BiomedicalReports

Introduktion

Hepatocellulært karcinom (HCC) er en primær tumor i hepatocytter og udgør 80 % af alle primære leverkræftformer. På verdensplan er HCC den fjerde hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald (1).Patienter med kroniske leversygdomme i forbindelse med hepatitis B-virus- eller hepatitis C-virusinfektioner udvikler ofte HCC (2). Der er sket en forbedring af de kirurgiske teknikker og udvikling af flere ikke-kirurgiske behandlingsmetoder, men forbedringerne for HCC-patienters ekstremt dårlige prognose er fortsat begrænsede (3).

Den omfattende undersøgelse af apoptose, også kendt som programmeret celledød, i de seneste årtier har fremhævet denne proces som en egnet metode til kræftbehandling (4,5). Mange lægemidler med apoptotiske virkninger er dog i øjeblikket begrænset til kræftbehandling på grund af bivirkninger. Det er derfor vigtigt at identificere nye og pålidelige terapeutiske midler, der effektivt kan fremkalde apoptose af kræftceller til behandling af patienter med HCC.

For nylig har traditionel kinesisk medicin spillet en vigtig rolle i behandlingen af maligne tumorer på grund af dens betydeligt forbedrede virkninger og lavere bivirkninger (6). Gecko, en af de populære traditionelle kinesiske lægemidler, er blevet anvendt som et råstof til behandling af maligne tumorer i den kliniske praksis (7-9). Gecko råpeptider og gecko ethanolekstrakt kan inducere apoptose i humaneHCC-celler og udøve antitumoraktivitet i ascites H22-bærende mus, hvilket blev påvist i vores tidligere undersøgelser (10,11). Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge den apoptotiske virkning og den underliggende mekanisme af gecko-peptidblanding (GPM) i humane levercarcinom HepG2-cellinjer in vitro.

Materialer og metoder

Medicinske materialer og reagenser

Gecko japonicus blev købt fra BozhouYonggang Medicinal Herbs Factory Co., Ltd. (Anhui, Kina). Den menneskelige HCC-cellinje HepG2 blev præsenteret af Medical Science Research Institute of Henan (Henan, Kina).

Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT)og Hoechst 33258 blev købt fra Sigma (St. Louis, NATO, USA).Caspase Activity Assay-kittet blev købt fra BeyotimeInstitute of Biotechnology (Beijing, Kina). Det primære antistof mod apoptoseinducerende faktor (AIF) blev købt fra BosterInc. (Wuhan, Hubei, Kina), og β-actin-antistoffet blev købt fra Proteintech (Wuhan, Hubei, Kina). Det primære antistof mod cytochrom c (Cyt c) og det sekundære antistof konjugeret til mus eller kanin blev købt fra Zhongshan GoldenBridge Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, Kina).

Mikropladelæseren var et produkt fra BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, USA). BX41-fluorescensmikroskopet og det omvendte mikroskop var et produkt af Olympus (Tokyo, Japan).

Fremstilling af GPM

Geckopulver (100 g) blev blandet med 400 mldobbelt destilleret vand og gjort til et homogenat. Efter centrifugering ved 5 600 × g i 5 minutter blev udfældningen opsamlet og lagt i blød i 400 ml 55% ethanolopløsning. Efter centrifugering ved 5 600 × g i 5 min. blev overnatanten fremstillet og inddampet under reduceret tryk ved 55 °C. Derefter blev gule pulvere opsamlet efter frysetørring af restvæsken. Gelfiltrationskromatografi (SephadexG-25) blev anvendt til at rense de gule pulvere, og i sidste ende blev GPM opsamlet.

Cellekultur og morfologisk observation

HepG2-celler blev dyrket i Dulbecco’s modificeretEagle’s medium suppleret med 10% føtal bovin serum, 100 U/mlpenicillin og streptomycin ved 37°C i et befugtet 5%CO2-inkuberingsanlæg. Kulturmediet blev udskiftet hver anden dag, og cellerne i den logaritmiske vækstfase blev anvendt til de følgende eksperimenter. HepG2-celler (3,0 × 104 celler/ml) blev inkuberet med forskellige koncentrationer af GPM i 24 timer. Cellerne blev observeret, og billederne blev optaget med et inverteret fasekontrastmikroskop for at påvise de morfologiske ændringer.

