Auxotrofi
GenetikRediger
I genetik, en stamme siges at være auxotrof, hvis den bærer en mutation, der gør den ude af stand til at syntetisere en essentiel forbindelse. F.eks. er en gærmutant med et inaktiveret gen for uracilsyntesevejen en uracil-auxotrof (hvis f.eks. gærens gen for Orotidin-5′-phosphat-decarboxylase er inaktiveret, er den resulterende stamme en uracil-auxotrof). En sådan stamme er ude af stand til at syntetisere uracil og vil kun kunne vokse, hvis uracil kan optages fra omgivelserne. Dette er det modsatte af en uracilprototrof, eller i dette tilfælde en wildtypestamme, som stadig kan vokse i mangel af uracil. Auxotrofe genetiske markører anvendes ofte inden for molekylærgenetik; de blev som bekendt anvendt i Beadle og Tatums Nobelprisvindende arbejde om hypotesen om ét gen – ét enzym, der forbinder mutationer af gener med proteinmutationer. Dette giver mulighed for at kortlægge biosyntetiske eller biokemiske veje, som kan hjælpe med at bestemme, hvilket eller hvilke enzymer der er muteret eller dysfunktionelle i de auxotrofe bakteriestammer, der undersøges.
Forskere har brugt stammer af E. coli, der er auxotrofe for specifikke aminosyrer, til at indføre ikke-naturlige aminosyreanaloger i proteiner. F.eks. kan celler, der er auxotrofe for aminosyren phenylalanin, dyrkes i medier, der er suppleret med en analog, f.eks. para-azido phenylalanin.
Mange levende væsener, herunder mennesker, er auxotrofe for store klasser af forbindelser, der er nødvendige for vækst, og må skaffe sig disse forbindelser gennem kosten (se vitamin, essentielt næringsstof, essentiel aminosyre, essentiel fedtsyre).
Det komplekse udviklingsmønster for vitamin auxotrofi på tværs af det eukaryote livstræ er intimt forbundet med den indbyrdes afhængighed mellem organismer.
Mutagenicitetstest (eller Ames-test)Edit
Salmonella-mutagenese-test (Ames-test) anvender flere stammer af Salmonella typhimurium, der er auxotrofe over for histidin, til at teste, om et givet kemikalie kan forårsage mutationer ved at observere dets auxotrofe egenskab som reaktion på en tilsat kemisk forbindelse. Den mutation, som et kemisk stof eller en kemisk forbindelse forårsager, måles ved at anvende det på bakterierne på en plade, der indeholder histidin, og derefter flytte bakterierne til en ny plade uden tilstrækkeligt histidin til fortsat vækst. Hvis stoffet ikke muterer bakteriernes genom fra at være auxotrofisk til histidin tilbage til at være prototrofisk til histidin, vil bakterierne ikke vise vækst på den nye plade. Ved at sammenligne forholdet mellem bakterierne på den nye plade og den gamle plade og det samme forhold for kontrolgruppen er det altså muligt at kvantificere, hvor mutagent et stof er, eller rettere sagt, hvor sandsynligt det er, at det forårsager mutationer i DNA. Et kemikalie anses for at være positivt for Ames-testen, hvis det forårsager mutationer, der øger den observerede reversionshastighed, og negativt, hvis det giver lignende resultater som i kontrolgruppen. Der forventes et normalt, men lille antal revertante kolonier, når en auxotrof bakterie udplantes på et medie uden den metabolit, den har brug for, fordi den kan mutere tilbage til prototrofi. Chancen for dette er lille og medfører derfor, at der dannes meget små kolonier. Hvis der derimod tilsættes et mutagent stof, vil antallet af revertanter være synligt højere end uden det mutagene stof. Ames-testen anses grundlæggende for at være positiv, hvis et stof øger chancen for mutation i bakteriernes DNA tilstrækkeligt til at forårsage en kvantificerbar forskel i antallet af revertanter på den mutagene plade og kontrolgruppepladen. En negativ Ames-test betyder, at det mulige mutagen ikke forårsagede en stigning i antallet af revertanter, og en positiv Ames-test betyder, at det mulige mutagen øgede chancen for mutation. Disse mutagene virkninger på bakterier undersøges som en mulig indikator for de samme virkninger på større organismer, som f.eks. mennesker. Det antages, at hvis der kan opstå en mutation i bakterie-DNA under tilstedeværelsen af et mutagen, vil den samme virkning kunne forekomme i større organismer og forårsage kræft. Et negativt resultat af Ames-testen kunne tyde på, at stoffet ikke er et mutagent stof og ikke vil forårsage tumordannelse i levende organismer. Kun få af de positive Ames-testresultater blev imidlertid anset for at være ubetydelige, når de blev testet i større organismer, men den positive Ames-test for bakterier kunne stadig ikke entydigt kædes sammen med kræftudbrud i større organismer. Selv om det kan være en mulig determinant for tumorer for levende organismer, mennesker, dyr osv. skal der gennemføres flere undersøgelser for at nå frem til en konklusion.
Auxotrofi-baserede metoder til at inkorporere unaturlige aminosyrer i proteiner og proteomerRediger
Et stort antal unaturlige aminosyrer, som ligner deres kanoniske modstykker i form, størrelse og kemiske egenskaber, indføres i de rekombinante proteiner ved hjælp af auxotrofiske ekspressionsværter. F.eks. kan methionin (Met) eller tryptofan (Trp) auxotrofe Escherichia coli-stammer dyrkes i et defineret minimalt medium. I denne forsøgsopstilling er det muligt at udtrykke rekombinante proteiner, hvis kanoniske Trp- og Met-rester er fuldstændigt substitueret med forskellige mediumsupplerede beslægtede analoger. Denne metodologi fører til en ny form for proteinteknik, som ikke udføres ved kodonmanipulation på DNA-niveau (f.eks. oligonukleotid-ledet mutagenese), men ved kodonomlægninger på niveauet for proteinoversættelse under effektivt selektivt pres. Derfor kaldes metoden for selektiv trykinkorporering (SPI).
Ingen af de hidtil undersøgte organismer koder for andre aminosyrer end de 20 kanoniske; to yderligere kanoniske aminosyrer (selenocystein og pyrrolysin) indsættes i proteiner ved at omkode translationstermineringssignaler. Denne grænse kan overskrides ved adaptiv laboratorieevolution af metabolisk stabile auxotrofe mikrobielle stammer. For eksempel blev det første klart vellykkede forsøg på at udvikle Escherichia coli, der kan overleve udelukkende på den unaturlige aminosyre thienopyrrolyl) alanin som den eneste erstatning for tryptofan, gjort i 2015.