Bisulfit-sekventering

Bisulfit-sekventering anvender rutinemæssige sekventeringsmetoder på bisulfitbehandlet genomisk DNA for at bestemme methyleringsstatus ved CpG-dinukleotider. Der anvendes også andre ikke-sekventeringsstrategier til at undersøge methyleringen på specifikke loci eller på et genomdækkende niveau. Alle strategier forudsætter, at den bisulfitinducerede omdannelse af umethylerede cytosiner til uracil er fuldstændig, og dette er grundlaget for alle efterfølgende teknikker. Ideelt set skulle den anvendte metode bestemme methyleringsstatus separat for hver allel. Alternative metoder til bisulfit-sekventering omfatter Combined Bisulphite Restriction Analysis og methyleret DNA-immunopræcipitation (MeDIP)

Metodologier til analyse af bisulfitbehandlet DNA udvikles løbende. For at sammenfatte disse metoder, der udvikler sig hurtigt, er der blevet skrevet adskillige oversigtsartikler.

Metoderne kan generelt opdeles i strategier baseret på methyleringsspecifik PCR (MSP) (figur 4) og strategier, der anvender polymerasekædereaktion (PCR) udført under ikke-methyleringsspecifikke betingelser (figur 3). Mikroarray-baserede metoder anvender også PCR baseret på ikke-methyleringsspecifikke betingelser.

Ikke-methyleringsspecifikke PCR-baserede metoderRediger

Figur 3: Metoder til DNA-methyleringsanalyse, der ikke er baseret på methyleringsspecifik PCR. Efter bisulfitkonvertering amplificeres det genomiske DNA med PCR, der ikke skelner mellem methylerede og ikke-methylerede sekvenser. De mange tilgængelige metoder anvendes derefter til at foretage en skelnen baseret på ændringerne i ampliconet som følge af bisulfitkonverteringen.

Direkte sekventeringRediger

Den første rapporterede metode til methyleringsanalyse ved hjælp af bisulfitbehandlet DNA anvendte PCR og standard dideoxynukleotid-DNA-sekventering til direkte bestemmelse af de nukleotider, der er resistente over for bisulfitkonvertering. Primere er designet til at være strengspecifikke såvel som bisulfitspecifikke (dvs. primere, der indeholder ikke-CpG-cytosiner, således at de ikke er komplementære til ikke-bisulfitbehandlet DNA), der flankerer (men ikke involverer) det pågældende methyleringssted. Den vil derfor amplificere både methylerede og umethylerede sekvenser, i modsætning til methyleringsspecifik PCR. Alle steder med umetylerede cytosiner vises som thyminer i den resulterende forstærkede sekvens af sense-strengen og som adeniner i den forstærkede antisense-streng. Ved at inkorporere højtydende sekventeringsadaptorer i PCR-præmmerne kan PCR-produkterne sekventeres med massivt parallel sekventering. Alternativt, og arbejdskrævende, kan PCR-produktet klones og sekventeres. Nested PCR-metoder kan anvendes til at forbedre produktet til sekventering.

Alle efterfølgende DNA-methyleringsanalyseteknikker med bisulfitbehandlet DNA er baseret på denne rapport af Frommer et al. (figur 2). Selv om de fleste andre modaliteter ikke er egentlige sekventeringsbaserede teknikker, anvendes udtrykket “bisulfit-sekventering” ofte til at beskrive bisulfit-konverterede DNA-methyleringsanalyseteknikker generelt.

PyrosequencingEdit

Pyrosequencing er også blevet anvendt til at analysere bisulfitbehandlet DNA uden brug af methyleringsspecifik PCR. Efter PCR-amplifikation af den pågældende region anvendes pyrosequencing til at bestemme den bisulfitkonverterede sekvens af specifikke CpG-steder i regionen. Forholdet mellem C og T på de enkelte steder kan bestemmes kvantitativt på grundlag af mængden af C og T-inkorporering under sekvensforlængelsen. Den største begrænsning ved denne metode er omkostningerne ved teknologien. Pyrosequencing giver dog godt mulighed for udvidelse til screeningsmetoder med højt gennemløb.

En yderligere forbedring af denne teknik blev for nylig beskrevet af Wong et al., som anvender allelspecifikke primere, der inkorporerer enkeltnukleotidpolymorfismer i sekvensen af sekvenseringspræmmeren, hvilket giver mulighed for separat analyse af moderlige og faderlige alleler. Denne teknik er særlig nyttig til analyse af genomisk imprinting.