MTT-assay

HepG2-celler blev udsået i en 96-hulsplade med en tæthed på 6,0×103 celler/hul. Forskellige koncentrationer af GPM og 0,003 mg/ml fluorouracil (5-Fu) blev tilsat til hver brønd.Efter inkubation i henholdsvis 20, 44 og 68 timer blev der tilsat 20 µl af MTT-reagenset (5 mg/l) pr. brønd, som blev inkuberet i yderligere 4 timer. Supernatanten blev erstattet med 200 µl dimethylsulfoxid, og absorbansen (A) ved 490 nm blev målt med en ELX800 Universal Microplate Reader. Hæmningsgraden for celleproliferation (IR) var som følger: IR = (1-AGPM/Kontrol) ×100%.

Hoechst 33258-farvning

Efter dyrkning natten over i en 6-hulsplade blevHepG2-cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af GPM (0,0,06 eller 0.08 mg/ml) og 0,003 mg/ml 5-Fu i frisk kulturmedium ved 37 °C i 24 timer. Cellerne blev vasket to gange med fosfat-bufferedsaline (PBS) og farvet med Hoechst 33258 farvningsopløsning (10 µg/ml). Efter 15 minutters inkubation i mørke blev cellerne vasket to gange med koldt PBS og blev undersøgt med fluorescensmikroskop.

Caspaseaktivitetsanalyse

Bestemmelse af caspase-3- og caspase-9-aktivitet blev udført med caspaseaktivitetsassay-kittet efter producentens protokol. Efter eksponering for forskellige koncentrationer af GPM (0, 0,06 eller 0,08 mg/ml) og 0,003 mg/ml 5-Fu i 24 timer blev cellerne høstet og resuspenderet i lysisbuffer. Derefter blev cellerne inkuberet i lysisbufferen i 20 minutter og blev centrifugeret ved 16 000 × g ved 4 °C i 3 minutter. Supernatanterne blev opsamlet, og proteinniveauerne blev bestemt ved Bradford-metoden, og caspase-3- og caspase-9-aktiviteterne blev målt ved hjælp af reaktionsbuffer (indeholdende dithiothreitol) og caspase-substratpeptiderne Ac-DEVD-pNA og Ac-LEHD-pNA, henholdsvis. De opnåedeværdier ved optisk tæthed ved 405 nm blev udtrykt som:AGPM/AC-kontrol.

Western blot-analyse

HepG2-celler blev behandlet med henholdsvis GPM (0, 0,06 eller 0,08 mg/ml) og 0,003 mg/ml 5-Fu i 24 timer. Kort fortalt blev cellerne behandlet med lysisbuffer på is i 30 min. og blev centrifugeret ved 13.000 × g i 30 min. ved 4°C. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-metoden. Proteinerne blev separeret ved 12 % SDS-PAGE og blev overført til PVDF-membran.PVDF-membranen blev blokeret med 5 % fedtfri tørmælk i PBS i 1 time ved 37 °C, vasket 3 gange med Tris-buffered saline indeholdende 0,1 % Tween-20 (TBST) i 15 minutter og blev efterfulgt af inkubation med de primære antistoffer: Caspase-3 (kat.nr. sc-7148; 1:200, polyklonalt kanin-anti-human), caspase-9 (kat.nr. sc-8355; 1:200, polyklonalt kanin-anti-human), Cyt c (kat.nr. sc-8355; 1:200, polyklonalt kanin-anti-human), Cyt c (kat.nr. sc-13156; 1:500, monoklonal mus anti-human), AIF (kat. nr. PB0388; 1:200, polyklonal kanin anti-human) og β-actin (kat. nr. 66009-1-Ig; 1:5 000, monoklonal mus anti-human) natten over ved 4°C.Derefter blev prøverne vasket med TBST i 30 minutter, og membranen blev inkuberet med de tilsvarende sekundære antistoffer i 1 time. Kemiluminescens blev påvist med ECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology).

