Aporfinalkaloider fra Ocotea macrophylla (Lauraceae)
ARTIGO
Aporfinalkaloider fra Ocotea macrophylla (Lauraceae)
Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colombia. AA 14490
ABSTRACT
Fire aporfinalkaloider fra træet fra Ocotea macrophylla (Lauraceae) blev isoleret og karakteriseret som (S)-3-methoxy-nordomesticin (1), (S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-3-methoxy-nordomesticin (2), (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticin (3) og (S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticin (4); alkaloiderne 2-4 er rapporteret for første gang. De isolerede forbindelsers struktur blev bestemt på grundlag af deres spektraldata og ved sammenligning af deres spektraldata med værdier beskrevet i litteraturen. Alkaloidfraktionen og forbindelse 1 viste antisvampeaktivitet mod Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici og også forbindelse 1 viste antimikrobiel aktivitet mod Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis samt.
Nøgleord: Ocotea macrophylla; aporfinalkaloider; Lauraceae.
INTRODUKTION
Ocotea-slægten (Lauraceae) omfatter mere end 350 arter, der findes på det amerikanske kontinent og i det sydlige Afrika.1,2 I Colombia findes der 35 Ocotea-arter fordelt over hele landet, hovedsagelig i Andesskove.3 I traditionel medicin har nogle Ocotea-arter vist forskellige anvendelser. O. quixos anvendes som desinfektionsmiddel, lokalbedøvelse og antidiarrémiddel.4 O. lancifolia anvendes som antiparasitært middel, og O. caparrapi anvendes til behandling af insektbid, slangebid, bronkitis og kræftsvulster.5,6
Kemisk set er Ocotea-slægten hovedsagelig kendt som en kilde til metabolitter af typen furofuran7 og tetrahydrofuran lignaner,8 bicyclooctan9 og benzofuran neolignaner,10 og benzylisoquinolin11 og aporfinalkaloider.5 I tidligere undersøgelser blev fire aporfinalkaloider fra træ af Ocotea macrophylla isoleret og identificeret som nantenin, glaucin, isocorydin og dehydronantenin.12,13 I denne artikel beskriver vi isolering og strukturel bestemmelse af tre nye aporfinalkaloider 2-4 ud over (S)- 3-methoxy-nordomesticin 1 og rapporterne om antibakterielle og svampedræbende aktiviteter af forbindelserne.
RESULTAT OG DISKUSSION
Det ethanoliske ekstrakt fra stammen af O. macrophylla blev underkastet en syre-baseekstraktion for at opnå en alkaloidfraktion, der yderligere blev underkastet fraktionering og rensning ved kromatografiske metoder, hvilket førte til isolering af fire alkaloider: (S)-3-methoxy-nordomesticin (1), (S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticin (2), (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticin (3) og (S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticin (4). Strukturerne af alkaloiderne 1-4 er vist i figur 1 og spektroskopiske data i tabel 1.
Signalet ved δH 6,30 (1H, s) viste ingen konnektivitet i HMQC-eksperimentet, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en phenolisk OH-gruppe, hvilket understøttes af IR. Analyse af HMBC-spektret gjorde det muligt at lokalisere substituenterne i henhold til de observerede korrelationer mellem signalerne ved δH 5,94 og 5,95 (for methylendioxygruppen) med signalerne ved δC 145,9 (C-9) og 146.2 (C-10) og disse to sidste signaler med protonerne ved henholdsvis δH 6,70 (H-8) og 7,90 (H-11), hvilket tyder på tilstedeværelsen af en methylendioxygruppe ved positionerne 9 og 10 og to hydrogener på den aromatiske ring i para-orientering. Tilstedeværelsen af hydroxylgruppen i position 1 blev bestemt ved hjælp af korrelationer mellem signalerne ved δH 6,30 og δC 116,5, som er tildelt C-11b. Placeringen af methoxylgrupperne i positionerne C-2 og C-3, blev tildelt i henhold til korrelationen mellem hydrogenerne ved δH 3,96 og 3,86 med kulstofferne ved henholdsvis δC 138,4 (C-2) og δC 147,8 (C-3).
Den absolutte konfiguration af C-6a blev tildelt som S, fordi den har en negativ Cotton-effekt ved 280 nm og en positiv Cotton-effekt ved 240 nm i CD-kurven.17 Derudover blev dette bekræftet af den positive værdi af den optiske rotation 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Derfor blev alkaloid 1 bestemt som (S)-3-methoxy-nordomesticin, et aporfinalkaloid, der tidligere er rapporteret fra Nectandra sinuata19 , der også tilhører Lauraceae-familien. Denne rapport korrigerer og supplerer spektroskopiske data for denne forbindelse.