Methyleringsfølsom enkeltstrengskonformitetsanalyse (MS-SSCA)Edit

Denne metode er baseret på metoden til analyse af enkeltstrengskonformitetspolymorfisme (SSCA), der er udviklet til analyse af enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP). SSCA skelner mellem enkeltstrengede DNA-fragmenter af identisk størrelse, men med forskellig sekvens, på grundlag af differentiel migration i ikke-denaturerende elektroforese. I MS-SSCA anvendes dette til at skelne mellem bisulfitbehandlede, PCR-amplificerede regioner, der indeholder de pågældende CpG-steder. Selv om SSCA mangler følsomhed, når der kun er tale om en enkelt nukleotidforskel, foretager bisulfitbehandling ofte en række C-T-konverteringer i de fleste regioner af interesse, og den resulterende følsomhed nærmer sig 100 %. MS-SSCA giver også en semikvantitativ analyse af graden af DNA-methylering på grundlag af forholdet mellem båndintensiteterne. Denne metode er imidlertid udformet til at vurdere alle CpG-steder som helhed i den pågældende region snarere end individuelle methyleringssteder.

Højopløsende smelteanalyse (HRM)Edit

En anden metode til at skelne konverteret fra ukonverteret bisulfitbehandlet DNA er ved hjælp af højopløsende smelteanalyse (HRM), en kvantitativ PCR-baseret teknik, der oprindeligt var udformet til at skelne SNP’er. PCR-amplikonerne analyseres direkte ved hjælp af temperaturramper og den deraf følgende frigivelse af et interkalerende fluorescerende farvestof under smeltningen. Methyleringsgraden, repræsenteret ved C-to-T-indholdet i ampliconet, bestemmer smeltningens hastighed og den deraf følgende frigivelse af farvestoffet. Denne metode giver mulighed for direkte kvantificering i et enkelt rørassay, men vurderer methyleringen i den amplificerede region som helhed snarere end på specifikke CpG-steder.

Methyleringsfølsom enkeltnukleotidprimerforlængelse (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE anvender den primerforlængelsesmetode, der oprindeligt blev udviklet til analyse af enkeltnukleotidpolymorphismer. DNA bisulfitkonverteres, og bisulfitspecifikke primere annealeres til sekvensen op til det basepar, der ligger umiddelbart før den pågældende CpG. Primeren får lov til at strække sig et basepar ind i C (eller T) ved hjælp af DNA-polymerase-terminerende dideoxynukleotider, og forholdet mellem C og T bestemmes kvantitativt.

Der kan anvendes en række metoder til at bestemme dette C:T-forhold. I begyndelsen var MS-SnuPE afhængig af radioaktive ddNTP’er som reporter for primerforlængelsen. Fluorescensbaserede metoder eller Pyrosequencing kan også anvendes. Der kan imidlertid anvendes matrixassisteret laserdesorptionsionisering/time-of-flight (MALDI-TOF)-massespektrometrianalyse til at skelne mellem de to polymorfe primerforlængelsesprodukter, i det væsentlige baseret på GOOD-assayet, der er designet til SNP-genotypebestemmelse. Ionparret omvendt fase-højtydende væskekromatografi (IP-RP-HPLC) er også blevet anvendt til at skelne mellem primerforlængelsesprodukter.

Basespecifik spaltning/MALDI-TOFEdit

En nyligt beskrevet metode af Ehrich et al. drager yderligere fordel af bisulfitkonverteringer ved at tilføje et basespecifikt spaltningstrin for at forbedre de oplysninger, der opnås fra nukleotidændringerne. Ved først at anvende in vitro-transkription af den pågældende region til RNA (ved at tilføje et RNA-polymerasepromotorsted til PCR-primeren i den indledende amplifikation) kan RNase A anvendes til at kløve RNA-transkriptet på base-specifikke steder. Da RNase A spalter RNA specifikt ved cytosin- og uracil-ribonukleotider, opnås basespecificitet ved at tilføje spaltningsresistent dTTP, når der ønskes cytosin-specifik (C-specifik) spaltning, og ved at inkorporere dCTP, når der ønskes uracil-specifik (U-specifik) spaltning. De spaltede fragmenter kan derefter analyseres ved MALDI-TOF. Bisulfitbehandling resulterer enten i indførelse/fjernelse af spaltningssteder ved C til U-konverteringer eller forskydning i fragmentmasse ved G til A-konverteringer i den amplificerede omvendte streng. C-specifik spaltning skærer specifikt på alle methylerede CpG-steder. Ved at analysere størrelsen af de resulterende fragmenter er det muligt at bestemme det specifikke DNA-methyleringsmønster for CpG-stederne i regionen, snarere end at bestemme omfanget af methyleringen af regionen som helhed. Denne metode har vist sig at være effektiv til screening med højt gennemløb, idet den gør det muligt at undersøge mange CpG-steder i flere væv på en omkostningseffektiv måde.

