i ApcMin+/- musen og beslægtede modeller viser lavgrads dysplasi, men mange bliver gradvist større, efterhånden som musen bliver ældre, og nogle få udvikler sig langs adenom-carcinom-sekvensen. Invasivt karcinom er sjældent, da de fleste mus dør af anæmi eller intussusception inden udviklingen. Nogle få af de modeller med længere levetid og færre adenomer udvikler dog et adenokarcinom, der invaderer ind i submucosa (Colnot et al., 2004; Fodde et al., 1994; Robanus-Maandag et al., 2010). Metastase forekommer ikke i ApcMin+/- mus og er overordentlig sjældent i beslægtede modeller (Fodde et al., 1994).

Kirurgiske patologer, der bliver bedt om at analysere tarmprøver, bør være opmærksomme på en faldgrube ved vurdering af tumorinvasion i musemodeller. Da lagene i musetarmen er tynde og sarte, er herniation af benignt epithelium ind i submucosa en almindelig forekomst (Boivin et al., 2003), især i forbindelse med rektal prolaps og i inflammatoriske tilstande (Fig. 8a og b). Lignende forskydning af adenomatøs mucosa (pseudoinvasion) forekommer i pedunculated colorectal adenomer hos mennesker og i colitis cystica profunda. Konsensusretningslinjer for skelnen mellem herniation og invasivt adenocarcinom blev udviklet på en Mouse Models of Intestinal Neoplasia Workshop på Jackson Laboratories i 2000 af et panel af forskere og patologer (Boivin et al., 2003) og er opsummeret i tabel 4. Det er muligvis ikke muligt at diagnosticere invasivt karcinom med sikkerhed, især i inflammatoriske modeller eller områder med prolaps, og evaluering af ældre mus med bedre udviklede læsioner kan være nødvendig for en endelig bestemmelse af invasion.

Invasion i lamina propria er karakteriseret ved udvikling af kantede kryptprofiler med individuelle infiltrerende celler og kan være ledsaget af stromale forandringer såsom desmoplasi og øget inflammatorisk celletæthed (Fig. 9a og b).