Apocynin, en lavmolekylær oral behandling af neurodegenerativ sygdom

Abstract

Accumulerende beviser tyder på, at inflammatoriske mediatorer, der udskilles af aktiverede residente eller infiltrerede medfødte immunceller, har en betydelig indvirkning på patogenesen af neurodegenerative sygdomme. Dette kan betyde, at patienter, der er ramt af en neurodegenerativ sygdom, kan have gavn af behandling med selektive hæmmere af den medfødte immunitetsaktivitet. Her gennemgås det terapeutiske potentiale af apocynin, en i det væsentlige ugiftig phenolforbindelse, der er isoleret fra lægeplanten Jatropha multifida. Apocynin er en selektiv hæmmer af den fagocytære NADPH-oxidase Nox2, der kan anvendes oralt og er bemærkelsesværdigt effektiv ved lav dosis.

1. Indledning

De aldrende samfund står over for en stigende prævalens af neurodegenerative sygdomme. Nogle relativt udbredte eksempler er Alzheimers og Parkinsons sygdom og mindre udbredte er Huntingtons og Lou Gehrig’s sygdom (amyotrofisk lateralsklerose; ALS). Alle neurodegenerative sygdomme har det til fælles, at der ikke findes nogen effektiv behandling, der kan standse den gradvise forringelse af de neurologiske funktioner. Det skal bemærkes, at ingen af de neuroprotektive midler, der er blevet afprøvet i klinikken, har en effektivitet, der rækker ud over symptomkontrol.

I de seneste år er indsigten vokset i, at inflammatoriske reaktioner fra hjemmehørende eller infiltrerede medfødte immunceller kan have en betydelig indflydelse på patogenesen af neurodegenerative sygdomme . En anerkendt central aktør er mikroglia, en gliacelle, der tilhører den myeloide slægt og ofte betegnes som CNS’s makrofager. Denne spændende nye indsigt kan betyde, at lægemidler med dokumenteret effektivitet i forbindelse med beskyttelse af perifere organer mod den cytotoksiske funktion af medfødte immunceller, såsom mononukleære eller polymorphonukleære fagocytter (henholdsvis MNC’er og PMN’er), også kan være nyttige til behandling af den neuroinflammatoriske komponent af neurodegenerative sygdomme. En stor forhindring, som lægemidlerne skal overvinde, er at passere blod-hjernebarrieren og trænge ind i CNS-parenkymet, hvor den neurodegenerative proces finder sted. I denne gennemgang vil vi diskutere prækliniske undersøgelser, der fremhæver potentialet af apocynin, en lille phenolisk antioxidant, som behandling af neurodegenerative sygdomme.

2. Apocynin, et farmakologisk aktivt plantefenol

Apocynin (4′-hydroxy-3′-methoxyacetophenon eller acetovanillon) blev identificeret som det biologisk aktive stof i rødderne af Picrorhiza kurroa Royle ex Benth, en flerårig plante, der vokser i det alpine Himalaya. Ekstrakter fra rødderne anvendes i den ayurvediske medicinske tradition i Indien og Sri Lanka til fremstilling af etniske lægemidler til behandling af lidelser i lever, hjerte, led og lunger. Vi har fremstillet et 95% ethanolisk rodekstrakt under kontrollerede forhold i laboratoriet og har underkastet præparatet en aktivitetsstyret rensning ved hjælp af oxidationsudbruddet hos humane polymorphonukleære/neutrofile granulocytter (PMN) som en eksperimentel test for akut inflammation .