Methyleringsspecifik PCR (MSP)Edit

Figur 4: Methyleringsspecifik PCR er en følsom metode til diskriminerende amplifikation og påvisning af en methyleret region af interesse ved hjælp af methyleringsspecifikke primere på bisulfitkonverteret genomisk DNA. Sådanne primere annealerer kun til sekvenser, der er methylerede og således indeholder 5-methylcytosiner, som er resistente over for omdannelse med bisulfit. Alternativt kan der anvendes umethylerede specifikke primere.

Denne alternative metode til methyleringsanalyse anvender også bisulfitbehandlet DNA, men undgår behovet for at sekventere det område, der er af interesse. I stedet er primerparrene selv designet til at være “methylerede-specifikke” ved at inkludere sekvenser, der kun komplementerer ukonverterede 5-methylcytosiner, eller omvendt “umethylerede-specifikke”, der komplementerer thyminer, der er konverteret fra umethylerede cytosiner. Methyleringen bestemmes af den specifikke primers evne til at opnå amplifikation. Denne metode er særlig nyttig til undersøgelse af CpG-øer med muligvis høj methyleringstæthed, da et større antal CpG-par i primeren øger analysens specificitet. Ved at placere CpG-parret i 3′-enden af primeren forbedres også følsomheden. I den første rapport om anvendelse af MSP beskrives tilstrækkelig følsomhed til at påvise methylering af 0,1 % af allelerne. Generelt anses MSP og beslægtede protokoller for at være de mest følsomme, når man spørger om methyleringsstatus på et specifikt locus.

MethyLight-metoden er baseret på MSP, men giver en kvantitativ analyse ved hjælp af kvantitativ PCR. Der anvendes methyleringsspecifikke primere, og der anvendes også en methyleringsspecifik fluorescensreportersonde, som annealerer til den amplificerede region. Alternativt kan primerne eller sonden designes uden methyleringsspecificitet, hvis der er behov for diskrimination mellem CpG-parrene i de involverede sekvenser. Kvantificeringen foretages i forhold til et methyleret reference-DNA. En ændring af denne protokol for at øge PCR’ens specificitet for succesfuldt bisulfitkonverteret DNA (ConLight-MSP) anvender en ekstra sonde til bisulfit-ukonverteret DNA for at kvantificere denne uspecifikke amplifikation.

En anden metodologi, der anvender MSP-amplificeret DNA, analyserer produkterne ved hjælp af smeltningskurveanalyse (Mc-MSP). Ved denne metode amplificeres bisulfitkonverteret DNA med både methylerede specifikke og umethylerede specifikke primere, og det kvantitative forhold mellem de to produkter bestemmes ved at sammenligne de differentielle toppe, der genereres i en smeltekurveanalyse. Der er blevet introduceret en smelteanalysemetode med høj opløsning, der anvender både kvantitativ PCR og smelteanalyse, især til følsom påvisning af methylering på lavt niveau

Microarray-baserede metoderRediger

Microarray-baserede metoder er en logisk udvidelse af de teknologier, der er til rådighed til analyse af bisulfitbehandlet DNA, for at muliggøre en genomdækkende analyse af methylering. Oligonukleotidmikroarrays er designet ved hjælp af par af oligonukleotidhybridiseringssonder, der er rettet mod CpG-steder af interesse. Den ene er komplementær til den uændrede methylerede sekvens, og den anden er komplementær til den C-to-U-konverterede umethylerede sekvens. Sonderne er også bisulfit-specifikke for at forhindre binding til DNA, der er ufuldstændigt omdannet af bisulfit. Illumina Methylation Assay er et sådant assay, der anvender bisulfit-sekventeringsteknologien på mikroarray-niveau til at generere genomdækkende methyleringsdata.