Statistisk analyse

De eksperimentelle data er repræsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Forskellene mellem grupperne blev undersøgt ved hjælp af envejs variansanalyse med SPSS 19.0-systemet (IBM Corp., Armonk, NY, USA). P<0,05 blev anset for at indikere en statistisk signifikant forskel.

Resultater

GPM hæmmer proliferationen af HepG2-celler

GPM’s virkning på HepG2-cellevækst blev vurderet ved MTT-assayet. Resultaterne viste, at GPM hæmmer HepG2-cellernes proliferation signifikant på en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 1). Efter behandling med GPM i 24, 48 eller 72 timer var værdierne forIC50 henholdsvis 0,154, 0,133 og 0,051 mg/ml.Cellerne behandlet med GPM udviste afrundet morfologi, krympning og tab af vedhæftning (Fig. 2).

Effekter af GPM på kernearmorfologi

Cellernes apoptotiske morfologi blev identificeret ved Heechst 33258-farvning. Som vist i fig. 3 blev morfologiske ændringer i apoptotiske karakteristika, såsom kernekondensering, kromosomkondensering og granulære apoptotiske organer i GPM-behandlede celler også observeret ved fluorescensmikroskopi.

Virkninger af GPM på caspaseaktivitet

Som initiativtagere og eksekutorer af celledød spiller cysteinproteaser en vigtig rolle i den apoptotiske proces(12). Som vist i fig. 4 forårsagede GPM-behandling en betydelig dosisafhængig stigning i caspase-3- og caspase-9-aktivitet,hvilket tyder på en apoptotisk virkning af GPM i HepG2-celler.

Virkninger af GPM på ekspressionsniveauer af apoptotiske proteiner

Som vist i fig. 5 viste western blotting, at frigivelsen af Cyt c ogAIF fra mitokondrierne til cytosol steg, mens ekspressionsniveauerne af caspase-3 og caspase-9 blev opreguleret af GPM-behandling på en dosisafhængig måde. Ændringerne i proteinerne var signifikant forskellige sammenlignet med kontrolgruppen (Fig. 6)(P<0,05).

Diskussion

I løbet af de seneste årtier er forekomsten af kræft steget markant, hvilket forårsager alvorlig skade på menneskers sundhed(13). Selv om de aktuelle terapeutiske strategier har vist tydelige kræftbekæmpende egenskaber, er alvorlige bivirkninger fortsat uundgåelige. Søgningen efter nye kræftmidler, der er mere effektive, men mindre giftige, har tiltrukket sig stadig større opmærksomhed (14).Udvinding af peptider fra naturmedicin til kræftbehandling har været genstand for omfattende rapporter på verdensplan og er lovende i forbindelse med kræftbehandling. Peptider kan spille en rolle på forskellige måder, f.eks. ved at hæmme proliferation af tumorer, standse cellecyklus, undertrykke tumorangiogenese og fremkalde apoptose (15). Gecko har været meget anvendt inden for traditionel kinesisk medicin i hundredvis af år. I vores tidligere undersøgelser viste de rå gecko-peptider en effektiv antitumoraktivitet på H22-bærende mus og HepG2-cellinjen (16,17), men virkningerne af GPM på humane hepatocytter mangler stadig at blive belyst. Derfor var formålet med den foreliggende undersøgelse at yderligere afsløre den underliggende molekylære mekanisme, hvorved GPM inducererapoptose i den humane HCC-cellinje HepG2.

I den foreliggende undersøgelse afslørede MTT-assayet, atGPM kunne hæmme væksten af HepG2-celler på en dosis- og tidsafhængig måde. Yderligere eksperimenter viste, at denne hæmning skyldtes GPM-behandling, som inducerede dosisafhængig celledød med typiske morfologiske ændringer. Disse data tyder på, at GPM kan være et potentielt effektivt middel til kræftbehandling.Ved hjælp af Hoechst 33258-farvning blev det påvist, at den celledød, der induceres af GPM i HepG2-celler, som hører til apoptose, for caspase-3- og caspase-9-ekspressionsniveauerne blev forøget efter GPM-behandling. Western blotting-analyse viste også, atGPM kunne stimulere frigivelsen af Cyt c og AIF fra demitokondrier til cytosolen, hvilket tyder på, at GPM-induceretapoptose i HepG2-celler formidles af den mitokondrielle apoptosevej.

