Beta-Galactosidase Assay (A bedre Miller)

tilbage til protokoller

Baggrund

β-Galactosidase er kodet af lacZ-genet i lac-operonet i E. coli. Det er et stort (120 kDa, 1024 aminosyrer) protein, der danner en tetramer. Enzymets funktion i cellen er at spalte laktose til glukose og galaktose, så de kan anvendes som kulstof-/energikilder. Den syntetiske forbindelse o-nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG) genkendes også som et substrat og spaltes for at give galactose og o-nitrophenol, som har en gul farve. Når ONPG er i overskud i forhold til enzymet i en reaktion, er produktionen af o-nitrophenol pr. tidsenhed proportional med koncentrationen af β-galactosidase; produktionen af gul farve kan således bruges til at bestemme enzymkoncentrationen.

Så, hvorfor bekymrer det os? Normalt er eksperimenterne udformet således, at β-Galactosidase-koncentrationen i cellen er en aflæsning for et eller andet aspekt af et system, der undersøges. F.eks. kan en forsker fuse en promotor til lacZ-genet og bruge β-Gal-niveauerne som en aflæsning af promotoraktivitet under forskellige betingelser. I 1972 udgav Jeffrey Miller “Experiments in Molecular Genetics”, som indeholdt en protokol til bestemmelse af mængden af β-Gal med ONPG. På grund af dette kaldes ONPG/β-Gal-assays for “Miller”-assays, og en standardiseret mængde β-Gal-aktivitet er en “Miller-enhed”.

1 Miller-enhed = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1,75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

hvor:

• Abs420 er absorbansen af den gule o-nitrophenol,
• Abs550 er spredningen fra celleaffald, som, når den multipliceres med 1.75 tilnærmer sig den observerede spredning ved 420 nm,
• t = reaktionstid i minutter,
• v = volumen af den analyserede kultur i milliliter,
• Abs600† afspejler celletætheden.

†Bemærk, at denne værdi er forskellig for hvert anvendt spektrofotometer og bør kalibreres ved udpladning af fortyndinger af kendte Abs600-kulturer for at bestemme de kolonidannende enheder pr. Abs600.

I sin bog har dr. Miller forklarer, at denne formel giver ca. 1 Miller-enhed for uinduceret E. coli (lav β-Gal-produktion) og ca. 1000 enheder for en fuldt induceret kultur (dyrket på laktose eller IPTG).

I min erfaring har kulturer af MG1655 induceret med 1 mM IPTG i logfase 1500-1800 Miller-enheder. Årsagen til forskellen kendes ikke, men jeg formoder, at den skyldes forskelle i Abs600/celletæthed mellem Dr. Millers spektrofotometer og det, jeg bruger, samt det faktum, at jeg udfører mine Miller-assays ved 30 °C (for nemheds skyld), mens Dr. Miller udførte sine assays ved 28 °C. Jeg har lavet promotorfusioner, der genererer ~40.000 Miller-enheder; men som det vil blive diskuteret nedenfor, er dette for højt for assayet, og derfor blev protokollen ændret for at sænke denne værdi.

Protokol

Den protokol, jeg bruger, er afledt af en artikel af Zhang og Bremer (JBC 270, 1995, Free full text!), hvor den oprindelige Miller-protokol blev kraftigt forenklet for at gøre det muligt at måle flere prøver med mindre manipulation.

Kort sagt består protokollen i at måle celletætheden af en bakteriekultur (Abs600), derefter at fjerne en alikvot del af cellerne fra kuvetten og blande dem med en “permeabiliserings”-opløsning, der indeholder detergent, som opløser cellemembranerne (men efterlader β-Gal intakt). Dette dræber cellerne og stopper translationen. Efter inkubationen tilsættes en ONPG-“substrat”-opløsning, og den gule farve får lov til at udvikle sig. Derefter tilsættes en “stop”-opløsning, og absorbansen af o-nitrophenol måles.