Den udlæsningsassay, vi anvendte, var baseret på generering af luminolforstærket kemiluminescens af humane PMN stimuleret med zymosan opsoniseret i humant serum. Essensen af assayet er, at de serumopsoniserede gærpartikler stimulerer PMN via overfladeeksponerede receptorer for immunoglobuliner eller komplementfaktorer. De aktiveringssignaler, der sendes via disse receptorer, fører til tømning af cytoplasmatiske granula (degranulering) og til samling af den fagocytiske NADPH-oxidase Nox2. Nox2-enzymkomplekset er sammensat af membranbundne (, ) og cytoplasmatiske (, , , , og Rac2) underenheder . Samlingsprocessen omfatter fosforylering af underenhederne ved hjælp af specifikke kinaser og dannelse af thiolbroer. Det samlede kompleks optager elektroner fra NADPH og overfører disse til fri molekylær oxygen, hvilket fører til dannelse af superoxidanion (; reduktion med én elektron) og hydrogenperoxid (H2O2; reduktion med to elektroner). Begge oxidanter har cytotoksisk aktivitet, som det kunne påvises ved hjælp af røde blodlegemer fra forskellige arter . PMN’s oxidationsbølge består af en kaskade af stærkt reaktive oxygenarter, samlet benævnt ROS (figur 1). Ved reaktion med nitrogenoxid dannes den stærkt cytotoksiske peroxynitrit. I tilstedeværelse af Fe2+-ioner omdannes H2O2 til stærkt reaktive hydroxylradikaler (OH-), som via peroxidation af membranlipider påvirker cellemembranernes væskeformighed. Myeloperoxidase, der frigøres ved degranulering af PMN, katalyserer reaktionen af H2O2 med halogenidmolekyler (Cl2, Br2 og J2), hvorved der dannes meget giftige hypohalogenider (OCl-, OBr- og OJ-). ROS er væsentlige komponenter i den intracellulære aflivning af fagocyterede mikrober, men når de frigives i det ekstracellulære miljø, er de vigtige mediatorer for aktiverede PMN’ers vævsødelæggende aktivitet .

Figur 1

Reaktive oxygenarter, der produceres i fagocytternes oxidative burst. MPO: myeloperoxidase; NOS: nitrogenoxidsyntase (NO).

Det kan tænkes, at komponenter i kemisk komplekse planteekstrakter kan forstyrre aflæsningsassayet på flere niveauer og kan også udøve uspecifikke virkninger som f.eks. dræbning af PMN eller fjernelse af oxyradikalerne. Dette indebærer, at en vellykket aktivitetsstyret oprensning skal være velfokuseret og omhyggeligt kontrolleret for uspecifikke virkninger for at undgå falske positive resultater. På trods af disse forhindringer var vi i stand til at påvise en meget specifik aktivitet af apocynin i assayet. Apocynin blev fundet metabolisk aktiveret i en MPO-katalyseret reaktion med H2O2, der danner en symmetrisk dimer, diapocynin (figur 2). Observationen af, at reaktionsintermediæret kunne fanges med GSH, fik os til at opstille den hypotese, at metabolisk aktiveret apocynin kan blokere dannelsen af thiolbroer mellem de membranbundne og cytosoliske komponenter, der samler funktionel Nox2. Det blev imidlertid senere konstateret, at diapocynin direkte hæmmer Nox2-superoxidproduktionen, og at denne aktivitet er uafhængig af MPO . Et vigtigt resultat med apocynin har været, at det hæmmer PMN’ernes oxidative udbrud uden at hæmme den intracellulære aflivning af bakterier. Dette indebærer, at behandling med apocynin kan forhindre kollaterale skader på væv infiltreret af aktiverede PMN uden at hindre deres bakteriedræbende funktion.

Figur 2

Hæmning af mikroglia Nox2 af metabolisk aktiveret apocynin. Receptormedieret aktivering af mikrogliaceller inducerer produktion af reaktive oxygenarter og frigivelse af myeloperoxidase (MPO). Den MPO-katalyserede reaktion af apocynin med H2O2 fører til produktion af et reaktivt mellemprodukt, der stabiliseres ved binding til frie thiolgrupper, f.eks. GSH, eller ved dimerisering. Dimerisk apocynin (diapocynin) hæmmer Nox2-aktiviteten.