Apoptose er den vigtigste kontrolmekanisme, hvormedceller dør under mange forhold, såsom ukorrekt reparation afDNA-skader (18). Denne selvdestruktive cellulære proces er afgørende for organudvikling, vævsomdannelse, immunregulering og flere sygdomstilstande (19). Mange tumormidler udøver deres terapeutiske virkninger ved at fremkalde apoptose (20-24). Mitokondrier spiller en væsentlig rolle i reguleringen af celleapoptose, og der er visse proteiner, som er tæt forbundet med celleapoptose i intermembranen (25).

Den mitokondrielle ultrastruktur er normal under celleapoptose, men dens funktion er væsentligt ændret.Mitokondriel dysfunktion inducerer åbning af de mitokondrielle permeabilitetsovergangsporer og frigiver mitokondrielle apoptogene proteiner, såsom AIF (26) og Cyt c (27). Normalt er AIF- og Cyt c-proteinerne placeret i mitokondriernes intermembranrum, mens de under påvirkning af forskellige AIF’er frigives fra demitokondrier til cytoplasmaet. AIF overføres til sidst til kernen, hvilket forårsager de karakteristiske ændringer for apoptose. AIF var det første protein, der blev opdaget, som formidlede caspaseuafhængig celledød (28). Cyt c frigives i cytosolen og inducerer caspaseafhængig apoptose, hvilket fører til aktivering af caspaser og apoptose (29,30). AIF kan øge de apoptotiske signaler ved at fremme mitokondriel frigivelse af Cyt c. Selv om den apoptose, der induceres af AIF, ikke er afhængig af caspase, er der en krydsvirkning, synergi og endog antagonisme mellem AIF, caspase og Cyt c. På grund af forskellige dødssignaler og celletyper sker reguleringen af celleapoptose faktisk gennem forskellige interaktioner og hele signalnetværket, hvilket kræver yderligere undersøgelser.

Caspase, en familie af cysteinproteaser, er en integreret del af den apoptotiske vej. Induktion af apoptose er forbundet med aktivering af caspase (31). Caspase-3 er i downstream af cellapoptose, og caspase-9 er den apikale caspase i den ititokondrieinitierede apoptosevej (32). Aktivering af caspase-3 er korreleret med aktivering af caspase-9 (33).Frigivelse af Cyt c udløser aktivering af caspase-9 gennem dannelse af apoptosomet. Efterfølgende aktivering af initiatorcaspase-9 forårsager spaltning af effektorcaspase-3, som efterfølgende aktiverer DNase og forårsager DNA-fragmentering i kernen (34). Sammenfattende er caspase-3 en eksekverende caspase, der kan aktiveres af den følgende mitokondrielle vej, der involverer aktivering af caspase-9 på grund af frigivelse af Cyt c til cytosol (35), hvilket i sidste ende forårsager programmeret celledød.

Sammenfattende inducerede GPM muligvis apoptotiskcelledød i HepG2-celler ved at aktivere den mitokondrielle apoptotiske vej. Disse resultater viser, at GPM kan være et potentielt terapeutisk middel til behandling af HCC.

Anerkendelser

Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra Key Programs for Science and Technology Development of HenanProvince (no. 142102310031).