Alkaloid 2 blev opnået som en gul olie, der giver en positiv reaktion på Dragendorff-reagens, og dens optiske rotationsværdi var 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). UV- og IR-spektret af 2 svarede til 1, bortset fra forekomsten i begge spektrer af absorptioner, der skyldes en carbamatgruppe ved henholdsvis 282 nm og 1688 cm-1.20 1H- og 13C-NMR-spektret viste en lignende profil som 1. I 1H-NMR fremkom to nye signaler ved δH 4,29 (2H, m) og 1,29 (3H, m), samt forskydning af signalet H-5, som skyldes tilstedeværelsen af en deprotekterende gruppe i nærheden. COSY-eksperimentet viste korrelation mellem signalerne δH 4,29 og 1,29, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en ethylgruppe, der på grund af sin forskydning tyder på at være knyttet til et heteroatom. 13C NMR- og DEPT-spektret viste tre nye signaler ved δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) og 14,8 (CH3), som er typiske signaler for en ethoxycarbonylgruppe, der er knyttet til et nitrogenatom. Den absolutte konfiguration af C-6a blev bestemt som S, fordi den viste de samme bomuldseffekter som 1. Derfor blev alkaloidforbindelsen 2 identificeret som (S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticin. Dens ESIMS-spektrum gav et pseudomolekylært ion-top ved m/z 414+ svarende til molekylformlen C22H22NO7, og fragmenteringerne skyldtes tab af CH3OH og CH3CH2OH ved henholdsvis m/z 382+ og m/z 368+. ESI-spektret i negativ ionmodus viste toppe ved m/z 412 – og m/z 383 ., hvoraf den sidste er udtryk for tab af en ethylgruppe. Denne type alkaloider med substituenterne N-ethoxycarbonyl er blevet isoleret fra Lindera angustifolia (Lauraceae).21
Alkaloid 3, blev opnået som en gul olie, med en optisk rotationsværdi på 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). IR-spektret lignede det samme som for alkaloid 1 og 2. Derudover blev der observeret tilstedeværelse af absorptioner ved 2830, 2700 og 1739 cm-1, som er karakteristiske for formylgruppen. I HRESIMS negativ tilstand blev der observeret den pseudomolekylære ion – ved m/z 369.1133, svarende til molekylformlen C20H20NO6. Den negative iontilstand i ESI-MS-spektre viste tabet af en formylgruppe ved m/z 339 … NMR-profilen lignede alkaloiderne 1 og 2. I 1H NMR optrådte forskellige signaler, der tilhørte en blanding af to isomerer i forholdet 3:1. Sammenligningen af den største isomer med alkaloid 1 i NMR viste det samme mønster af substitution af den aromatiske ring, ud over fremkomsten af to nye signaler ved δH 8,25 (1H, s) i 1H og ved δC 161,9 i 13C af formylgruppen til 3. Denne funktionalitet på nitrogen førte til dannelse af rotationsisomerer, som tidligere er beskrevet for alkaloider med en N-formyl- og N-acetylgruppe.22 Den absolutte konfiguration blev bestemt som S på samme måde som for 1 og 2. Derfor blev denne alkaloid 3 identificeret som (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticin.
Alkaloid 4 blev opnået som et hvidt fast stof med et smeltepunkt på 222-223 ºC (MeOH), og med en optisk rotation på 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). Analysen af NMR-data for 4 viste, at den har det samme basiske skelet som 2, men at den har en methylester ifølge signalerne ved δH 3,76 (3H, s) og δC 52,6 for 4 i stedet for signalerne for ethylgruppen i 2. HRESIMS viste en pseudomolekylær ion – ved m/z 398,1233 svarende til molekylformlen C22H22NO7. Derfor blev alkaloidet 4 identificeret som (S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticin.
Den antifungale aktivitet blev evalueret ved hjælp af diskdiffusionsmetoden mod Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 en fytopatogen svamp, der påvirker tomatafgrøder og forårsager store tab for landmænd. Den alkaloidfraktion var aktiv mod F. oxysporum ved 250 μg/μL. Den hæmmende aktivitet mod svampenes vækst var moderat ved 5 μg/μL for (S)-3-methoxy-nordomesticin 1, mens de andre alkaloider var ineffektive, hvilket tyder på, at tilstedeværelsen af elektrontiltrækkende substituenter på nitrogenatomet nedsætter den svampehæmmende aktivitet.