3. Apocynins virkning i AIMID-dyremodeller

Den første målsygdom, hvor vi testede den kliniske virkning af apocynin, var WAG/Rij (RT-) rottemodellen for kollageninduceret arthritis (CIA), som er en anerkendt præklinisk model for den autoimmune inflammatoriske sygdom (AIMID) reumatoid arthritis (RA). I denne model spiller PMN’er en klar patogen rolle, hvilket afspejler situationen hos RA-patienter . I rotteundersøgelsen valgte vi at give apocynin i et dosisinterval på 0,3 til 200 μg/mL drikkevand, som blev givet ad libitum. Det blev observeret, at allerede ved den laveste dosis på 0,3 μg/mL, svarende til en daglig oral dosis på 6 μg, blev arthritis næsten fuldstændigt undertrykt . Der blev ikke observeret nogen virkning af apocynin på serumniveauerne af anti-collagen autoantistof eller af IL-6, et vigtigt patogent cytokin i CIA og RA, hvilket tyder på høj selektivitet for den inflammatoriske komponent af sygdommen. Uafhængigt af os viste Hougee et al. i en CIA-musemodel, at apocynin, der indgives oralt, genopretter den blokerede produktion af bruskproteoglykan i det arthritiske led . En interessant bivirkning af behandlingen, der illustrerer apocynins stærke antiinflammatoriske virkning, var den dramatiske undertrykkelse af de nekrotiserende hudlæsioner på de steder, hvor den immuniserende antigen/CFA-formulering blev injiceret .

Siden dets første identifikation som potent antiinflammatorisk middel i 1990 er apocynin blevet en etableret hæmmer af det oxidative burst i neutrofiler som påvist i en lang række in vivo modeller for immunmedierede inflammatoriske lidelser, der påvirker perifere og centrale organer. Af særlig betydning for denne gennemgang er de lovende kliniske virkninger, der er observeret i modeller af neurodegenerative sygdomme, herunder ALS, Alzheimers og Parkinsons sygdom. I disse modeller er den antioxidative aktivitet af apocynin ikke rettet mod neutrofile, men mod “hjernens makrofager”, dvs. mikroglia.

4. Mikroglia

Hjernen indeholder forskellige celletyper med kapacitet til at udøve immunfunktioner, herunder astrocytter, mikrogliaceller og makrofager, der er placeret i hjernehinderne og perivaskulære rum i hjernearterier og kapillærer . Til deres immunopgaver er disse celler udstyret med bevarede receptorer for patogen-associerede eller skades-associerede molekylære mønstre, som videresender aktiveringssignaler til cellerne med henblik på at inducere inflammatoriske effektormekanismer .

Mikroglia er medfødte immunceller, der er allestedsnærværende fordelt i centralnervesystemet, hvor de indgår i tætte interaktioner med neuroner, oligodendrocytter og astrocytter. Det er imidlertid kun mikroglia, der frigiver MPO efter stimulering, hvilket er en forudsætning for den metaboliske aktivering af apocynin.

Mikroglia i det raske CNS har en forgrenet hvilende fænotype. I modsætning til tidligere opfattelser er mikroglia i den sunde hjerne ikke i hvile, men er meget dynamiske celler, der udfører homeostatisk overvågning af det ekstracellulære miljø ved at udvide og trække deres fremspring tilbage og ved at fagocytose vævsrester, som ellers kunne forårsage inflammation . Aktiverede mikroglia findes i sygt CNS-væv, f.eks. i demyeliniserede læsioner af den grå kortikale substans i MS-hjernen, omkring amyloide plaques i Alzheimer-hjernen og i den degenererende substantia nigra i Parkinsons sygdom . Selv om de forskellige udtryksprofiler for mikroglia synes at afspejle et bredt, kontinuerligt spektrum af aktiveringstilstande, kan der genkendes to aktiveringstilstande i begge ender af spektret svarende til M1- og M2-tilstanden, der betegnes for makrofager . “Klassisk aktiverede” M1-mikroglia, f.eks. induceret af LPS eller IFNγ, har proinflammatoriske funktioner, som udøves ved sekretion af proinflammatoriske cytokiner såsom TNF-α, IL-1β og IL-12 og toksiske stoffer såsom reaktive oxygen- og nitrogenarter . “Alternativt aktiverede” M2-mikroglia, som f.eks. induceres i et miljø med høje IL-4- eller IL-13-niveauer, har antiinflammatoriske og vævsregenerative aktiviteter, som formidles af cytokiner som IL-4, IL-10 eller TGF-β og reparationsfaktorer som insulinlignende vækstfaktor, arginase-1 eller chitinase-like-1. Ikke kun cytokinmiljøet, men også redoxtilstanden i mikromiljøet, som er direkte relateret til NADPH-oxidaseaktiviteten, er afgørende for den funktionelle differentiering af mikroglia mod en M1- eller M2-fænotype .