Glossar

Afkortninger

Afkortninger:

GPM	gecko peptides mixture
Cyt c	cytochrom c

		Abrams P og Marsh JW: Aktuel tilgang tilhepatocellulært karcinom. Surg Clin North Am. 90:803-816. 2010.Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	But DY, Lai CL og Yuen MF: Naturalhistory of hepatitis-related hepatocellular carcinoma. World JGastroenterol. 14:1652-1656. 2008. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Faivre S, Bouattour M og Raymond E: Nye molekylære behandlinger af hepatocellulært karcinom. Liver Int.31(Suppl 1): 151-160. 2011. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kang TH, Bang JY, Kim MH, Kang IC, Kim HMog Jeong HJ: Atractylenolid III, et sesquiterpenoid, inducererapoptose i humant lungekarcinom A549-celler viamitokondrier-medieret dødsmekanisme. Food Chem Toxicol. 49:514-519.2011. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liao N, Ao M, Zhang P og Yu L: Extractsof Lycoris aurea induce apoptosis in murine sarcoma S180 cells.Molekyler. 17:3723-3735. 2012. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wang YX, Gu XX, Geng D, Sun HY, Wang CM,Jiang GX, Hou XN og Ma CH: Differentiering af bel-7402 humanehepatocarcinomceller induceret af vandige ekstrakter af frisk gecko(AG) og dens anti-tumoraktivitet in vivo. J Ethnopharmacol.155:1583–1588. 2014. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Song P: Wang XM og Xie S: Eksperimentel undersøgelse af mekanismer af lyofiliseret pulver af frisk gekko Chinenisin, der hæmmer H22 hepatocarcinom angiogenese. Zhongguo Zhong XiYi XiYi Jie He Za Zhi. 26:58-62. 2006.(På kinesisk). PubMed/NCBI
	Yang JX og Wang XM: Fremskridt undersøgelse og forskning om behandling af tumor af gekko. Chinese Journal of Digestion.14:2428-2431. 2006.
	Wu BD: Behandling af 105 tilfælde af esophagustumor med sammensat opskrift af Gecko. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Za Zhi.19:5021999.(På kinesisk).
	Song Y, Wang JG, Li RF, Li Y, Cui ZC, DuanLX og Lu F: Gecko rå peptider inducerer apoptose i humane levercarcinomceller in vitro og udøver antitumoraktivitet i en musascites H22 xenograftmodel. J Biomed Biotechnol. 2012:7435732012.Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Cui CC: Forskning af antitumorvirkning afGecko ethanolekstrakt II. Henan University of Science andTechnology. 2013.(På kinesisk).
	Jiang CP, Ding H, Shi DH, Wang YR, Li EGog Wu JH: Pro-apoptotiske virkninger af tectorigenin på humanthepatocellulært karcinom HepG2-celler. World J Gastroenterol.18:1753-1764. 2012. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Olefson S og Moss SF: Obesity and relatedrisk factors in gastric cardia adenocarcinoma. Gastric Cancer.18:23-32. 2015. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wang N, Tan HY, Li L, Yuen MF og Feng Y:Berberine and Coptidis Rhizoma as potential anticanceragents: Nylige opdateringer og fremtidige perspektiver. J Ethnopharmacol.176:35-48. 2015. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Costantino VV, Lobos-Gonzalez L, Ibañez J,Fernandez D, Cuello-Carrión FD, Valenzuela MA, Barbieri MA, SeminoSN, SeminoSN, Jahn GA, Quest AF og Lopez LA: Dehydroleucodin hæmmer tumorvækst i en præklinisk melanommodel ved at fremkalde cellecyklusarrest, senescens og apoptose. Cancer Lett. 372:10-23. 2016.Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Xu XL, Wang JG, Li RF, Li SP, Qiu XJ ogDuan LX: Inhiberende virkning af Gecko-peptidblanding på vækst af den menneskelige esophageale squamøse karcinomcellelinje EC109-celler. ZhongguoLin Chuang Yao Li Li Xue Za Zhi. 29:602-604. 2013.
	Song Y, Wang JG, Cui CC, Qian X, Li RF,Duan LX, Liu L og Xi SM: Apoptotic mechanism of gecko crudepeptides on human liver carcinoma cell line HepG2. Zhong Yao Cai.35:863-866. 2012.(På kinesisk). PubMed/NCBI
	Lowe SW og Lin AW: Apoptosis in cancer.Carcinogenesis. 21:485-495. 2000. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Bhatia D, Mandal A, Nevo E og Bishayee A:Apoptoseinducerende virkninger af ekstrakter fra ørkenplanter i HepG2human hepatocarcinomceller. Asian Pac J Trop Biomed. 5:87-92.2015. Se artikel : Google Scholar
