Biologiske ure

Den skiftende vekslen mellem dag og nat i jordens cyklus er så pålidelig, at det ikke er overraskende, at dyr, planter og bakterier tilpasser deres adfærd og fysiologi (for en gennemgang, se ref. 1). Cirkadiske rytmer er en allestedsnærværende tilpasning af alle organismer til de mest forudsigelige af miljømæssige udfordringer. En biologisk rytme, der vedvarer under konstante forhold og har en periode på ≈1 dag, kaldes “cirkadisk” (circa, “omkring”; dian, “dag”).

Indtil for ganske nylig har de molekyler, der ligger til grund for svingningen, været ukendte. Forstyrrelser af sådanne svingninger ved hjælp af inhibitorer af RNA- eller proteinsyntese tyder på, at sådanne molekyler er involveret (2).

En tilgang, der har været succesfuld med hensyn til at afdække mekanismer, er brugen af genetiske ændringer. De første og anden urmutanter, der blev opdaget i frugtfluen, Drosophila melanogaster, er periode- og tidløsegener (3-5).

I frugtfluer cykliserer hyppigheden af mRNA- og proteinprodukter af periode- og tidløsegener i ≈24 timer på specifikke steder i fluens hjerne (6). Maki Kaneko et al. talte om disse formodede pacemakerceller i frugtfluehjernen ved at bruge disse molekylære svingninger som en markør (7). I det voksne hoved viste proteinundersøgelser, at per udtrykkes rytmisk på specifikke steder, nemlig de laterale neuroner, der er placeret mellem den centrale hjerne og de optiske lober. Laterale neuroner betragtes som de formodede pacemakerceller for den voksne flues locomoteraktivitetsrytme.

Kaneko et al. (7) viste, at produkterne af per og tim kan påvises i et begrænset antal neuroner i larvehjernen. Ekspressionsmønstrene i flere af disse celler er cykliske. Blandt disse neuroner udtrykker fem lateralt placerede celler. PERIOD (PER) fra det tidlige larvestadie, hvilket tyder på, at de kan være ansvarlige for larvens tidsregistrering af eklosion og locomoteraktivitet. Et andet interessant fund er en klynge af neuroner med cyklisk udtryk af per og tim i modfase til de laterale neuroner. Resultaterne antyder tilstedeværelsen af flere oscillatorer, der er involveret i rytmer af forskellige fysiologiske eller adfærdsmæssige processer i en enkelt organisme. Kaneko et al. (7) beskrev også den anatomiske karakterisering af pacemaker-neuronernes ledningsmønstre ved hjælp af per-promotorafhængig reportergenekspression. En sådan molekylær anatomisk tilgang skulle give en ny indsigt i den funktionelle kortlægning af dette hjernesystem. Desuden bør sammenligningen mellem pattedyr- og flueurceller klarlægge det evolutionære forhold mellem disse systemer.

Den cirkadiske kontrol af transkription giver et indgangspunkt til at analysere de cis-virkende reguleringselementer og trans-virkende faktorer, gennem hvilke uret kan regulere mange ur-kontrollerede genudtryk (6). Disse formodede cis-virkende reguleringselementer, kaldet “time-box” (8), antages at være placeret i promoter- og enhancer-regionen af ur-kontrollerede gener. Desuden kan det ur-kontrollerede responsive element (6) eller time-box regulere de endogene cirkadiane fysiologiske fænomener under konstante forhold. Senest er en mulig kandidat til time-boxen blevet identificeret i promotorregionen for Drosophila-perioden-genet (9). Selv om per er blevet foreslået at formidle mRNA-cirkulation gennem transkriptionel repression, er direkte interaktion mellem per og DNA meget usandsynlig på grund af manglen på et DNA-bindingsdomæne i PER. Hardins gruppe analyserede udførligt promotorregionen af per-genet i undersøgelser med transgene fluer med per-lacZ-fusionsgenetransgener (9). De identificerede en cirkadisk transkriptionel forstærker inden for et 69-bp DNA-fragment indeholdende en E-boks opstrøms for per-genet, som er ansvarlig for nat-aktiveringen af per-genets ekspression. E-boxen er et kendt bindingssted for den basiske helix-loop-helix-klasse af transkriptionsfaktorer.

Den hidtil stærkeste kandidat til en trans-virkende faktor i oscillatoren er Clock, som er klonet ved hjælp af en fremadrettet genetisk strategi (10). Takahashis gruppe (10) isolerede og analyserede locomoteraktivitet af cirkadiske mutantmusestammer. Clock-mutanten udviste en lang periode, der blev arytmisk efter flere dage i konstant mørke. Takahashi og kolleger (10) lykkedes det at klonere det ansvarlige gen og identificerede mutationen i den proteinkodende region af Clock-genet. Interessant nok indeholder Clock-proteinet et protein-proteinbindingsdomæne (PAS), som er placeret i Drosophila per-genet, og et basisk helix-loop-helix-motiv til DNA-binding. Desuden var Takahashi og kolleger (10) i stand til helt at redde den lange periode og arytmiske fænotype hos Clock-mutante mus ved overførsel af det normale Clock-gen.