Selv om der kun er få evalueringsrapporter om aporfiners svampedræbende aktivitet, er det blevet konstateret, at disse er aktive mod arter som Candida albicans,24,25 men inaktive mod svampepatogener som Cladosporium herbarium.26 Disse resultater er en ny evalueringsrapport om svampedræbende aktivitet af disse alkaloider, hvor det understreges, at typen af substituenter på nitrogenet i aporfiner har en effekt på den svampedræbende aktivitet, de udviser.
Den antibakterielle aktivitet blev evalueret ved radialdiffusionsmetoden rapporteret af Lerhrer27 mod to Gram (+)-standardstammer: Staphylococcus aureus 6538 og Enterococcus faecalis 29212 og tre Gram (-): Escherichia coli 25922 og Salmonella tiphymurium, stammerne MS7953 og 14028s. Alkaloid 1 (2,5 μg) viste antimikrobiel aktivitet mod de to evaluerede Gram-positive bakterier med værdier på 30 AU som vist i tabel 2.
Det er blevet rapporteret for den racemiske blanding af forbindelsen 3-methoxy-nordomesticin, dens aktivitet mod E. coli (MIC= 256 μg/mL) og S. aureus (MIC= 512 μg/mL),28 men i dette tilfælde er forbindelse 1 ikke aktiv mod E. coli.
Sådan som i den svampedræbende aktivitet viser resultaterne, at arten af substituenten på nitrogen påvirker den antibakterielle aktivitet (tabel 2).
EXPERIMENTAL
Generelle procedurer
Smeltningspunktet blev bestemt ved hjælp af Mel-temp Fisher Johns, Laboratory Device. UV-spektre blev optaget på et Perkin Elmer Lambda 2S og CD-spektre på et JASCO J-720-spektrometer. IR-spektre blev optaget på Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 serie 1000 som en tynd film. Optiske rotationer blev registreret på Schmidt-Haensch polarimeter. 1H- (400 MHz) og 13C- (100 MHz) NMR-spektre samt 2D-spektre (COSY, HMQC og HMBC) blev udført på et Bruker Avance 400 MHz-spektrometer med CDCl3 som intern reference. HRMS blev bestemt på et Shimadzu LCMS-IT-TOF-massespektrometersystem med ESI i positiv iontilstand og negativ iontilstand. Kolonnekromatografi (CC) blev udført med silicagel (70-230 og 230-400 mesh, Merck), og analytisk kromatografi blev udført med silicagel 60 PF254 (0,25 mm).
Plantmateriale
Stammerne af O. macrophylla blev indsamlet i juli 2006 fra Nocaima, Colombia, af W. Delgado. Det botaniske eksemplar blev identificeret af A. Jara, og et belægseksemplar (COL-517191) og blev deponeret i Colombian National Herbarium of the National University of Colombia, Bogotá, Colombia.
Ekstraktion og isolering
Tørrede og drevne stængler (2,0 kg) af Ocotea macrophylla blev ekstraheret med EtOH ved maceration ved stuetemperatur og koncentreret i vakuum for at opnå et ekstrakt (102,6 g). En prøve (48,9 g) af dette ekstrakt blev opløst i vand ved hjælp af ultralyd og syrnet med 5% HCl til pH 2,0. Den sure suspension blev derefter filtreret og basificeret med 20% NaOH til pH 8,0 og efterfølgende ekstraheret med chloroform. Chloroformfraktionen (3,01 g) blev underkastet kolonnekromatografi med silicagel og elueret med en gradient af petroleumsether:AcOiPr (4:6 til 0:10) og AcOiPr:MeOH (10:0 til 0:10), hvorved der fremkom fire fraktioner (I-IV). Fraktion I (347 mg) blev kromatograferet gentagne gange ved kolonne (CC) på silicagel og elueret med n-hexan:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3 og Tol:AcOiPr 7:3. Herved fremkom alkaloiderne 1 (7 mg) og 2 (4 mg). Fraktion II (250 mg) blev underkastet kolonnekromatografi på silicagel og elueret med CHCl3:AcOEt (85:15), hvorefter den blev underkastet CC på Sephadex LH-20 (CH3OH) for at give alkaloid 3 (8 mg). Fraktion IV (1433 mg) blev oprenset ved gentagen kolonnekromatografi på silicagel med CH2Cl2:MeOH 97:3 og CH2Cl2 som elueringssystemer. Endelig gav successive vaskninger med MeOH alkaloid 4 (98 mg).