	Li CJ, Huang SY, Wu MY, Chen YC, Tsang SF,Chyuan JH og Hsu HY: Induction of apoptosis by ethanolic extractof Corchorus olitorius leaf in human hepatocellulærcarcinoma (HepG2) cells via a mitochondria-dependent pathway.Molecules. 17:9348-9360. 2012. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yang B, Wang YQ, Cheng RB, Chen JL, ChenJ, ChenJ, Jia LT og Zhang RS: Induktion af cytotoksicitet og apoptose i den menneskelige mavekræftcelle SGC-7901 af isovaltrat acetoxyhydrinisoleret fra Patrinia heterophylla bunge involverer en mitokondrialvej og G2/M-fasens cellecyklusarrest. Asian Pac J Cancer Prev.14:6481-6486. 2013. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kim TM, Shin SK, Kim TW, Youm SY, Kim DJog Ahn B: Elm tree bark extract inhibits HepG2 hepatic cancer cellgrowth via pro-apoptotic activity. J Vet Sci. 13:7-13. 2012.Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Nho KJ, Chun JM og Kim HK: Ethanolekstrakt af Dianthus chinensis L. inducerer apoptose i humant hepatocellulært karcinom HepG2-celler in vitro. Evid BasedComplement Alternat Med. 2012:5735272012. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li L, Chen GG, Lu YN, Liu Y, Wu KF, GongXL, Gou ZP, Li MY og Liang NC:Ent-11α-Hydroxy-15-oxo-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid hæmmer vækst af menneskelig lungekræft A549-celler ved at standse cellecyklus og udløseapoptose. Chin J Cancer Res. 24:109-115. 2012. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Cao MR, Li Q, Liu ZL, Liu HH, Wang W, LiaoXL, Pan YL og Jiang JW: Harmine inducerer apoptose i HepG2-celler via mitokondriel signalvej. Hepatobiliary Pancreat DisInt. 10:599-604. 2011. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I,Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, LoefflerM, et al: Molekylær karakterisering af mitokondrielapoptoseinducerende faktor. Nature. 397:441-446. 1999. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R andWang X: Induction of apoptotic program in cell-free extracts:Requirement for dATP and cytochrome c. Cell. 86:147-157. 1996.Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Norberg E, Orrenius S og Zhivotovsky B:Mitokondriel regulering af celledød: Behandling afapoptose-inducerende faktor (AIF). Biochem Biophys Res Commun.396:95-100. 2010. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chandra D, Liu JW og Tang DG: Tidligmitokondriel aktivering og cytokrom c opregulering underapoptose. J Biol Chem. 277:50842-50854. 2002. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Zhang P, Xu Y, Li L, Jiang Q, Wang M ogJin L: In vitro beskyttende virkninger af pyrroloquinolinkinon på methylmercury-induceret neurotoksicitet. Environ Toxicol Pharmacol.27:103-110. 2009. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li LK, Rola AS, Kaid FA, Ali AM og AlabsiAM: Goniothalamin inducerer cellecyklusarrest og apoptose i H400human oral squamous cell carcinoma: En caspase-afhængigmitokondriel-medieret vej med nedregulering af NF-κβ. ArchOral Biol. 64:28-38. 2016. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li Y, Hu J, Huang H og He Y: Effect ofJinlong capsule on proliferation and apoptosis of human pancreaticancer cells BxPC-3. J Tradit Chin Med. 33:205-210. 2013.Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Du RH, Cui JT, Wang T, Zhang AH og TanRX: Trichothecin inducerer apoptose af HepG2-celler via caspase-9-medieret aktivering af den mitokondrielle dødsvej. Toxicon.59:143-150. 2012. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kang MH og Reynolds CP: Bcl-2 Inhibitors:targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy. ClinCancer Res. 15:1126-1132. 2009. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Jin Q, Nan JX og Lian LH: antitumoraktivitet af blade fra potentilla discolor på human hepatocellulærcarcinomcellelinje HepG-2. Chin J Nat Med. 9:61-64. 2011.