Ravi Allada et al. beskrev de fælles molekylære komponenter med fokus på Clock, som er ansvarlig for den cirkadiane rytmegenerering hos både fluer og mennesker (11). Allada og hans kolleger (11) screenede kemisk mutageniserede fluer på udkig efter mutanter, der ændrer eller ophæver den cirkadiske rytme i locomoteraktiviteten, og fandt en ny arytmisk mutant, der i første omgang blev kaldt Jrk. Jrk-fluer udtrykker lave niveauer af periode- og tidløse proteiner på grund af reducerede transkriptionsniveauer. Genet blev identificeret og udviser en slående sekvensbevaring med pattedyrenes cirkadiske rytmegen, Clock; Allada et al. (11) omdøbte derfor dette fluegen dClock. Ligesom museklokken indeholder Drosophila-klokken grundlæggende helix-loop-helix- og PAS-domæner samt et transkriptionelt aktiveringsdomæne.

Nyere arbejder fra både pattedyr og fluer tyder på, at CLOCK’s proteinpartnere også er evolutionært bevarede (kaldet BMAL) (12, 13). CLOCK-BMAL-dimmere blev vist at binde til promotorregionen af periode- og tidløse gener og at transaktivere begge gener i fluer. Endvidere undertrykker PERIOD-TIMELESS (PER-TIM)-udtryk CLOCK-BMAL-medieret reporterinduktion. Der er således blevet foreslået en negativ feedback-model (Fig. 1).

I pattedyr anses SCN i hypothalamus for at være en vigtig pacemaker for cirkadiske rytmefænomener, hvilket er påvist af mange anatomiske og fysiologiske undersøgelser (14). For nylig blev der rapporteret om tre homologe af Drosophila period-genet i mus og menneske (15). På trods af eksistensen af tre pattedyrs periodehomologer, der viser mRNA-cirkadisk svingning i den suprachiasmatiske kerne i musens hjerne, er der ikke blevet rapporteret om nogen funktionel implikation af cirkadisk locomoteradfærd.

For at afklare, om pattedyrs per-homologen kan være involveret i den cirkadiske rytme af locomoteradfærd hos pattedyr, har Ishida’s gruppe klonet en rotte-per-homolog og har lavet arytmiske SCN-lesionerede rotter for at overvåge cirkadiske rytmer i perifere væv (16).

For at undersøge, om rytmisk ekspression af rotte PERIOD 2 (RPER2) mRNA observeres i andre væv end SCN, blev der udført Northern Blot-analyse på væv fra øje, hjerne, hjerte, lunge milt, lever og nyrer. Interessant nok viste alle de testede væv en rytmisk ekspression af RPER2 mRNA, selv om nat/dag-forholdet var forskelligt i hvert væv. RPER2 opfører sig som en pattedyrs homolog til Drosophila period-genet (16), fordi dets cirkadiske ekspression var høj om natten i en lang række væv, ligesom period er det i Drosophila.

Da SCN betragtes som en pacemaker for det cirkadiske ur hos pattedyr, testede Ishida’s gruppe (16), om cirkadisk ekspression af RPER2 mRNA i flere væv påvirkes af en SCN-læsion. Overraskende nok blev den rytmiske karakter af den multiple vævsudtryk af RPER2 fuldstændig ophævet af SCN-læsionen. Ekspressionen af RPER2 i flere væv er derfor under kontrol af SCN. Dette er den første rapport, der viser, at den cirkadiske rytme i flere væv styres af et hjerneur fra pattedyr, nemlig SCN i hypothalamus. Dataene tyder også på, at en pattedyrs per homolog (RPER2) kan være involveret i den cirkadiske rytme af locomoteradfærd hos pattedyr, fordi tab af cirkadisk ekspression af RPER2 mRNA i hele kroppen opstod, når den cirkadiske locomoteraktivitet hos rotter blev tabt. For at klarlægge et sådant problem skal vi lave transgene dyr med en loss-of-function- eller gain-of-function-mutation i RPER2-genet. Det forhold, at den rytmiske ekspression af RPER2 mRNA i flere væv er fuldstændig afhængig af SCN, tyder på, at der er behov for nogle signaler for at opretholde hele kroppens rytme på en koordineret måde (fig. 2). En SCN-transplantationsundersøgelse tyder også på betydningen af humorale faktorer fra SCN (17). Sådanne humorale faktorer fra SCN kan være vigtige for at generere den cirkadiske rytmiske ekspression af RPER2-genet i perifere væv. Det ser således ud til, som det er tilfældet i udviklingsbiologien, at nøglemolekyler i dette biologiske ur er velkonserverede mellem fluer og pattedyr. Den fælles molekylære urmekanisme fra bakterier (18) til mennesker kan måske blive en realitet i den nærmeste fremtid.