5. Apocynin som en potentiel behandling af neurodegenerativ sygdom

M1-mikrogliaceller er den vigtigste ressource af Nox2 i hjernen. M1-mikrogliacellernes ekspression af aktiveret Nox2, der producerer ROS, er en væsentlig komponent i mikroglia-medieret neurotoksicitet. Den bredt accepterede opfattelse, at ROS fra mikroglia er vigtige mediatorer af neurodegenerative hjerneskader, rejser spørgsmålet om, hvorvidt apocynins gunstige farmakologiske profil og lave toksicitet kan anvendes til neuroprotektive behandlinger. Mikrogliaceller udtrykker ikke kun Nox2, men udskiller også MPO efter aktivering og kunne således potentielt udøve metabolisk aktivering af apocynin. Flere forfattere har rapporteret om den gavnlige virkning af apocynin på (modeller af) akutte neurologiske lidelser, såsom iskæmi, intracerebral blødning og slagtilfælde (gennemgået i ). Hvilke perspektiver er der for apocynin i kroniske neurodegenerative lidelser?

In vitro-undersøgelser med dyrkede mikroglia har impliceret Nox2-afledte ROS i proliferation og funktionel polarisering af mikroglia . Et afgørende resultat har været, at inhibering af Nox2 fremmer alternativ og antiinflammatorisk mikroglia-aktivering under neuroinflammation . Dette indebærer, at undertrykkelse af Nox2 med apocynin kan genoprette en sund balance mellem en proinflammatorisk M1- og en antiinflammatorisk/proregenerativ M2-fænotype af mikroglia. Andre har vist, at apocynin sænker produktionen af IL-1β, TNF-α og nitrogenoxid fra mikroglia og dermed afbryder en selvforstærkende cyklus af skadelig aktivitet. Selv om den nøjagtige neurotoksiske mekanisme for aktiverede mikroglia i neurodegenerative sygdomme stadig er usikker, er det også af stor interesse, at frigivelsen af excitotoxinet glutamat kræver Nox2-aktivitet, og at denne kan hæmmes af apocynin . Samlet set tyder disse data på en potentielt gavnlig rolle for apocynin i neurodegenerative sygdomme. Der er faktisk blevet observeret lovende virkninger af apocynin i musemodeller af nogle vigtige neurodegenerative sygdomme.

Amyotrofisk lateralsklerose (ALS, Lou Gehrig-sygdommen). Amyotrofisk lateralsklerose er en almindelig neurodegenerativ sygdom, der opstår hos voksne og påvirker motoriske neuroner. Sygdommen fører til hurtigt fremadskridende motorisk svækkelse og død normalt inden for 5 år. Mens årsagen til sygdommen hos de fleste patienter er ukendt, har sygdommen i en del af tilfældene en genetisk årsag, nemlig mutationer i superoxiddismutase-1 (SOD1)-genet . Mutationen øger det oxidative stress ved en dysreguleret produktion af superoxidanioner på grund af nedsat dismutation til H2O2. Muterede astrocytter, der udtrykker SOD1, er forbundet med ALS-patologi på grund af deres nedsatte evne til at absorbere glutamat og/eller ved deres frigivelse af neurotoksiske faktorer . Selektivt at lukke mutant SOD1 eller erstatte mutantmikroglia med wild-type mikroglia i mutant SOD1-musemodellen peger stærkt på en central patogen rolle for mikroglia. Harraz et al. har anvendt oral apocynin til at kontrollere progressionen af neurodegeneration i en SOD1 mutant musemodel og observerede lovende virkninger; det blev observeret, at administration af apocynin i drikkevandet forlængede overlevelsen betydeligt og forsinkede udbruddet af motoriske defekter. Denne undersøgelse viser, at apocynin, der administreres oralt, kan opbygge en tilstrækkelig høj koncentration i CNS-parenkymet til at afbøde neurotoksiske niveauer af ROS-produktion. Disse lovende data kunne imidlertid ikke reproduceres i en anden undersøgelse med den samme muterede musestamme .