1. Dyrk kulturer under de betingelser, du ønsker at teste.
2. Under væksten afmåles 80 μL alikvater af permeabiliseringsopløsningen på forhånd i 1.5 mL mikrofuge-rør og luk dem.
3. Måler Abs600 og OPTAG DET!
4. Tag en 20 μL alikvot af kulturen ud og tilsæt den til de 80 μL permeabiliseringsopløsning.

Proven er nu stabil i flere timer. Dette giver mulighed for at udføre tidsforløbseksperimenter.

1. Når den sidste prøve er taget, flyttes prøverne og substratopløsningen til det 30 °C varme rum i 20-30 minutter.
2. Tilføj 600 μL substratopløsning til hvert rør, og NOTER TIDSPUNKTET FOR TILFØJNINGEN.
3. Når der er udviklet tilstrækkelig farve, tilsættes 700 μL stopopløsning, blandes godt, og STOPTIDEN NOTERES.
4. Når den sidste prøve er stoppet (nogle kan tage længere tid end andre, men generelt er de færdige på 30-90 minutter), overføres rørene til en mikrofuge og centrifugeres i 5-10 minutter ved fuld hastighed.
5. Fjern forsigtigt rørene fra centrifugen, og overfør opløsningen fra toppen af rørene til din(e) kuvette(r). Du forsøger at undgå at have partikulært materiale i kuvetten, så spredning ikke vil påvirke aflæsningen.
6. Optag Abs420. Denne skal være mindre end 1 og større end 0,05. Hvis den ligger lidt uden for dette område, skal du ikke svede over det.

Beregn Miller-enhederne som:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{{ af udtaget kulturprøve})*(\text{volumen } )*(\text{reaktionstid}))} }

Kommentarer til assayet

• Reshma 11:28, 15. oktober 2007 (CDT): Miller anbefaler en kultur med OD600 = 0,28 til 0,70. Han hævder dog, at overnatningskulturer også kan bruges, men at eksponentielt voksende celler giver mere præcise assays .

• Hvornår er reaktionen udført? Jeg har aldrig fundet et godt svar på dette i litteraturen. Hvis jeg lod en reaktion gå til ende, målte jeg en Abs420 på ~2-3. Dette er naturligvis uden for spektrofotometerets pålidelige område, men det giver en indikation af, hvor langt reaktionen kan gå. Jeg fik reproducerbare data, når den gule farve lige var detekterbar før tilsætning af stopopløsningen op til ca. farven på LB-bouillon før stop. Husk, at du skal bruge substratet til at mætte enzymet i løbet af reaktionen, så lad dem ikke gå for langt. Jeg foretager rutinemæssigt tre separate målinger for hver kultur og tager et gennemsnit af dem.
  • Reshma 11:28, 15. oktober 2007 (CDT): Miller anbefaler, at OD420nm-aflæsningen ideelt set skal være 0,6-0,9 .

• Ofte bruger folk engangsplastkuvetter til at måle både kulturens turbiditet og den gule o-nitropenol. Det er min erfaring, at engangskuvetterne har en HORRIKELIG optik: ja, de er klare, men lysvejen er patetisk forvrænget (se bare gennem en af dem på et fjernt objekt). Dette er ikke noget stort problem, hvis den samme kuvette anvendes til blindprøven og prøven, og den er orienteret på samme måde i spektrofotometeret. Problemet opstår, når der måles mange forskellige prøver i forskellige kuvetter. Værdierne kan variere STORT, selv for den samme kultur målt i forskellige kuvetter. Jeg anbefaler, at man enten bruger en glas- eller kvartskuvette af høj kvalitet eller måler prøverne i en pladelæser med fladbundede 96 brøndplader. Jeg har fundet ud af, at min fejl ved pipettering af 150 μL kultur til Abs600-målinger var MEGET mindre end ved brug af engangskuvetter. Selvfølgelig skal den målte turbiditet kalibreres til celler/mL som med en 1 cm cuvette.