Antifungal assay
F. oxysporum blev indhentet fra kultursamlingen på universitetet i Cundinamarca (Department of Agronomy, Laboratory of Phytopathology). PDA blev anvendt som medium til svampedannende aktivitetsundersøgelser. Kulturmediet blev inokuleret med 100 μL af en opløsning med 105 sporer. Prøverne blev fremstillet i opløsninger af forskellige koncentrationer, svarende til 50, 25 og 10 μg/μL af alkaloidfraktionen og 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 og 0,1 μg/μL af de rene alkaloider. Ti mikroliter af prøverne blev påført på filterpapirskiverne og anbragt på det inokulerede medium. Pladerne blev forseglet og efterladt i en inkubator i 3 dage ved 25 °C. De tydelige zoner, der opstod mod en voksende svamp, viste den minimale mængde fraktion eller alkaloid, der var nødvendig for at hæmme svampens vækst. Der blev foretaget tre gentagelser for hver behandling. Benomyl (benzimidazol – 5 μg) blev anvendt som positiv kontrol, og acetone fungerede som negativ kontrol.23
Antibakterielle analyser
Den antibakterielle aktivitet blev evalueret ved hjælp af radialdiffusionsmetode tilpasset den metode, der tidligere er offentliggjort af Lehrer.27 Forbindelserne blev evalueret mod to Gram (+)-stammer: Staphylococcus aureus ATCC 6538 og Streptococcus fecalis ATCC 29212 og tre Gram (-)-stammer: Escherichia coli ATCC 25922 og Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s og Salmonella tiphymurium MS7953. En koloni isoleret fra hver stamme blev anbragt i 3 mL soja-trypticase (TSB) for Gram (+)-stammer og Luria-bouillon (LB) for Gram (-)-stammer og blev inkuberet ved 37 °C under omrøring, indtil mikroorganismerne var i den logaritmiske fase. Supernatanten blev fjernet, og det opnåede sediment blev re-suspenderet i fosfatbuffer (PBS), hvorefter der blev skyllet med PBS og centrifugeret. Til sidst blev sedimentet sat op igen i PBS, og den optiske tæthed blev bestemt ved 620 nm for at beregne antallet af CFU (colony forming units) pr. milliliter. Der spredes et bestemt volumen, som indeholder 4 x 107 CFU i hver skål. Den målte mængde blev blandet og homogeniseret i 15 mL agarose, der blev smeltet til mere eller mindre 45 °C. Denne bakteriesuspension blev serveret i petriskåle og efterladt til at størkne ved stuetemperatur, hvorefter der blev lavet huller med en diameter på 2 mm med et sterilt stempel.
Testprøverne blev fremstillet ved at opløse 1 mg af den rene forbindelse i 500 μL DMSO, som er placeret 8 μL af prøven i to eksemplarer og inkuberet ved 37 °C i 30 min. Efter denne tid blev næringsmediet tilsat, som indeholder smeltet agar agar og TSB, inkuberet i 18 timer ved 37 ºC, hvorefter diameteren af hæmningszonerne blev målt ved hjælp af forbindelsens aktivitet. De anvendte positive kontroller var forskellige antibiotika, Ampicillin (50 mg/mL), Kanamycin (10 mg/mL) og Tetracyclin (4,12 mg/mL) i en fortynding 1:100 i PBS, og som negative kontroller blev anvendt DMSO og PBS, hver kontrol 8 μL til hver brønd. Hæmningszonernes diametre blev målt i millimeter, og resultaterne blev rapporteret som aktivitetsenheder i henhold til forholdet, der fastsætter, at 1 Unit of Action (UA) er lig med 0,1 mm af hæmningszonen.
SUPPLEMENTÆRMATERIALE
TEKNOLOGI
Forfatterne vil gerne takke National University of Colombia for den økonomiske støtte til dette projekt. Ligeledes takkes laboratoriet for kernemagnetisk resonans og massespektrometri-laboratoriet for deres støtte i forbindelse med optagelsen af henholdsvis NMR-spektrene og HR-ESI-MS. Desuden vil forfatterne gerne takke Javeriana University for de optiske rotationer, FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) for optagelsen af CD-spektre og især Prof. J. M. Lozano for analyser af antibakteriel aktivitet.
1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.
2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.
4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.
5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.
6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.
7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.
8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.
9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.
10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.
11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.
12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.
13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.
14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.
15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.
16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.
17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.
18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.
19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.
20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.
21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.
22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.
23. Gomez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Biol. Trop. 2007, 55, 767.
24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Phytochemistry 2001, 57, 421.
25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.
26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Phytotherapy 2000, 71, 527.
27. Lerhrer R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Metoder. 1991, 137, 167.
28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Pharm. Bull. 2009, 57,
Modtaget 26/6/09; accepteret 6/11/09; offentliggjort på nettet 10/3/10
* email: [email protected]
SUPPLEMENTÆRT MATERIALE