Alzheimer Disease (AD). Alzheimers sygdom er en aldersbetinget progressiv neurologisk lidelse, der fører til irreversibel demens. Neuropatologiske kendetegn ved AD er senile plaques af misfoldede og fibrillære amyloid-β-aggregater og intraneuronale tangles af tau-protein i hjernebarken . Aktiverede mikrogliaceller blev fundet i klynger omkring senile plaques, der producerer neurotoksiske stoffer som ROS, NO og TNF-α. Aktivering af mikroglia Nox2 ved oligomerisk og/eller fibrillær amyloid-β og ekspression af aktiveret Nox2 i Alzheimer-hjernen er blevet rapporteret.

Lull et al. har testet apocynin i en daglig oral dosis på 10 mg/kg via drikkevandet i en hAPP transgene musemodel af AD . De observerede hos apocynin-behandlede mus en signifikant reduktion af plakstørrelsen i cortex og hippocampus og en reduktion af antallet af mikroglia i cortex, men ikke i hippocampus. Et adfærdsmæssigt træk ved AD, der blev observeret i denne musemodel, nemlig præstationen i Morris water maze swim-testen, som tester den rumlige hukommelse, der er organiseret i hippocampus, blev imidlertid ikke markant forbedret af behandlingen. Den begrænsede kliniske effekt af apocynin i modellen kan skyldes fraværet af tydelig neuroinflammation, mens denne er mere fremtrædende hos AD-patienter, og fordi plakdannelse ikke nødvendigvis forudsiger kognitiv tilbagegang.

Parkinsons sygdom (PD). Det patologiske kendetegn ved PD er en progressiv degeneration af dopaminproducerende neuroner i substantia nigra (SN), en pigmenteret struktur, der er placeret i bunden af mellemhjernen. Via frigivelse af dopamin har SN en central rolle i koordineringen af forskellige neurologiske funktioner, herunder belønning, afhængighed og bevægelse. Sidstnævnte funktion er særlig forstyrret i forbindelse med PD. For at kompensere for tabet af dopamin gives en metabolisk stabil forløber for dopamin (L-DOPA), hvilket hos et betydeligt antal patienter forårsager typiske ufrivillige bevægelser, der er kendt som hyperkinetisk syndrom. Mens man hos langt de fleste (sporadiske) PD-patienter ikke kender årsagen til sygdommen, har man hos en lille del fundet en genetisk årsag, nemlig mutationer i flere gener, herunder alfa-synuclein, parkin, leucin-rig gentagelseskinase 2, PTEN-induceret putativ kinase 1 og ATP13A2 . Observationen af, at brugere af heroin, der var forurenet med MPTP, udviklede symptomer på PD, gjorde det muligt at skabe en klinisk relevant dyremodel for PD. Efter omdannelse af MPTP til MPP+ ved hjælp af monoaminoxidase B i astrocytter koncentreres MPP+ i dopaminerge celler via optagelse gennem den specifikke dopamintransportør, hvor det blokerer kompleks I i den mitokondrielle respiratoriske kæde. Den deraf følgende redoxstress forårsager bl.a. en dysregulering af cellulær Ca2+, hvilket fører til celledød. Ligesom i ALS og AD er neurodegeneration i PD fundet at være forbundet med mikroglia Nox2-aktivering, som menes at bidrage væsentligt til den patogene proces .