• Ved at dreje prøverne og forsigtigt fjerne en prøve fra supernatanten undgår du at skulle måle spredningen ved 550nm og gætte, hvad den ville være ved 420nm.

• Hvis din reaktion har for meget β-Gal, vil røret blive gult i løbet af et par minutter (eller endda sekunder). Dette er for hurtigt. Et af de største bidrag til fejl vil være dit skøn over reaktionstiden. Ved at have reaktionsbetingelserne indstillet, så det tager ca. en time, bliver tidsfejlene ubetydelige. Hvis du har brug for at bremse reaktionen, kan du bruge færre celler og øge mængden af permeabiliseringsbuffer, så volumenet stadig er 100 μL. Alternativt kan du omkonstruere det ribosombindende sted i dit β-Gal-konstrukt for at svække det. Jeg fandt ud af, at hvis mine celler lavede 40.000 Miller-enheder af β-Gal, blev de meget syge af translationsstresset. Det var i dette tilfælde bedre at svække translationen af β-Gal mRNA’et.
  • Jeg laver disse reaktioner ligesom jeg laver enzymkinetik. Jeg starter prøverne med 10 sek. mellemrum (med tiden tæller op), så det er muligt at få præcise reaktionstider, selv om man kun lader reaktionerne køre i et par minutter. Jeg får meget reproducerbare resultater med reaktionstider på 1,5-30 min. Når du først har fået en fornemmelse af, hvor lang tid dine reaktioner vil tage, er det let at gruppere prøver, der skal have samme reaktionstid. Hvis du laver hver prøve i tre eksemplarer, får du en vis sikkerhed for, at din timing er reproducerbar.–Kathleen 16:43, 14. december 2005 (EST)

• Her er et eksempel på nogle faktiske data, jeg har fået ved hjælp af dette assay. Det var et tidsforløbsforsøg. På hvert tidspunkt fjernede jeg 1 mL fra hver af mine kulturer, målte OD600, tog tre alikvater på 20 µL direkte fra kuvetten og tilsatte hver til 80 µL permeabiliseringsopløsning. Jeg udførte analysen nøjagtigt som beskrevet ovenfor, og alle prøverne blev opbevaret ved stuetemperatur, indtil tidsforløbet var afsluttet. OD600 for disse kulturer varierede fra 0,4 til 4 (i min spec) i løbet af dette forsøg, og reaktionstiderne for β-Gal-assaysene varierede fra 2-25 min. De tre individuelle β-Gal-assays for hvert tidspunkt for hver kultur (røde eller sorte symboler) er plottet i grafen for at illustrere reproducerbarheden af assayet inden for hvert forsøg.Kathleen

Recepter

Permeabiliseringsopløsning

Du skal bruge 80 μL pr. prøve.

• 100 mM dibasisk natriumphosphat (Na2HPO4)
  • (Zhang-protokollen har 200 mM natriumphosphat. Jeg kunne aldrig få dette i opløsning sammen med de andre komponenter, uanset hvad jeg prøvede, så jeg trak det tilbage til 100 mM. Jeg har endda brugt 50 mM uden nogen påviselig ændring.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/mL CTAB (hexadecyltrimethylammoniumbromid)
• 0.4 mg/mL natriumdeoxycholat
• 5,4 μL/mL beta-mercaptoethanol

Substratopløsning

Du har brug for 600 μL pr. prøve.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-nitrophenyl-β-D-Galactosid (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-mercaptoethanol

(Zhang-protokollen indeholder også 20 μg/mL CTAB og 10 μg/mL deoxycholat. Jeg udelader disse, idet jeg regner med, at der stadig er rigeligt fra permeabiliseringsopløsningen, og hvis de ikke er døde endnu, bliver de det heller ikke.)

Stopopopløsning

Du skal bruge 700 μL pr. prøve.

• 1 M natriumkarbonat (Na2CO3)

Den høje pH-værdi i stopopløsningen denaturerer β-Gal og fordobler omtrent den gule farve i reaktionen.