Gao et al. viste ved hjælp af et in vitro-system, at ROS genereret af mikroglia Nox2 øger følsomheden af dopaminerge neuroner over for MPP+ . En gavnlig virkning af apocynin på neurotoksiske virkninger formidlet af mikroglia er blevet vist i en musemodel af PD .

6. Virkningen af apocynin i en ikke-menneskelig primat Parkinsons sygdomsmodel

Repetitiv injektion af en lav dosis MPTP i almindelige marmosets, en lille kropslig neotropisk primat, fremkalder en neurologisk sygdom, der på det kliniske og neuropatologiske præsentationsniveau nærmer sig PD . Vi har brugt denne MPTP-model hos 5 marmoset-tvillinger til at teste, om oral apocynin også er effektivt hos en højere art . Til oral indgift blev apocynin opløst i arabisk tyggegummi; den ene søskende af hver tvilling fik apocyninholdigt tyggegummi og den anden fik kun tyggegummi. Behandlingen med apocynin (100 mg/kg, TID) begyndte en uge før PD-induktion med MPTP (1 mg/kg, via subkutan injektion i 8 dage). Apocynin begrænsede det typiske vægttab, der er forbundet med parkinsonsyndromet. Også den motoriske funktion hos de apocyninbehandlede aber blev forbedret, hvilket tyder på en antiparkinsonvirkning af apocynin. Desuden blev antallet af overlevende dopaminneuroner forøget af apocynin, hvilket tyder på en neuroprotektiv virkning. Det er bemærkelsesværdigt, at apocynin har en lignende molekylær struktur som homovanillinsyre (HVA), en metabolit af dopamin. En forklaring på apocynins beskyttende virkning ved PD kan også være relateret til kompensationen af det reducerede niveau af den naturligt tilgængelige o-methoxycatechol HVA.

7. Perspektiver for behandling af menneskelige patienter

Apocynin er et potentielt attraktivt oralt prodrug på grund af dets lave generelle toksicitet og det faktum, at dets specifikke antioxidantvirkning fremkaldes efter metabolisk aktivering af MPO-frigivende fagocytiske celler. Sikkerhedsdata for apocynin er sparsomme, men de tilgængelige data viser lav toksicitet og høj stabilitet (delvis gennemgået i ). LD50 efter oral dosering i mus er blevet anslået til 9 g/kg. Hos rotter blev ca. 80 % af intraperitonealt injiceret apocynin på 120 mg/kg genvundet i uændret form i en urinprøve, der blev indsamlet 20 timer senere. En intravenøs dosis på 420 mg/kg apocynin hos mus forårsagede minimale tegn på toksicitet.

Så vidt vides er apocynin ikke blevet testet på patienter med neurodegenerative sygdomme hos mennesker. Peters et al. har imidlertid evalueret det terapeutiske potentiale af inhaleret apocynin på ozoninduceret bronchial hyperresponsivitet over for methacholin hos astmatiske patienter som en model for inflammatorisk lungesygdom . Forfatterne kunne udelukke, at apocynin kunne fange ozon og konkluderede, at effekten var en afbødning af ROS-produktion fra PMN’er og eosinofile, der havde infiltreret lungen ved ozoneksponering.

De musestudier, der er omtalt i denne gennemgang, viser, at lave doser apocynin, der indgives via den orale vej, når CNS-parenkymet i en tilstrækkelig koncentration til at hæmme microglia oxidative burst og hæmme neurodegeneration. I betragtning af den meget lave systemiske toksicitet og apocynins meget specifikke virkemåde ville det være et attraktivt perspektiv at afprøve den terapeutiske værdi i neurodegenerative sygdomme hos mennesker.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.

Anerkendelse

Forfatterne vil gerne takke Henk van Westbroek (BPRC) for udarbejdelse af illustrationerne.